Изучение патогенеза различных форм гиперплазии эндометрия (ГЭ), эндометриальной интраэпителиальной неоплазии (ЭИН) у женщин является актуальным, что обусловлено высокой частотой рецидивирования процесса и возможностью малигнизации, которая происходит в 29% случаев [1]. В настоящее время нет единого мнения относительно критериев оценки выраженности гиперпластических изменений эндометрия и терминологии, обозначающей формы ГЭ и ЭИН. Впервые понятие ЭИН как предракового процесса с высоким риском малигнизации до 30%, предложил Mutter с соавт. в 2000 г. [2]. Верификация патологического процесса в эндометрии по данным исследования соскобов может быть неточной, так как в соскоб попадает, как правило, функциональный слой, тогда как основные изменения могут локализоваться в базальном эндометрии. Имеются клинические данные по обнаружению у 40% оперированных пациенток с эндометриоидной аденокарциномой (ЭАК) в базальной части эндометрия удаленных маток, тогда как в функциональном слое имелась комплексная гиперплазия эндометрия (КГЭ) или атипическая гиперплазия эндометрия [3, 4]. Диагностика ЭИН необходима для своевременного проведения лечения [2]. ГЭ и ЭИН рассматривают как гормонально зависимые предраковые процессы, характеризующиеся морфологическими перестройками и накоплением молекулярно-генетических изменений в клетках, обладающих риском развития рака эндометрия [2].
На сегодняшний день актуальным в диагностике и лечении гиперпластических процессов эндометрия является эффективный мониторинг показателей межклеточной адгезии и межклеточных контактов. Одним из маркеров диагностики опухолевого процесса является E-кадгерин мембранный белок, гликопротеин из семейства кадгеринов, продукт гена CDH1. E-кадгерин участвует в механизме регулировки межклеточной адгезии, клеточной подвижности и пролиферации эпителиальных клеток, имеет потенциальную супрессорную роль в клеточной инвазии [5, 6]. Изменения в клеточной адгезии являются одними из отличительных характеристик злокачественной опухоли, включая нарушения в экспрессии и распределении молекул адгезии [6]. Снижение экспрессии Е-кадгерина, белка, необходимого для создания межклеточных контактов, было обнаружено в значительной степени в опухолевых процессах различного эпителиального происхождения [6, 7]. Согласно литературным данным [8] в нормальном эндометрии экспрессия комплекса E-кадгерина в железистых клетках преобладает в пролиферативной фазе и уменьшается в секреторной. А в случаях рака эндометрия экспрессия E-кадгерина уменьшается по сравнению с показателями экспрессии в железистых клетках нормального эндометрия. Определение и оценка экспрессии E-кадгерина безусловно представляет диагностическую ценность [8].
Новым независимым прогностическим маркером опухолевого процесса является β-катенин белок, находящийся в комплексе с кадгеринами – молекулами клеточной адгезии. К β-катенин/Tcf-зависимым генам относятся некоторые ключевые регуляторы дифференцировки, гены, отвечающие за эпителиально-мезенхимальный переход и регуляцию клеточного цикла [9]. Кроме того, β-катенин выполняет в клетке важную функцию, участвует в формировании межклеточных контактов совместно с мембранными белками семейства кадгеринов и обеспечивает их связывание с актиновым цитоскелетом [9]. Установлено, что в случаях рака эндометрия экспрессия цитоплазматического β-катенина уменьшается по сравнению с показателями экспрессии в железистых клетках нормального эндометрия [8]. Экспрессия цитоплазматического β-катенина склонна к уменьшению при гистологически высокодифференцированных опухолях по сравнению с низкодифференцированными опухолями. Сниженная экспрессия цитоплазматического β-катенина в высокодифференцированных опухолях является плохим прогностическим критерием. Данные о сравнительной экспрессии E-кадгерина и β-катенина в ГЭ, ЭИН и ЭАК малочисленны и противоречивы [8, 10, 11].
Одним из маркеров опухолевого роста является эзрин – белок, принадлежащий к семейству трансмембранных гликопротеинов, ответственных за межклеточные связи между эпителиальными клетками, эпителиальными и стромальными клетками. Эзрин обнаруживается в нормальном эндометрии [12]. Кроме того, имеются указания, что он является маркером развития опухоли, инвазии и метастазирования [13]. Эзрин относится к новым независимым прогностическим маркерам в развитии ЭАК [13].
Целью нашего исследования явилось изучение нарушения экспрессии β-катенина, E-кадгерина и эзрина при различных формах ГЭ, ЭИН и высокодифференцированной ЭАК.
