Ответная реакция организма на любое внешнее или внутреннее воздействие является многокомпонентной и определяется такими качествами, как чувствительность, реактивность и резистентность. Одним из наиболее общих свойств, позволяющих дифференцированно реагировать на воздействие факторов внешней и внутренней среды, является реактивность. Именно она во многом определяет развитие, особенности течения и исходы болезни. Чувствительность – это возможность дифференцировать характер и интенсивность действия фактора, а также передавать информацию о нем другим клеткам. Резистентность, или устойчивость, – это способность организма переносить действие повреждающего фактора [1, 2].
Реактивность организма сформировалась в результате эволюционного развития, а ее совершенствование и многообразие обеспечивают приспособляемость и устойчивость организма к патогенам.
Несостоятельность реактивности может возникнуть как вследствие повреждения генетической программы, так и в результате нарушений в ее реализации. В ответ на воздействие повреждающего или инфекционного фактора происходит активация неиммунной или иммунной реактивности, проявляющейся микроциркуляторными нарушениями, лейкоцитарной инфильтрацией, фагоцитозом поврежденных клеток, субклеточной и клеточной регенерацией, что приводит к полному излечению без каких-либо последствий для организма. В условиях измененной реактивности общая приспособительная реакция может стать чрезмерной (гиперергия) или ослабленной (гипергия) и способствовать излечению со значительным повреждением ткани или хронизации болезни [2, 3].
Переход острого воспаления в хроническое связан с незавершенностью воспаления, когда конечная цель, заключающаяся в уничтожении патогенного агента и его удалении из организма, не достигается. Хронизация развивается в результате нарушения базовых механизмов врожденного иммунитета, таких как распознавание и фагоцитоз возбудителя [4].
Наличие хронического воспаления в высоком цилиндрическом эпителии матки препятствует наступлению беременности. Для осуществления оплодотворения решающее значение имеет перестройка эндометрия, заключающаяся в ветвлении желез и активном ангиогенезе [5]. Максимально эти изменения выражены в период окна имплантации, примерно на 7-й день после овуляции. Начиная с лютеиновой фазы цикла, высокие уровни прогестерона стимулируют секреторную деятельность эндометриальных желез и осуществляют уникальную по длительности перестройку фибробластов стромы эндометрия до специализированных децидуальных клеток [3, 6].
Хронический эндометрит является самостоятельной причиной бесплодия у 18,8% женщин и фактором невынашивания беременности у 52,1% пациенток [3]. Поскольку в основе хронического воспаления лежит неполноценность (гипергия) реактивности, попытка воздействия на это звено врожденного иммунитета может способствовать восстановлению функции эндометрия [7].
Итак, первичным звеном в формировании реактивности эндометрия к чужеродным агентам являются Toll-подобные рецепторы (TLR – Toll-like receptors) [4, 5]. Это сигнальные структуры, которые экспрессируются на поверхности клеток и в эндосомах. При их активации бактериями, вирусами, простейшими и любыми другими экзогенными и эндогенными факторами запускается каскад последовательных внутриклеточных реакций, инициирующих в ядре транскрипцию генов провоспалительных цитокинов, интерферона и антимикробных пептидов [4–8]. Неполноценность первичного звена реагирования приводит к недостаточной продукции провоспалительных цитокинов и развитию хронической воспалительной реакции [7, 8].
Одним из препаратов, зарегистрированных в качестве стимулятора функциональной активности моноцитов, нейтрофилов, естественных киллеров, фагоцитоза, выработки цитокинов (ИЛ-1, TNF), регенерации и эпителизации ткани, является Суперлимф. Он представляет собой естественный комплекс природных противомикробных пептидов и цитокинов, является иммуномодулятором и обладает противовирусным и противомикробным действием [7, 8].
Целью нашего исследования явилось выявление клинико-иммунологических параллелей у пациенток с бесплодием и хроническим эндометритом до и после проведения экзогенной цитокинотерапии.
