Сбалансированные хромосомные перестройки – нарушения кариотипа, которые заключаются в перемещении генетического материала внутри или между хромосомами и не сопровождаются его дисбалансом [1]. Популяционная частота сбалансированных хромосомных аберраций, включая структурные перестройки и мозаичные формы числовых нарушений среди здоровых новорожденных составляет 1,67 на 1000 [5], а среди мужчин с бесплодием достигает 7% [6].
Носительство сбалансированных хромосомных перестроек является доказанным этиологическим фактором врожденных пороков развития (ВПР) плода, привычного невынашивания беременности (НБ) и бесплодия [8]. Причиной данных нарушений считают хромосомный дисбаланс, который в процессе гаметогенеза проявляется высокой частотой аномальных гамет и эмбрионов.
Традиционной тактикой предотвращения рождения ребенка с пороками развития у пар, в которых один из супругов является носителем сбалансированной хромосомной перестройки, является инвазивная пренатальная диагностика кариотипа плода. Однако существенными недостатками такого подхода являются этические проблемы, связанные с медицинским прерыванием беременности во II триместре при выявлении хромосомных аномалий плода, связанный с этим риск осложнений у беременных женщин, а также неизбежно возникающий при этом тяжелый психологический стресс.
В последнее десятилетие для селективного переноса эмбрионов (ПЭ) со сбалансированным кариотипом и снижения риска прерывания беременности у данной группы пациенток стала применяться предимплантационная генетическая диагностика (ПГД) – совокупность методов выявления генных и геномных мутаций на предимплантационной стадии культивируемых in vitro эмбрионов с целью селекции и ПЭ женщинам без генной патологии [10]. Однако несмотря на принципиально новые исследовательские возможности метода и более чем десятилетний опыт ПГД эмбрионов, полученных от носителей хромосомных перестроек, многие фундаментальные и прикладные аспекты проблемы нарушений репродукции у пациенток с данной патологией остаются малоизученными.
К первой группе вопросов относятся вклад хромосомного дисбаланса в нарушения гаметогенеза; факторы, определяющие групповую и индивидуальную вариабельность процессов гаметогенеза у носителей сбалансированных хромосомных перестроек. Требуют уточнения прикладные вопросы о вкладе хромосомных нарушений в этиологическую структуру факторов бесплодия и НБ, связи исхода беременности и метода ее наступления, влиянии ПГД на вероятность НБ у фертильных супружеских пар с носительством хромосомных перестроек.
К сожалению, отечественный опыт ПГД в связи с носительством хромосомных перестроек пока не позволяет ответить на эти вопросы. Наше исследование является одной из наиболее крупных российских работ, посвященных данной проблеме. Целью ее явилась оценка риска ранних репродуктивных потерь при различных методах оплодотворения у супружеских пар, при которых один из супругов являлся носителем сбалансированной хромосомной перестройки.
Материали методы исследования
В исследование были включены 109 пар, в которых у одного из супругов была выявлена сбалансированная хромосомная перестройка. Дизайн исследования представляет собой когортное исследование с основной группой ПГД и двумя группами сравнения (рис. 1).
Рисунок. Схема проведения исследования.
За время проведения исследования у многих из наблюдавшихся пациенток беременность наступала разными методами, которые в категориях клинической эпидемиологии могут быть расценены как воздействия. Например, сначала естественные беременности, затем экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и ПЭ, а также вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) с применением ПГД. В связи с этим мы сочли возможным включение одних и тех же пациентов в разные группы в качестве разных наблюдаемых случаев.
У 42 пар была выполнена ПГД хромосомных аномалий эмбриона, они сформировали основную группу исследования. В 1-й группе сравнения проводили анализ репродуктивных исходов у 109 пар в естественных условиях: 48 супружеских пар, не прибегавших к методам ВРТ, а также 61 пара до их вступления в программы ВРТ. Вторую группу сравнения сформировали 32 супружеские пары, у которых были применены методы ВРТ (ЭКО/интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида – ИКСИ) без ПГД.
Все супружеские пары группы исследования получили консультацию врача-генетика и врача- репродуктолога, где были подробно проинформированы о сущности метода ПГД, его информативности и показаниях к диагностике. Генетические исследования включали: анализ кариотипа по культуре лимфоцитов периферической крови; ПГД хромосомных аномалий эмбриона; инвазивную пренатальную диагностику кариотипа плода методами биопсии хориона и амниоцентеза.
ПГД проводили методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). При подготовке клинического цикла ПГД FISH-зонды, адекватные для диагностики перестроек, были предварительно протестированы на фиксированных лимфоцитах периферической крови пациентов. ПГД хромосомных перестроек была дополнена диагностикой наиболее частых анеуплоидий (хромосом 13, 16, 18, 21, 22, Х, Y) на втором этапе FISH.
С целью ПГД всем парам было проведено ЭКО по стандартным протоколам. Для биопсии были отобраны эмбрионы, достигшие 5–8-клеточной стадии на третьи сут. В случае положительного заключения ПГД на 5-й день проводили ПЭ. Эмбрионы, признанные по результатам ПГД непригодными к переносу, были уничтожены.
Статистический анализ данных проводили с использованием программы SPSS statistics 17.0 – Statistical Package for the Social Science. Вычисление относительного риска (ОР) и отношения шансов (ОШ) потери беременности (включая самопроизвольный выкидыш и замершую беременность) проводили по стандартной формуле [2].