Материал и методы исследования
В исследование включены 45 женщин, находившихся на стационарном лечении в ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, в АО Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи, г. Астана, ГККП Онкологический диспансер г. Астаны.
С целью выявления клинико-анамнестических особенностей ретроспективно пациентки были разделены на группы с различными морфологически верифицированными видами патологических процессов эндометрия в соответствии с классификацией ВОЗ 2003 г. и морфологическими характеристиками для диагноза ЭИН, разработанных G. Mutter, Endometrial Collaborative Group 2000 г. [2, 14]: I группа – пациентки с простой ГЭ (ПГЭ) (n=12), II группа – с комплексной ГЭ без атипии (КГЭ) (n=9), III группа – с комплексной ГЭ с атипией (КАГЭ) (n=5), IV группа – c ЭИН (n=5), V группа – с высокодифференцированной ЭАК (n=4), верифицированные гистологически и иммуногистохимически с помощью Ki67 и PTEN. В качестве контроля исследованы соскобы пролиферативного эндометрия от 10 женщин. Обследование больных проводилось по ранее разработанной карте обследования, которая включала: сбор анамнестических данных, результаты гинекологического осмотра, расширенную кольпоскопию, данные клинико-лабораторного обследования, ультразвуковое исследование органов малого таза, магнитно-резонансную томографию органов малого таза, гистероскопию и гистерорезектоскопию, раздельное диагностическое выскабливание полости матки и цервикального канала, оперативное лечение (экстирпация матки с придатками), гистологическое исследование полученного материала. Средний возраст больных при исследовании составил 48,8±2,8 года.
Морфологические исследования выполняли на операционном материале: 9 удаленных маток (экстирпация матки с придатками), 26 соскобов эндометрия с ГЭ и ЭАК и 10 соскобов эндометрия контрольной группы. Материал фиксировался в 10% забуференном формалине, заливался в парафин. Серийные срезы больше 4 мкн окрашивались гематоксилином эозином и использовались для иммуногистохимических реакций. Демаскировка антигенов проводилась в ретривере с использованием цитратного буфера pН=6,0, при температуре 120°С в течение 20 минут. Для определения экспрессии E-кадгерина использовали кроличьи моноклональные антитела (clone NCH-38, Dako) в разведении 1:100. Для определения экспрессии β-катенина использовали кроличьи поликлональные антитела (RTU, CM Marque) в разведении 1:100. Для определения экспрессии эзрина использовали кроличьи моноклональные антитела фирмы Cell. Signaling в разведении 1:100. Разводили раствором для разведения антител Emerald antibody diluent (фирма Cell MARQUE). Для определения экспрессии Ki-67 и PTEN применялись моноклональные антитела к антигену Ki-67 (Dako, в разведение 1:100) и PTEN (Dako, в разведение 1:100). Ставились положительные и отрицательные контроли. Результаты реакций оценивались полуколичественным методом с расчетом баллов по количеству окрашенных клеток одного типа: 2 балла – до 20% положительных клеток, 4 балла – более 20%, но менее 40%, 6 баллов – равное 40% и более. Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc. (США). Все полученные количественные анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные обработаны методом вариационной статистики. Для сравнения числовых данных использовали метод t-критерий Стьюдента. Попарное сравнение осуществляли с помощью критерия Манна–Уитни.
Результаты исследования
Клинический анализ. Основной жалобой пациенток было наличие кровянистых выделений из половых путей во всех 5 группах: в I группе с ПГЭ у 75% больных, во II группе с КГЭ – у 77,8%, в III группе с КАГЭ – у 80%, в IV группе с ЭИН – у 80%, в V группе с ЭАК – у 100% пациенток. Жалобы на общую слабость предъявляли пациентки II группы – 11,1%, III группы 20%, IV группы – 20%. Анализ наследственной отягощенности пациенток показал значительную предрасположенность к опухолевым процессам: в I группе – 58,3% , во II группе – 55,6%, в III и IV группе – 80%, в V группе – 80%.
