Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) приобретают все большее значение в лечении различных форм бесплодия. Однако частота наступления клинической беременности и родов живым плодом не превышает 33 и 24,8% соответственно [1]. Известно, что эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от функциональной зрелости и готовности эндометрия к имплантации, а также от синхронизации с развитием эмбриона. Эндометрий восприимчив для эмбриона только в течение ограниченного периода времени максимальной рецептивности. Это так называемое «окно имплантации», период которого составляет несколько дней – примерно с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла, на 6–10-й день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) [2– 4]. Хорошо известно, что уровень сывороточных гормонов в естественном менструальном цикле, который предопределяет развитие эндометрия, значительно меняется в стимулированных циклах программ ЭКО, в связи с чем «окно имплантации» может изменяться во времени или отсутствовать [5].
Неблагоприятное воздействие стимуляции суперовуляции на рецептивность эндометрия было продемонстрировано в исследовании J.H. Check и соавт. (1992), в котором частота имплантации была значительно ниже у доноров ооцитов, чем у соответствующих по возрасту и качеству эмбрионов реципиентов [6]. Доказательством негативного влияния овариальной стимуляции на рецептивность эндометрия также является более высокая частота имплантации, клинической и прогрессирующей беременности в криоциклах ВРТ [7]. В исследованиях, оценивающих эндометрий в стимулированных циклах ЭКО в сравнении с натуральным циклом, были выявлены преждевременная секреторная трансформация и изменение экспрессии маркеров рецептивности в постовуляторную и раннюю лютеиновую фазы, что, возможно, приводит к несинхронному взаимодействию между жизнеспособным эмбрионом и рецептивным или субрецептивным эндометрием. Кроме того, в лютеиновой фазе стимулированного цикла изменяется профиль экспрессии генов эндометрия. Так, в протоколах с антагонистом гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) снижается экспрессия генов HOXA 10 в строме эндометрия [8].
Однако данные о влиянии овариальной стимуляции на эндометрий противоречивы. Так, результаты исследований M.H. Van der Gaast и соавт. (2008) не выявили различий в экспрессии различных маркеров рецептивности эндометрия при сравнении натуральных и стимулированных циклов [9]. A.J. Levi и соавт. (2001) также не обнаружили доказательств негативного влияния овариальной стимуляции на рецептивность эндометрия [10].
Факторы, влияющие на эндометрий в стимулированных циклах
Влияние агонистов и антагонистов ГнРГ. Эффект стимуляции яичников на созревание эндометрия в день получения ооцитов в циклах без отмены переноса был изучен в протоколах как с агонистами ГнРГ (аГнРГ), так и с антагонистами ГнРГ (антГнРГ) [11, 12]. Было высказано предположение, что использование антГнРГ может оказывать более негативное влияние на эндометрий по сравнению с аГнРГ [13]. Однако в некоторых исследованиях показано, что эндометрий в протоколе с антГнРГ больше соответствует натуральному циклу, чем в протоколе аГнРГ [14]. Использование аГнРГ в «длинном» протоколе приводит к глубокой десенситизации гипофиза. В исследованиях секреции гонадотропинов гипофизом после введения аГнРГ показано, что эти нарушения остаются по крайней мере в течение 14 дней после прекращения введения препаратов, то есть в течение всей лютеиновой фазы. Изменения сохраняются даже при непродолжительном введении аГнРГ в фолликулярной фазе стимулированного цикла [2]. Было высказано предположение, что в отличие от аГнРГ, использование антГнРГ не может повлиять на секрецию ЛГ в лютеиновой фазе стимулированного цикла, так как гипофиз сохраняет способность реагировать на эндогенный ГнРГ [2]. Однако в ряде исследований уровень ЛГ в лютеиновую фазу при использовании антГнРГ был низким [2]. Таким образом, использование как аГнРГ, так и антГнРГ приводит к снижению секреции ЛГ в лютеиновой фазе стимулированного цикла, а значит, к нарушению функции желтого тела и низким уровням прогестерона. Также не может быть исключен прямой эффект аналогов ГнРГ на эндометрий. Поскольку клетки эндометрия экспрессируют мРНК рецепторов ГнРГ, лечение антГнРГ может негативно влиять на рецептивность эндометрия [2].