Результаты исследования
Наблюдаемые группы оказались однородными по клинико-анамнестическим характеристикам (табл. 1). В результате ВРТ с применением ПГД у 12 супружеских пар основной группы наступило 13 клинических беременностей. Из них 3 прекратили развитие в I триместре. У 10 пар родились 10 живых детей с нормальным фенотипом. Случаев внематочной беременности, а также ВПР плода в данной группе не было.
Таблица 1. Характеристика исследуемых групп.
Частота НБ после ВРТ с применением ПГД (23,1%) оказалась достоверно ниже частоты невынашивания естественно наступившей беременности – 59,1% (р1=0,01). Различия в частоте невынашивания клинической маточной беременности в основной группе по сравнению со 2-й группой сравнения не достигли порога достоверности, вероятно, из-за малого объема выборки (р2=0,267). Однако частотный анализ исходов беременности с учетом репродуктивных потерь в форме внематочной беременности показал достоверные различия в основной группе по сравнению с обеими группами сравнения (р1=0,009; р2=0,029). После включения в выборку случаев репродуктивных неудач, проявившихся аномалиями кариотипа плода и/или новорожденного, различия становятся еще более очевидными (р1 достигает 0,0001). Относительный риск НБ после ПГД оказался на 53% ниже, чем невынашивания естественно наступившей беременности. Шансы невынашивания естественной беременности были в 4,82 раза более высокими, чем таковые после ВРТ с применением ПГД. ОР потери беременности после ЭКО и ПЭ в 2,97 раза превысил таковой при беременности после ПГД. Шансы репродуктивной потери, включая НБ и внематочную беременность, после ЭКО и ПЭ оказались в 7,22 раза более высокими, чем таковые при беременности после ВРТ с применением ПГД (табл. 2).
Таблица 2. ОР и ОШ репродуктивных потерь в I триместре в различных группах.
При внутригрупповом анализе в основной группе оценивали частоту НБ после ПГД и данные анамнеза тех же пациенток. До проведения ПГД в анамнезе в основной группе у 18 супружеских пар суммарно было 42 беременности, из которых у 12 пар 23 (54,8%) беременности прекратили развиваться в I триместре. Шесть из анамнестических беременностей завершились родами, родились шесть детей с нормальным фенотипом. После применения ПГД самопроизвольный выкидыш имел место у трех женщин, то есть суммарно произошло три самопроизвольных выкидыша. Случаев аномалий кариотипа и/или ВПР плода после применения ПГД не было. Таким образом, при проведении ПГД отмечено снижение числа случаев НБ в 7,7 раз – с 23 до 3 – по сравнению с анамнезом (р=0,004, тест Вилкоксона). Число родов плодом с нормальным фенотипом увеличилось с 6 до 10. Возможно, данные изменения обусловлены именно селекцией нормальных эмбрионов, лежащей в основе метода ПГД.
Обсуждение
Возможная зависимость развития и течения беременности от применения ВРТ у носителей структурных хромосомных перестроек является актуальным и недостаточно изученным аспектом проблемы профилактики неблагоприятных репродуктивных исходов у данной группы пациенток.
В настоящей работе получены данные о снижении риска потери беременности после проведения ПГД по сравнению с естественной беременностью у пар с носительством сбалансированных хромосомных перестроек. Результаты предшествующих исследований также указывают на эффективность ПГД при носительстве хромосомных перестроек. J. Fisher и соавт. [3] отмечают снижение частоты самопроизвольных выкидышей после применения ПГД с 88,5 до 13%, Y. Verlinsky [11] – c 68 до 28,4%. Однако в данных работах наибольшее внимание уделяется эмбриологическим аспектам программ ВРТ, включая ПГД. В нашем исследовании для изучения клинических результатов ПГД использованы классические меры эффекта, широко применяемые в когортных исследованиях: ОР и ОШ.
В ходе работы мы не встретились с этическими противоречиями. Большинство пар к моменту включения в исследование имели отягощенный репродуктивный анамнез, многие из них не имели живых и/или здоровых детей. Эти обстоятельства определили заинтересованность в участии в исследовании, высокую мотивацию пациентов. По этическим причинам рандомизация метода оплодотворения (ПГД, донорство гамет или оплодотворение in vivo) невозможна, что заведомо ограничило выбор дизайна исследования.
Следует отметить, что в ряде публикаций высказывается мнение о недостаточно высокой эффективности ПГД как у носителей структурных хромосомных перестроек, так и у пациентов с нормальным кариотипом. M.D. Stephenson считает коррекцию факторов привычного НБ главным резервом для улучшения репродуктивных исходов у носителей структурных хромосомных перестроек [9]. По результатам систематического обзора M.T. Franssen, убедительных данных в пользу применения ПГД у данной группы пациентов не получено [4]. Однако в нашем исследовании применение ПГД увеличивает шансы благоприятного исхода наступившей беременности у пар со сбалансированными хромосомными перестройками.
Все исследователи единодушны в том, что невысокая распространенность данной патологии в популя- ции затрудняет процесс ее изучения. Малый объем выборки стал существенным ограничением и для нашего исследования. В настоящее время мы продолжаем работу над темой, в том числе и привлечение в исследование новых пациентов. Однако главную роль в решении проблем репродукции у данного контингента больных мы отводим исследованию причин и механизмов хромосомного дисбаланса при структурных хромосомных перестройках, а также совершенствованию методов генетической диагностики на предимплантационном, пренатальном и постнатальном этапах за счет развития методов полногеномного анализа и расширения возможностей молекулярноцитогенетического метода.
Заключение
Применение ПГД у носителей сбалансированных хромосомных перестроек приводит к снижению риска репродуктивных потерь по сравнению с естественно наступившей беременностью.