Наиболее часто встречающимся соматическим заболеванием являлась артериальная гипертензия, выявленная в I группе – у 33,3% больных, во II группе – 55,6%, в III и в IV группе – 60%, в V группе – 60%. Сахарный диабет 1-го и 2-го типа наблюдался в I группе у 33,3% пациенток, во II группе – у 22,2%, в III группе – у 40%, в IV группе – у 20%, в V группе – у 25%. Ожирение отмечено во всех группах: в I группе – 33,3%, во II группе 22,2%, в III группе – 40%, в IV группе – 40%, в V группе – 100%. Наши данные подтверждаются результатами исследований [15]. Наиболее частым сопутствующим гинекологическим заболеванием являлась миома матки: в I группе – 33,3%, во II группе 33,3%, в III группе 60%, в IV группе – 60%, в V группе – 25% больных. Синдром поликистозных яичников в анамнезе наблюдался в I группе – у 8,3% пациенток, во II группе – у 11,1%, в III группе у 20%, в IV группе – у 25%, в V группе – у 25%. При изучении репродуктивного анамнеза частота бесплодия составила: в I группе – 8,3%, во II группе – 11,1%, в III группе – 20%, IV группе – 20%, в V группе 25%. Фиброзно-кистозная болезнь молочных желез встречалась во всех группах: в I группе у 41,7% пациенток, во II группе – у 33,3%, в III группе – у 40%, в IV группе – у 25%, в V группе – у 60%. Рецидивирование гиперпластического процесса в анамнезе наблюдалось в I группе в 16,7%, во II группе – в 33,3%, в III группе – в 40%, в IV группе – в 40%, в V группе в 60%.
Морфологическая характеристика ГЭ, ЭИН и ЭАК
Основные гистологические признаки простой ГЭ без атипии (рис. 1а см. на вклейке) сводятся к увеличению числа желез и изменению их формы, происходящее параллельно с увеличением стромы, незначительному увеличению соотношения стромального и железистого компонентов при отсутствии цитологической атипии и низкой экспрессией Ki67 как в паренхиме, так и в строме, а также сохраненная экспрессия PTEN. Для КГЭ (рис. б см. на вклейке) характерна более выраженная пролиферация и тесное расположение желез, имеющих сложную архитектонику с почкообразными и папиллярными разрастаниями, а также увеличение железисто-стромального соотношения и экспрессии Ki67 в паренхиме и сохраненная экспрессия PTEN. При этой форме ГЭ отмечаются эпителиальная стратификация и отсутствие клеточной атипии. КАГЭ (рис. 1в см. на вклейке) характеризуется цитологической атипией, а именно отсутствием полярности, увеличением и стратификацией ядер, изменением их формы, увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения, нерегулярными комплексами хроматина, повышенной экспрессией Ki67 и незначительным уменьшением экспрессии PTEN в отдельных эпителиальных клетках. ЭИН (рис. 1в, г, д, см. на вклейке) выявляется в виде очага 2–3 мм в диаметре с комплексированием желез, малым содержанием стромы (<50%), атипией эпителиальных клеток, относительно высоким Ki67 и потерей экспрессии PTEN [14]. ЭАК (рис. 1е см. на вклейке) характеризуется выраженной атипией клеток и ядер эпителиальных элементов в пределах предшествующих структур без нарушения целостности базальной мембраны. Отличительными особенностями ЭАК служат отсутствие инвазии стромы опухолевыми клетками, сохранность предшествующих структур эндометрия и базальных желез, наличие воспалительной инфильтрации опухолево-измененного эпителиального пласта при отсутствии ее в окружающем эндометрии [16].
Иммуногистохимическая характеристика экспрессии E-кадгерина, β-катенина и эзрина (рис. 2 см. на вклейке)
При иммуногистохимическом исследовании E-кадгерин выявлялся в железистом и покровном эпителии неизмененного эндометрия в мембранной части клеток. Мембранная экспрессия E-кадгерина в железистых клетках эндометрия происходит главным образом в пролиферативной фазе и уменьшается в секреторную фазу. Кроме того, экспрессия E-кадгерина наблюдается и в функциональном, и в базальном слое, с преобладанием в базальном слое. Однако при изучении нами патологических процессов наблюдалось появление E-кадгерина и в цитоплазме клеток. Соотношения мембранной и цитоплазматической локализации E-кадгерина варьировало при разных видах патологии эндометрия (рис. 3а см. на вклейке). В нормальном эндометрии E-кадгерин выявлялся в мембране эпителиальных клеток эндометрия, определялась высокая экспрессия, составляя от 5 до 6 баллов, среднее значение составило 5,5±0,4. В ПГЭ преобладала мембранная экспрессия E-кадгерина от 4 до 6 баллов, среднее значение – 4,33±1,87, однако появлялись единичные клетки с продуктами реакции в цитоплазме, экспрессия E-кадгерина колебалась от 0 до 2 баллов и в среднем составила 1,20±1,10. При КГЭ без атипии преобладала цитоплазматическая экспрессия E-кадгерина, колеблющаяся от 2 до 4 баллов, среднее значение – 3,5±1,94, единичные клетки с продуктами реакции сохранились мембранно, экспрессия E-кадгерина от 0 до 2 баллов, среднее значение – 1,78±1,20. В случаях КАГЭ преобладала высокая экспрессия E-кадгерина цитоплазматически, от 4 до 6 баллов и среднее значение 4,33±1,8; мембранно продукт реакции выявлялся в единичных клетках от 0 до 2 баллов и в среднем экспрессия E-кадгерина составила 1,20±1,10 (рис. 3а см. на вклейке). При ЭИН отмечалась мембранная слабая экспрессия маркера – от 0 до 2 баллов, среднее значение – 1,20±1,10, в цитоплазме эпителиальных клеток E-кадгерин не экспрессировал, лишь в одном очаге была обнаружена слабая экспрессия маркера – от 0 до 1 балла, среднее значение – 0,50±1,0. E-кадгерин в раковых клетках ЭАК экспрессировал цитоплазматически, лишь в одном очаге обнаружена слабая экспрессия маркера, которая составила от 0 до 1 балла, среднее значение – 0,50±1,0, мембранно не экспрессировал.