Материалы и методы
Проспективное исследование включило 58 пациенток. В основную группу вошли 43 женщины в возрасте от 25 до 45 (34,4±2,7) лет с критериями включения:
- морфологически и иммуногистохимически подтвержденный хронический эндометрит;
- женское бесплодие (исключены эндокринный, анатомический и трубно-перитонеальный факторы);
- отсутствие инфекций, передающихся половым путем, и любого воспалительного процесса во влагалище;
- отсутствие значимой соматической патологии (сахарный диабет, ожирение, гипотиреоз, системные заболевания);
- отсутствие аллергических реакций на белки животного происхождения;
- подписанное информированное согласие пациентки на участие в исследование.
Группу сравнения составили 15 женщин в возрасте от 20 до 25 (23,3±0,4) лет, не имеющих в анамнезе беременностей, внутриматочных вмешательств, гинекологической и соматической патологий.
Набор материала проводился в консультативно-диагностическом отделении ГКБ № 40 в кабинете бесплодия, группа сравнения была сформирована из клинических ординаторов, обучающихся на базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Объем обследования включал сбор анамнеза, морфологическое, иммуногистохимическое (ИГХ) и иммунологическое исследование ткани эндометрия. Забор материала у пациенток основной группы проводился дважды на 20–24-й дни цикла: на этапе включения и через 20 дней после проведения терапии препаратом Суперлимф. В группе сравнения забор материала проводился однократно. После проведения аспирационной биопсии эндометрия пациенткам с хроническим эндометритом был назначен препарат Суперлимф по 1 свече (25 ЕД) во влагалище в течение 20 дней.
Для получения ткани эндометрия мы использовали урогенитальный зонд типа С «Пайпель». Материал помещался в пробирки с 10% раствором формалина (для ИГХ и морфологического исследований) и в пробирки типа Эппендорф с транспортной средой (для иммунологического исследования). В ИГХ-исследовании оценивались количество пиноподий (%), экспрессия рецепторов к эстрогенам и прогестерону (в эпителии и строме), наличие инфекционных агентов (цитомегаловируса (ЦМВ), вируса простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типов, вируса Эпштейна–Барр, вируса папилломы человека (ВПЧ)), маркеры хронического эндометрита (CD138, CD20, CD8, CD4, CD56, HLA-DRII).
Исследование факторов врожденного иммунитета проводили на кафедре иммунологии МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова (зав. кафедрой проф. Ганковская Л.В.). Были изучены экспрессия генов TLR4, TLR2, HBD1-дефенсина и фактора некроза опухоли (TNFa) методами реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по стандартным методикам [7, 8]. Уровень противомикробного пептида HNP1-3 оценивали методом иммуноферментного анализа (набор Human HNP1-3, HycultBiotech).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2016 и Statistica 6.1. Для описания количественных данных, имеющих нормальное распределение, использовали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (SD). При распределении признаков, отличающихся от нормального, количественные данные описаны в виде медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3. Корреляционный анализ производили методом Спирмена. Величина уровня значимости р=0,05 принята за критическую при интерпретации результатов статистического анализа.
Результаты
Основными критериями включения в основную группу были наличие хронического эндометрита и бесплодие. У 90,7% пациенток бесплодие было вторичным и только у 4 (9,3%) – первичным. Длительность бесплодия составила от 1 до 16 лет, в среднем 4 (0,7) года. В анамнезе 20,5% женщин проходили программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), беременность наступила у 5,1% из них. Акушерский анамнез 39 пациенток с вторичным бесплодием характеризовался влагалищными родами (43,6%), артифициальным абортом до 12 недель (25,6%), самопроизвольным выкидышем до 10 недель (30,8%). Из пациенток основной группы внутриматочные вмешательства в виде раздельного диагностического выскабливания отмечены у 39,5%.
Гинекологический анамнез был отягощен эктопией шейки матки (25,6%), носительством Ureaplasma spp. (34,8%), полипом эндометрия (23,2%) и кандидозным вульвовагинитом (34,8%).