Высокий уровень половых стероидов в сыворотке крови. Развитие и рост нескольких фолликулов в результате гормональной стимуляции яичников увеличивает количество полученных эмбрионов, доступных для переноса. При этом стимуляция яичников вызывает закономерное увеличение сывороточного уровня эстрадиола (Е2) и прогестерона, что по механизму обратной связи приводит к нарушению секреции ЛГ гипофизом и к снижению его уровня в сыворотке крови [2]. Кроме того, известно, что существенные изменения сывороточного уровня стероидных гормонов могут влиять на экспрессию рецепторов в эндометрии, нарушая тем самым его рецептивность.
В ряде работ было показано, что в циклах стимуляции встречается умеренное повышение уровня сывороточного прогестерона в день назначения препаратов хорионического гонадотропина человека (ХГч) для финального созревания ооцитов [15, 16]. Этот феномен, получивший название «преждевременная лютеинизация» (ПЛ), является одной из причин низкой эффективности программ ЭКО и по разным данным осложняет 12,4–52,3% циклов ВРТ с использованием аналогов ГнРГ [17]. До настоящего времени не определен абсолютный уровень прогестерона, позволяющий установить ее наличие, верхняя его граница значительно колеблется в различных работах от 0,8 до 2,0 нг/мл [17]. Остаются непонятными механизмы влияния на рецептивность эндометрия повышенных концентраций прогестерона в день введения триггера. С. Huang и соавт. (2012) показали, что продолжительное повышение концентрации прогестерона приводит к преждевременному созреванию эндометрия и, как следствие, раннему закрытию «окна имплантации» и снижению частоты наступления беременности [18]. При этом высказано предположение, что продолжительность воздействия прогестерона, а не его абсолютный уровень имеет решающее значение для адекватного функционирования «окна имплантации» [4, 18]. Более того, результаты исследования М. Melo и соавт. (2006), проведенного в программе донации ooцитов, показали, что на частоту наступления беременности реципиентов не влиял сывороточный уровень прогестерона доноров в конце стимуляции, что также позволяет предположить неблагоприятное влияние ПЛ на эндометрий [16].
Морфологические характеристики эндометрия в стимулированных циклах
Морфологические изменения эндометрия во время натурального менструального цикла были описаны более 50 лет назад R.W. Noyes и соавт. [19]. Авторы использовали морфологическую хронологическую систему датирования эндометрия в соответствии с днем менструального цикла. Эндометрий характеризуется как «out of phase», если не соответствует дню цикла по критериям Noyes более чем на 2 дня. Поскольку для успешной имплантации важна синхронизация между эмбрионом и эндометрием, то предполагают, что беременность не наступает при опережении развития эндометрия более чем на 3 дня [2, 11].
Результаты исследования эндометрия в день пункции фолликулов (P. Saadat, 2004) выявили опережение созревания эндометрия в среднем на 5,8±0,4 дня в группе пациенток с антГнРГ и на 5,9±0,7 дня в группе с аГнРГ, которое сохранялось до 7-го дня после пункции фолликулов [20]. В ряде исследований результаты биопсии эндометрия в раннюю лютеиновую фазу стимулированного цикла показали опережение созревания эндометрия или созревание эндометрия «out of phase» [12, 20]. Опережение развития эндометрия на 1,8 дня выявлено в 100% случаев, а у половины пациенток без поддержки лютеиновой фазы отмечалась задержка развития эндометрия [2]. При этом эндометрий в позднюю лютеиновую фазу (ХГч+11–13) соответствует дню цикла по критериям Noyes, что свидетельствует о его восстановлении [4].
Помимо этого, по данным A. Tavaniotou (2001), в эндометрии стимулированных циклов происходит асинхронное созревание желез и стромы, при этом строма более чем на 2 дня опережает созревание желез [2]. Однако A. Lass с соавт. (1998), изучив состояние эндометрия у женщин в день получения ооцитов, отметили, что асинхронное развитие железистого и стромального компонентов эндометрия не оказывает негативного влияния на частоту наступления беременности [21].
Таким образом, эндометрий в стимулированных циклах характеризуется несоответствием дню цикла согласно критериям Noyes и асинхронным созреванием желез и стромы.