Таким образом, особенности экспрессии E-кадгерина связаны с тем, что по мере прогрессии заболевания от ПГЭ до КАГЭ происходит потеря его мембранной специфической локализации, отражающей функциональную активность, и напротив, свободное накопление E-кадгерина наблюдается в цитоплазме клеток, а в клетках ЭИН и ЭАК E-кадгерин не экспрессирует.
При иммуногистохимическом исследовании β-катенин выявлялся в железистом и покровном эпителии неизмененного эндометрия в мембранной части клеток. Однако при развитии патологических процессов наблюдалось появление β-катенина и в цитоплазме клеток. Соотношения мембранной и цитоплазматической локализации β-катенина варьировало при разных видах патологии эндометрия (рис. 3б см. на вклейке). В нормальном эндометрии β-катенин выявлялся в мембране эпителиальных клеток эндометрия, определялась высокая экспрессия, составляя от 5 до 6 баллов, среднее значение составило 5,5±0,4. В ПГЭ преобладала мембранная экспрессия β-катенина – от 4 до 6 баллов, среднее значение – 4,33±1,87, однако появлялись единичные клетки с продуктами реакции в цитоплазме, экспрессия β-катенина колебалась от 0 до 2 баллов и в среднем составила 1,20±1,10. При КГЭ без атипии преобладала цитоплазматическая экспрессия β-катенина, колеблющаяся 2 до 4 баллов, среднее значение – 3,5±1,94, единичные клетки с продуктами реакции сохранились мембранно, экспрессия β-катенина от 0 до 2 баллов, среднее значение – 1,78±1,20. В случаях КАГЭ преобладала высокая экспрессия β-катенина цитоплазматически, от 4 до 6 баллов, и среднее значение 4,33±1,8; мембранно продукт реакции выявлялся в единичных клетках от 0 до 2 баллов и в среднем экспрессия β-катенина составила 1,20±1,10. При ЭИН преобладала цитоплазматическая экспрессия β-катенина, колеблющаяся 2 до 4 баллов, среднее значение – 3,5±1,94, единичные клетки с продуктами реакции сохранились мембранно, экспрессия β-катенина от 0 до 2 баллов, среднее значение – 1,78±1,20. В раковых клетках ЭАК продукт реакции выявлялся в единичных клетках от 0 до 2 баллов, и в среднем экспрессия β-катенина составила 1,20±1,10, β-катенин в мембране не экспрессировал, лишь в одном очаге была обнаружена слабая экспрессия маркера – от 0 до 1 балла, среднее значение – 0,50±1,0.