Был проанализирован 101 образец эндометрия, полученный до и после курса экзогенной цитокинотерапии пациенток основной группы и группы сравнения.
Золотым стандартом диагностики хронического эндометрита является выявление в его тканях скопления плазматических клеток (CD138). Данный маркер обнаружен в 100% случаев у пациенток основной группы. Кроме того, при хроническом эндометрите (по сравнению с показателями группы сравнения) качественное окрашивание на CD20 выявлено в 53,5% и 4,7% соответственно, на CD8 и CD4 – в 55,8% и 9,3%, CD56 – в 51,2% и 6,9% соответственно. Таким образом, подтверждено, что при хроническом эндометрите в ткани эндометрия значительно превышен уровень цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-лимфоцитов хелперов, естественных киллеров и В-лимфоцитов.
В неизмененном эндометрии суммарное мембранное и цитоплазматическое окрашивание на все изучаемые клетки не превышало 9,3%, за исключением CD138, который не был обнаружен ни у одной пациентки из группы сравнения.
После курса терапии препаратом Суперлимф были выявлены изменения. Через 20 дней качественная детекция CD138 в виде мембранного окрашивания выявлялась только в 39,5% образцов (р=0,03). Частота положительного мембранного окрашивания на В-лимфоциты (CD20) снижалась в 1,4 раза (до 37,2%, р=0,05), а уровни цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8) и NK-клеток значимо не менялись. Было выявлено увеличение количества клеток с положительным мембранным окрашиванием на CD4 (маркер Т-лимфоцитов хелперов, в 1,7 раза, р=0,04) и HLA-DRII (в 1,5 раза, р=0,05).
Показатели рецептивности эндометрия имели выраженную индивидуальную вариабельность. Было обнаружено, что при хроническом эндометрите по сравнению с группой сравнения процент пиноподий составлял 44,9 (12,4) и 61 (10,5) соответственно (р=0,04), экспрессия рецепторов эстрогенов в строме составляла 25,9 (7,9) и 67,5 (12,1) (р=0,03), в эпителии – 32,3 (6,2) и 74 (18,6) (р=0,04), экспрессия рецепторов к прогестерону в строме составляла 47,1 (4,9) и 131,5 (12,2) (р=0,02), в эпителии – 35,3 (7,1) и 108,3 (25,1) (р=0,02) соответственно. Таким образом, в ткани эндометрия с хроническим воспалением выявлено значимое снижение экспрессии всех изучаемых рецепторов (рис. 1).
После проведения курса цитокинотерапии отмечено увеличение числа пиноподий в 1,27 (до 56,3%) раза, в эпителии – усиление экспрессии рецепторов к эстрогенам в 1,3 (96,9 (9,2)) раза и к прогестерону – в 3 (107,8 (22,8)) раза (р=0,02). В стромальных клетках также отмечена тенденция к увеличению экспрессии рецепторов: в 3,25 раза к эстрогенам (81,8 (11,6)) и в 2,7 раза к прогестерону (129,7 (15,1)) (р=0,04). Показатели экспрессии рецепторов к прогестерону достигли уровней нормы.
Результаты качественной оценки ядерного и цитоплазматического окрашивания клеток эндометрия на наличие вирусных агентов показали, что в большинстве образцов ткани от пациенток основной группы были выявлены вирусные включения: у 25,6% – ВПГ 2 типа, у 55,8% – вируса Эпштейна–Барр, у 6,9% – ВПГ 1 типа и у 4,6% – ВПЧ. В группе сравнения не было выявлено ни одного случая обнаружения внутриклеточных вирусных включений. После 20-дневного курса цитокинотерапии нами было установлено значительное (в 2,2 раза) снижение детекции вируса Эпштейна-Барр (с 55,8 до 25,5%, р=0,02) и отсутствие изменений для ВПГ и ВПЧ.