Экспрессия рецепторов Е2 и прогестерона в натуральном и стимулированном циклах
В естественном цикле эстрогеновые рецепторы α и β (ЭРα и ЭРβ) экспрессируются в эпителиальных и стромальных клетках эндометрия в фазу пролиферации, снижаясь во время фазы секреции [2, 22]. Экспрессия ЭРα максимальна в течение периовуляторного периода [2]. Наивысший уровень экспрессии ЭРβ обнаруживается в эпителиальных клетках эндометрия в преовуляторном периоде, а также в клетках стромы и эндотелиоцитах в позднюю секреторную фазу. Показано, что экспрессия ЭРβ выражена значительно в меньшей степени, за исключением поздней секреторной фазы менструального цикла [23].
Прогестероновые рецепторы (ПР) представлены в изоформах А и В. ПР-А и ПР-В экспрессируются в эпителиальных и стромальных клетках в фазу пролиферации, при этом экспрессия обеих форм снижается в эпителиальных клетках во время секреторной фазы цикла, а в строме остается преимущественно ПР-А [2, 24].
Уровень экспрессии ЭР выше в пролиферативной фазе, а ПР – в секреторной фазе естественного цикла, и достигает максимума во время овуляции [2, 24, 25]. Затем экспрессия ЭР и ПР в эпителиальных клетках снижается, в то время как стромальные клетки поддерживают экспрессию ПP и сохраняют чувствительность к прогестерону. Было показано, что увеличение экспрессии ПР в строме напрямую связано с развитием рецептивности эндометрия [24, 26]. В некоторых исследованиях показано, что ПP-B присутствуют в железах и строме в пролиферативной фазе, резко снижаются в железах и увеличиваются в строме в секреторной фазе естественного цикла [24].
Таким образом, в естественном цикле снижение экспрессии ЭР и ПР в эпителиальных клетках и повышение ПР в строме эндометрия свидетельствует об открытии «окна имплантации».
Оценка экспрессии ЭР и ПР в стимулированных циклах проведена в ряде работ. D. Kyrou и соавт. (2009) приводят данные, что в фолликулярной фазе стимулированного цикла экспрессия ЭР в железистых и стромальных клетках эндометрия после первоначального увеличения далее значительно не изменяется, при этом экспрессия ПР продолжает увеличиваться [27]. C. Bourgain и соавт. (2003) обнаружили уменьшение экспрессии ПР в железах и строме в периовуляторную и лютеиновую фазы [4]. F. Hadi и соавт. (2003) обнаружили снижение ПР в эндометрии после стимуляции суперовуляции в сравнении с натуральным циклом на 4-й день лютеиновой фазы, что не совпадало с обнаруженными морфологическими изменениями [28]. Раннее снижение экспрессии ЭР и ПР в железистых клетках в лютеиновую фазу стимулированных циклов позволило сделать вывод о смещении окна имплантации вперед [2] .
В исследовании Е. Рapanikolaou и соавт. (2005) в позднюю фолликулярную фазу в циклах с антГнРГ при гистологическом исследовании эндометрия в день введения ХГч не обнаружено секреторных изменений, при этом экспрессия ПР была значительно выше в железах и строме, в то время как экспрессия ЭР в железах была понижена по сравнению с естественными циклами [22].
Данные об экспрессии ЭР в эндометрии стимулированных циклов значительно варьируют от полного уменьшения их экспрессии до увеличения в железах [4].
Таким образом, несмотря на отсутствие секреторных изменений в эндометрии, экспрессия стероидных рецепторов в стимулированных циклах в день введения триггера соответствовала первым дням лютеиновой фазы в естественных циклах. В связи с этим было высказано мнение, что высокий уровень Е2 во время фолликулярной фазы стимулированного цикла вызывает опережение развития эндометрия за счет ранней экспрессии ПР эндометрия [27].
Результаты исследований эндометрия в период предполагаемого «окна имплантации» (ЛГ+7 в естественном цикле и ХГч+7 в стимулированном цикле) показали значительное снижение экспрессии ЭРα в стимулированных циклах, при этом отмечена более низкая экспрессия ПР в железах и более высокая в строме [26]. Снижение экспрессии ПР в железах, но не в строме при овариальной стимуляции позволяет предположить, что высокий уровень стероидов имеет различное воздействие на экспрессию ПР в различных типах клеток [25].