При иммуногистохимическом исследовании эзрин выявлялся в железистом и покровном эпителии неизмененного эндометрия в области апикальной мембраны клеток. Однако при развитии патологических процессов наблюдалось появление эзрина и в цитоплазме клеток. Соотношения мембранной и цитоплазматической локализации эзрина варьировало при разных видах патологии эндометрия. В нормальном эндометрии эзрин выявлялся в мембранной части эпителиальных клеток эндометрия, определялась высокая экспрессия, составляя от 4 до 6 баллов, среднее значение составило 4,33±1,87. В ПГЭ преобладала мембранная экспрессия эзрина от 4 до 6 баллов, среднее значение – 4,33±1,87, однако появлялись единичные клетки с продуктами реакции в цитоплазме, экспрессия эзрина колебалась от 0 до 2 баллов и в среднем составила 1,20±1,10. При КГЭ без атипии преобладала цитоплазматическая экспрессия эзрина, колеблющаяся от 3 до 5 баллов, среднее значение – 3,5±1,94, единичные клетки с продуктами реакции сохранились мембранно, экспрессия эзрина от 1 до 2 баллов, среднее значение – 1,78±1,20. В случаях КАГЭ и ЭИН преобладала высокая экспрессия эзрина цитоплазматически – от 4 до 6 баллов, среднее значение 4,33±1,8; мембранно продукт реакции выявлялся в единичных клетках – от 0 до 2 баллов, и в среднем экспрессия эзрина составила 1,20±1,10. Эзрин в раковых клетках ЭАК экспрессировал преимущественно цитоплазматически, колебался от 5 до 6 баллов, среднее значение 5,5±0,4, а в мембранной части клеток ЭАК эзрин не экспрессировал, лишь в одном очаге была обнаружена слабая экспрессия маркера, от 0 до 1 балла, среднее значение – 0,50±1,0 (рис.3в см. на вклейке).
Обсуждение
Резюмируя полученные данные исследования, следует отметить, что особенности экспрессии Е-кадгерина, β-катенина и эзрина связаны с тем, что по мере прогрессии заболевания от ПГЭ до КАГЭ происходит потеря их мембранной локализации, отражающей функциональную активность, и напротив, свободное накопление Е-кадгерина, β-катенина и эзрина наблюдается в цитоплазме клеток. В ЭИН и ЭАК Е-кадгерин не экспрессирует, а β-катенин, эзрин сохраняются цитоплазматически. Изменение локализации Е-кадгерина и β-катенина, вероятно, связано с нарушением межклеточных контактов, максимальное проявление которого происходит при ЭАК. Таким образом, по мере прогрессии ГЭ до КАГЭ теряются межклеточные контакты и нарастает уровень экспрессии Е-кадгерина, β-катенина, эзрина. Максимальное значение уровня экспрессии маркеров обнаруживается до развития инвазивного рака эндометрия, что, вероятно, согласуется с данными о значении в канцерогенезе преимущественно генов супрессоров рака [6, 8, 9]. Снижение уровня экспрессии мембранного Е-кадгерина, β-катенина и эзрина в ЭАК может быть связано с процессом эпителиально-мезенхимальной трансформации, лежащей в основе готовности к инвазивному росту при ЭИН и самим инвазивным ростом при ЭАК. Мы установили, что мембранная локализация Е-кадгерина, β-катенина и эзрина теряются в процессе канцерогенеза от ПГЭ до ЭАК. Цитоплазматическая локализация не позволяет белкам осуществлять их функцию в формировании межклеточных контактов и адгезии. Напротив, она может свидетельствовать о нарушении транспорта Е-кадгерина, β-катенина и эзрина в зону межэпителиальных контактов как за счет дефектов транспортных систем, так и нарушении структуры самих маркеров.
Заключение
Экспрессия Е-кадгерина, β-катенина и эзрина возрастает при ПГЭ и КГЭ, достигает своего апогея на стадии КАГЭ и снижается при ЭИН и ЭАК.
Особенности экспрессии Е-кадгерина, β-катенина и эзрина связаны с тем, что по мере прогрессии заболевания от простой ГЭ до КАГЭ происходит потеря их мембранной специфической локализации, отражающей функциональную активность, и напротив, свободное накопление Е-кадгерина, β-катенина и эзрина наблюдается в цитоплазме клеток. Изменение локализации Е-кадгерина, β-катенина и эзрина, вероятно, связано с нарушением межклеточных контактов, максимальное проявление которого происходит в ЭАК и отражает эпителиально-мезенхимальную тарнсформацию на стадиях КАГЭ, ЭИН и ЭАК.
Молекулярные и морфологические особенности КАГЭ и ЭИН во многом стереотипны, включая потерю специфической мембранной локализации β-катенина, E-кадгерина и эзрина от простой ГЭ до ЭАК, но отличаются по уровню экспрессии генов β-катенина, E-кадгерина и эзрина в цитоплазме эпителиальных клеток ЭАК, а также по экспрессии PTEN.
Полученные результаты клинико-анамнестических, диагностических и иммуногистохимических исследований в приведенных группах больных могут обосновать дифференцированный подход к выбору тактики лечения больных с различными формами ГЭ.