В табл. 1 представлены результаты исследования экспрессии генов врожденного иммунитета и дефенсина в тканях эндометрия у пациенток с хроническим эндометритом и в норме.
В ткани неизмененного эндометрия преобладает экспрессия генов рецепторов TLR2, кодирующих образование распознающих рецепторов врожденного иммунитета, и в значимом количестве присутствуют гены эффекторных молекул (дефенсин и TNFα). Данные молекулы отвечают за реактивность организма и своевременность и полноценность ответа на проникновение инфекционных факторов.
Обнаружено, что экспрессия генов врожденного иммунитета сохраняется и на фоне хронического воспаления, но достоверно отличается от показателей нормы. В 1,2 раза снижена экспрессия TLR4 и дефенсина, а уровень экспрессии генов TNFα и рецептора TLR2 умеренно повышены (в 1,13 раза).
После курса цитокинотерапии были выявлены значимые изменения: в 1,3 раза снизилась экспрессия гена рецептора TLR2 (р=0,04), возросла экспрессия гена рецептора TLR4 (в 1,5 раза) (р=0,03), TNFα (в 1,2 раза) (р=0,05), HBD1 (в 2,1 раза) (р=0,03) и HNP1-3 (в 1,6 раза) (р=0,05).
Спонтанная беременность наступила у 19 (44,2%) пациенток в течение от 1 до 6 месяцев после окончания курса терапии (рис. 2). Длительность бесплодия составляла от 2,5 до 7,5 года, и во всех случаях бесплодие было вторичным. К моменту подготовки статьи беременность самопроизвольно прервалась у 3 (15,7%) пациенток в сроках до 7 недель, неразвивающаяся беременность 6–9 недель была диагностирована у 3 женщин (15,7%), своевременные влагалищные роды произошли у 2 пациенток (10,5%), беременность пролонгируется в сроках 30–34 недели – у 7 (36,8%). Сообщили о наступлении беременности и ее ультразвуковом подтверждении 4 (21%) пациентки, но в дальнейшем выбыли из исследования по собственному желанию.
Мы отдельно проанализировали результаты ИГХ- и иммунологического исследований ткани эндометрия пациенток с наступившей в последующем беременностью (табл. 2).
Согласно представленным в таблице данным, исходные показатели экспрессии гена рецептора TLR2 и TNFα у женщин с хроническим эндометритом и наступлением беременности после терапии не отличались от нормы. Значимые различия были выявлены только для экспрессии TLR4 (снижена в 1,9 раза) и дефенсина (снижен в 1,4 раза). После курса экзогенной цитокинотерапии отмечено значимое повышение экспрессии всех изучаемых факторов, значимо превышающее показатели нормы и показатели в группе женщин, беременность у которых в последующем не наступила.
Сопоставление полученных результатов с ИГХ-исследованием позволило выявить некоторые закономерности. Подтверждена обратная корреляция между повышением экспрессии генов факторов врожденного иммунитета и снижением детекции маркеров хронического эндометрита (CD138, CD20). Слабая значимая обратная корреляционная связь была выявлена между уровнем экспрессии генов рецепторов TLR2 и количеством В-лимфоцитов. Умеренная значимая обратная связь – между уровнями экспрессии TLR4 (р=0,04) и HBD1 (р=0,005) и количеством плазматических клеток. Сильная значимая обратная связь подтверждена для экспрессии генов TLR2 (р=0,02) и TNFa (р=0,03) с концентрацией плазматических и активированных B-лимфоцитов.
Обсуждение
Реактивность организма является врожденной особенностью, которая позволяет своевременно и адекватно реагировать на любые экзо- и эндогенные воздействия с последующей полной элиминацией повреждающего фактора и восстановлением целостности ткани. Нарушения реактивности в виде гипергии или гиперергии приводят к чрезмерному повреждению ткани или развитию хронического воспаления.
В большинстве случаев при хроническом эндометрите не удается верифицировать инициирующий фактор, а терапия возникающего клеточного и молекулярного дисбаланса в настоящее время не разработана.