Лейкемия-ингибирующий фактор (ЛИФ)
ЛИФ – цитокин, который экспрессируется в железистом эпителии и строме эндометрия на протяжении всего менструального цикла, при этом в пролиферативной фазе его экспрессия минимальна. Уровень ЛИФ повышается после овуляции, достигает максимума в среднюю фазу секреции на 19–25-й день и остается относительно высоким почти до конца менструального цикла, снижаясь с началом менструации до базального уровня [29–31]. Экспрессия ЛИФ и его рецептора на поверхности эндометрия коррелирует с обнаружением пиноподий, причем максимальная их продукция соответствует стадии появления зрелых пиноподий и предполагаемому периоду имплантации бластоцисты [30, 32].
Данные об экспрессии ЛИФ в стимулированных циклах ЭКО немногочисленны и противоречивы. В экспериментальных исследованиях на мышах при стимуляции суперовуляции в протоколах с аГнРГ выявлено снижение экспрессии ЛИФ в эндометрии через 48 ч после введения ХГч в сравнении с естественным циклом [33]. А. Arici и соавт. (1995) продемонстрировали отсутствие зависимости продукции ЛИФ от концентрации половых стероидов в сыворотке крови [34]. M.H. Van der Gaast и соавт. (2008) при исследовании образцов эндометрия доноров ооцитов на 5-й день после овуляции в естественном цикле и на 5-й день после получения ооцитов в последующем стимулированном цикле не обнаружили значимых различий в экспрессии ЛИФ [9]. C другой стороны, Q.J. Chen и соавт. (2008) выявили снижение секреции ЛИФ в эндометрии стимулированных циклов [35]. По некоторым данным наивысшая экспрессия ЛИФ была обнаружена на 7-й день лютеиновой фазы стимулированного цикла [4].
Пиноподии
Наиболее изученным и, по мнению некоторых исследователей, основным морфологическим маркером рецептивности эндометрия являются эндометриальные пиноподии – особые выпячивания мембраны на апикальных полюсах клеток поверхностного эпителия, развивающиеся в секреторную фазу из ресничек на поверхности эпителиоцитов [32, 36]. Образование пиноподий происходит под действием прогестерона. Кроме того, большое значение в развитии пиноподий имеют гены HOXA 10, блокирование которых приводит к резкому уменьшению количества пиноподий [37]. В естественном цикле пиноподии появляются на 6–8-й день после овуляции и присутствуют на поверхности эпителия полости матки не более 48 ч [3, 32]. Однако конкретный день их формирования может варьировать у разных женщин [30]. Развитые пиноподии наблюдаются на 6–9-й день после пика ЛГ (19–22-й дни), в среднем на 20-й и 21-й дни цикла, при этом истинные пиноподии полностью исчезают к 10-му дню после пика ЛГ (ЛГ+10-й день) [30, 32]. Именно в месте образования пиноподий происходят сигнальные взаимодействия между эндометрием и эмбрионом [37, 38].
Появление пиноподий в стимулированных циклах значительно варьирует от 18-го до 22-го дня цикла, а при использовании экзогенного Е2 и прогестерона в криопротоколах и в протоколах донации ооцитов определяется днем начала введения прогестерона и колеблется от 6-го до 8-го дня от приема первой дозы препарата [32, 36]. В большинстве случаев зрелые пиноподии наблюдаются на 19-й день, что является достоверным опережением созревания эндометрия примерно на 1–2 дня по сравнению с естественными циклами [23, 30, 36]. Подобную вариабельность появления пиноподий связывают с различным ответом каждой конкретной пациентки на стимуляцию суперовуляции [32]. Было высказано предположение, что на количество пиноподий и продолжительность их существования стимуляция функции яичников не влияет [36], хотя в более поздних исследованиях показано, что количество пиноподий в стимулированных циклах меньше в сравнении с натуральными циклами у фертильных женщин [39, 40]. M. Creus и соавт. (2003) при исследовании эндометрия в натуральном и стимулированном циклах у одной и той же пациентки не обнаружили различий в экспрессии пиноподий [38].
Таким образом, большинство исследователей полагают, что в стимулированных циклах ЭКО в отличие от естественных циклов опережение созревания эндометрия с точки зрения датирования по критериям Noyes коррелирует с ранним появлением пиноподий, уменьшением экспрессии ЭР и ПР, снижением экспрессии ЛИФ.
Интегрины
Важными маркерами рецептивности эндометрия являются молекулы клеточной адгезии, среди которых наиболее хорошо изучены интегрины – трансмембранные гликопротеины, состоящие из двух субъединиц (α и β), связанных нековалентными связями. Лигандами интегринов являются фибронектин, витронектин, остеопонтин и коллаген 4-го типа. Рецептор витронектина обнаруживается в период формирования имплантационного окна, при этом его экспрессия в естественном цикле тесно связана с уменьшением числа ЭР и ПР в эпителии. Секреция лиганда остеопонтина, который предположительно участвует в процессе имплантации эмбриона в эндометрий находится в прямой зависимости от уровня прогестерона [31]. В эндометрии интегрины секретируются постоянно, однако экспрессия некоторых из них варьирует в зависимости от фазы менструального цикла. Так, экспрессия интегрина αvβ3 у фертильных женщин начинается через 48 ч после появления пиноподий и достигает максимума с 22-го по 28-й день естественного цикла [41].
В стимулированных циклах (день ХГч+7) происходит снижение экспрессии интегринов в железистом эпителии, что, возможно, является одной из причин отсутствия имплантации [2, 35]. Однако роль интегринов в рецептивности эндометрия остается спорной.
Молекулярно-генетические аспекты эндометрия стимулированных циклов
Известно, что около 1399 различных генов участвуют в регулировании рецептивности эндометрия, из них экспрессия 342 генов увеличивается или уменьшается более чем в два раза в стимулированных циклах [42]. При этом среди генов с более активной экспрессией в эндометрии стимулированных циклов только 46% являются общими с естественными циклами. Эти данные, по мнению D. Haouzi и соавт. (2009), указывают на то, что доза гонадотропинов или длительность стимуляции приводит к активации транскрипции генов, которые не вовлечены в рецептивность в физиологических условиях. С другой стороны, 22% генов имеют менее активную экспрессию в эндометрии стимулированных циклов, что свидетельствует о частичном подавлении экспрессии генов при стимуляции функции яичников [43].
S. Mirkin и соавт. (2004) изучали профиль экспрессии генов в эндометрии в натуральном цикле (ЛГ+8) в сравнении с последующим стимулированным циклом (ХГч+9) в протоколах с аГнРГ и антГнРГ, с поддержкой прогестероном лютеиновой фазы или без нее [44]. Они пришли к выводу, что хотя стимуляция функции яичников вызывает структурные и функциональные изменения в эндометрии, отличия в экспрессии генов были незначительны. При этом существенные изменения были обнаружены при сравнении циклов с использованием аГнРГ и антГнРГ (экспрессия 13 генов значительно отличалась). J.A. Horcajadas и соавт. (2007), напротив, выявили изменение экспрессии более 200 генов в эндометрии стимулированного цикла (ХГч+7) в сравнении с предшествующим естественным циклом (ЛГ+ 7) у тех же пациенток, при этом в день ХГч+2 стимулированных циклов экспрессия генов в эндометрии сопоставима с естественными циклами (ЛГ+2) [42]. В «окно имплантации» структура экспрессии генов в протоколах с антГнРГ аналогична таковой в естественных циклах (изменена экспрессия 50 генов) и отличается от длинных протоколов (изменена экспрессия 85 генов) [14]. В исследовании D. Haouzi и соавт. (2009), в котором авторы оценивали профиль экспрессии генов в пререцептивной (ЛГ/ХГч+2) и рецептивной (ЛГ+7/ХГч+5) фазе естественного и последующего стимулированного цикла, было показано умеренное изменение рецептивности у 86% и значительное – у 14% пациентов в стимулированных циклах. Эти данные позволили авторам сделать вывод о необходимости отмены переноса эмбрионов, их криоконсервации и переносе в последующем цикле [43]. В работе I. Van Vaerenbergh и соавт. (2009) показано, что экспрессия генов эндометрия различна у женщин с морфологическим опережением созревания эндометрия в день получения ооцитов более чем на 3 дня и без него [45].