В проведенном нами исследовании была предпринята попытка изучения и сопоставления клинических и иммунологических изменений в ткани эндометрия при хроническом эндометрите и бесплодии, а также разработки вариантов коррекции выявленных изменений.
ИГХ-исследование тканей при хроническом эндометрите подтвердило ранее имеющиеся данные о массивном скоплении плазматических клеток (CD138), В-лимфоцитов, больших гранулярных лимфоцитов (CD56), Т-лимфоцитов хелперов (CD4), а также сниженной экспрессии в ядрах клеток железистого эпителия рецепторов к эстрогенам и прогестерону. В большинстве образцов были верифицированы признаки хронической вирусной инфекции, с преобладанием цитоплазматических включений ВПГ 1 и 2 типов (32,5%) и вируса Эпштейна–Барр (55,8%).
При иммунологическом исследовании было обнаружено, что в тканях на фоне хронического воспаления изменяется экспрессия генов факторов врожденного иммунитета, отвечающих за реактивность и выработку эффекторных противобактериальных молекул. Значимо снижена экспрессия гена рецептора TLR4 и дефенсина. TLR4 отвечает за начальное звено взаимодействия с бактериальными и вирусными агентами, передавая сигнал в ядро клетки и инициируя запуск продукции провоспалительных цитокинов и интерферона. Снижение экспрессии данного гена в тканях, уже пораженных, может отражать или истощение данного фактора, или его изначальную несостоятельность. Дефенсин (HBD1) является катионным пептидом, активным в отношении бактерий, грибков и разнообразных оболочечных и безоболочечных вирусов и участвует в процессе лизиса фагоцитированных микроорганизмов. Сниженная экспрессия генов, отвечающих за выработку данного фактора, может являться одной из причин персистенции в клетках эндометрия вирусов.
После 20-дневного курса экзогенной цитокинотерапии нами были получены интересные результаты. Значимо улучшились показатели рецептивности эндометрия за счет увеличения числа пиноподий (в 1,27 раза) и нормализации экспрессии рецепторов к прогестерону. У 27 (62,8%) пациенток морфологический диагноз хронического активного вирусного эндометрита был снят полностью, а у 16 (37,2%) женщин сохранялся в виде хронического неактивного процесса. Цитоплазматические включения вируса Эпштейна–Барр стали выявляться в 2 раза реже (с 55,8 до 25,5%). Полученные результаты можно связать с изменениями, произошедшими в экспрессии генов факторов врожденного иммунитета. После окончания курса лечения в тканях эндометрия возросла экспрессия рецепторов TLR4, что привело к повышению уровня экспрессии HBD1 (в 5 раз), TNFα (в 2,2 раза) и HNP1-3 (в 1,57 раза).
Клинически также были выявлены изменения. Из 43 пациенток, страдающих бесплодием на фоне хронического эндометрита, спонтанная беременность наступила у 19 (44,2%). Из них у 13 (68,4%) ИГХ диагноз хронического эндометрита был снят после курса цитокинотерапии, и во всех случаях отсутствовал вирус Эпштейна–Барр. При сопоставлении характера начальных изменений ткани эндометрия и их состояния после курса экзогенной цитокинотерапии были выявлены обратные корреляционные зависимости. Мы обнаружили, что исходный дисбаланс иммунокомпетентных клеток и цитокинов, которые нарушают рецептивность и пролиферативную активность клеток эндометрия, может быть скорректирован у ряда пациенток. Увеличение экспрессии генов, кодирующих факторы врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, HBD1, TNFα), приводит к количественному снижению вирусных включений и выраженности хронического воспаления. Чем выше оказывается экспрессия факторов врожденного иммунитета, тем меньше в тканях эндометрия обнаруживается скоплений плазматических клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов.
Заключение
Представленные результаты позволяют предположить, что экзогенная цитокинотерапия может быть эффективной у пациенток с хроническим вирусным эндометритом.