Ряд исследователей провели оценку экспрессии генов маркеров имплантации в зависимости от уровня сывороточного прогестерона в день введения триггера овуляции. Так, R. Li и соавт. (2011) провели оценку экспрессии генов маркеров имплантации остеопонтина и сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) в биоптатах эндометрия на 6-й день после трансвагинальной пункции яичников в зависимости от уровня прогестерона в день ХГч. Было выявлено увеличение экспрессии генов остеопонтина и снижение экспрессии СЭФР у пациенток с высокой концентрацией прогестерона (<4 нмоль/л) в день ХГч, что расценено авторами как причина нарушения рецептивности эндометрия, приводящего к низкой частоте наступления беременности [46].
В работе Е. Labarta и соавт. (2011) представлены результаты функционального геномного анализа экспрессии генов эндометрия в «окно имплантации» в зависимости от уровня циркулирующего прогестерона в день введения триггера овуляции в биоптатах эндометрия, полученных в день ХГч+7 у здоровых доноров ооцитов, подвергшихся стимуляции суперовуляции рекомбинантным ФСГ в протоколах как с аГнРГ, так и с антГнРГ. Авторы выявили значительное изменение экспрессии 140 генов (64 – более активная экспрессия, 76 – менее активная экспрессия), ответственных за клеточную адгезию, процессы развития иммунной системы и других, необходимых для нормальной функции эндометрия в группе женщин с уровнем прогестерона в день триггера >1,5 нг/мл по сравнению с контролем независимо от используемого аналога ГнРГ. Сделан вывод, что повышенный уровень сывороточного прогестерона в день назначения ХГч вызывает значительные изменения в профиле экспрессии генов эндометрия, ответственных за рецептивность [47].
В исследованиях I. Van Vaerenbergh и соавт. (2011) впервые были показаны существенные различия в профиле экспрессии генов эндометрия в зависимости от уровня прогестерона в день назначения ХГч. Авторы оценивали экспрессию генов эндометрия в день трансвагинальной пункции в циклах с антГнРГ у 14 пациенток, разделенных на 3 группы в зависимости от концентрации сывороточного прогестерона в день назначения ХГч: ≤0,9 нг/мл (группа А), 1–1,5 нг/мл (группа В) и >1,5 нг/мл (группа С). Выявлены незначительные отличия в экспрессии генов эндометрия между группами А и В (5 – активная экспрессия и 23 – менее активная экспрессия в группе В) и существенные различия между группами В и С (607 – активная экспрессия и 212 – сниженная; р≤0,05) [48]. Эти данные также свидетельствуют о неблагоприятном влиянии повышения Р ≥1,5 нг/мл в день триггера овуляции на рецептивность эндометрия.
Процесс синхронизации между развитием эмбриона и рецептивным эндометрием регулируется молекулярным механизмом, опосредованным гомеобоксными (НОХ) генами, которые кодируют факторы транскрипции. Экспрессия генов HOXA 10 и HОХА 11 в эндометрии достигает максимума в «окно имплантации» естественного цикла и напрямую зависит от секреции половых стероидов [49].
H.S. Taylor и соавт. (2003) провели анализ экспрессии HOXA 10 в эндометрии стимулированных циклов в протоколах с антГнРГ и аГнРГ. Авторы не выявили изменений экспрессии HOXA 10 в эндометрии стимулированных циклов [50]. С другой стороны, B.W. Rackow и соавт. (2008) предполагают, что антГнРГ снижают экспрессию HOXA 10 в строме эндометрия [8].
Таким образом, многими исследователями подтверждено неблагоприятное влияние стимуляции суперовуляции на рецептивность эндометрия в программах ВРТ. Однако механизмы этих изменений остаются недостаточно изученными. Также не определены неинвазивные маркеры для оценки рецептивности эндометрия, в том числе и в стимулированных циклах. Не определен клинически значимый для эндометрия пороговый уровень прогестерона в день введения триггера овуляции, а также недостаточно изучены возможные механизмы влияния преждевременного повышения прогестерона на исходы программ ЭКО. Требует дальнейшего изучения и разработка наиболее оптимальных подходов к предотвращению и коррекции негативного влияния стимуляции функции яичников на эндометрий в программах ЭКО.
