Вагинальный микробиом является важной составляющей репродуктивного здоровья женщины и представляет собой сложную и динамичную экосистему, играющую значимую роль как в физиологических процессах, так и в развитии патологических состояний. В поддержании гомеостаза вагинальной микроэкосистемы ключевую роль играют лактобациллы, продуцирующие различные антимикробные соединения, такие как молочная кислота, перекись водорода и бактериоцины. Колонизация и доминирование лактобацилл (Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii и Lactobacillus iners) являются важными признаками вагинальной микробиоты здоровых женщин, в то время как нарушение баланса – снижение количества лактобацилл и/или чрезмерное количество условно-патогенных микроорганизмов – приводит к дисбиозу влагалища. Дисбиотическое состояние, характеризующееся замещением нормальной лактобациллярной микрофлоры большим количеством облигатных и факультативных анаэробных микроорганизмов, таких как Gardnerella vaginalis, Fannyhessea vaginae, Prevotella spp., Mobiluncus spp. и др., приводит к развитию бактериального вагиноза. Преобладание аэробной условно патогенной микрофлоры, главным образом Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., бактерий семейства Еnterobactеriасеае (Escherichia coli, Klebsiella spp. и др.), характерно для аэробного вагинита. Streptococcus agalactiae могут быть причиной тяжелой патологии у беременных женщин, родильниц и новорожденных детей. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются в большинстве случаев причиной кандидозного вульвовагинита [1]. Кроме того, вагинальная микрофлора может быть одним из источников контаминации дистальной части уретры, что может приводить к бактериурии, либо бессимптомной, либо клинически выраженной [2]. Присутствие одновременно нескольких возбудителей (аэробные и/или факультативно-анаэробные микроорганизмы и/или грибы) способствует выраженному нарушению вагинальной микробиоты и появлению более сложной клинической картины вульвовагинитов смешанной этиологии [3]. Важной клинической проблемой являются рецидивирующие вульвовагинальные инфекции, одной из причин возникновения которых рассматривается формирование биопленок.
Биопленки представляют собой сложные структуры, состоящие из консорциума микроорганизмов, окруженных внеклеточным полимерным матриксом. В составе биопленок клетки менее восприимчивы к факторам иммунной защиты макроорганизма, проявляют повышенную устойчивость к химиотерапевтическим препаратам по сравнению с планктонными формами. Кроме того, микроорганизмы внутри биопленок могут переходить в состояние покоя или медленного роста, что делает их менее восприимчивыми к действию лекарственных препаратов [4].
Существует достаточно большое количество методов, позволяющих провести оценку способности микроорганизмов формировать биопленки: анализ образования биопленок в микротитровальных планшетах, метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH); для изучения ультраструктуры микробных сообществ – электронная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия [5, 6]. Простота выполнения, высокая производительность и низкая стоимость метода определения биопленок в полистироловых плоскодонных планшетах, а также возможность оценки образования биопленки разными штаммами (бактерии, грибы) в различных условиях роста сделали этот анализ основным инструментом в изучении биопленкообразующей способности микроорганизмов. Метод основан на сорбции молекул красителя на структурах биопленки с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители. Такой способ индикации наиболее часто используется в статических методах культивирования биопленок и позволяет дать условную количественную характеристику образовавшимся микробным сообществам, т.е. чем больше образуется матрикс биопленки, тем больше красителя сорбируется на его поверхности и тем выше оптическая плотность образца.
Целью данного исследования была оценка способности изолятов условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из вагинального биотопа, формировать моновидовые биопленки in vitro.
Материалы и методы
Используемые в работе изоляты были получены при анализе клинического материала (отделяемое влагалища) от женщин репродуктивного возраста, проходивших обследование в НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта в 2024–2025 гг. Исследовано 142 изолята микроорганизмов: Lactobacillus crispatus (n=9), Lactobacillus jensenii (n=6), Lactobacillus iners (n=1), Lactobacillus rhamnosus(n=1), Lactobacillus reuteri (n=1), Gardnerella vaginalis (n=13), Escherichia coli (n=23), Streptococcus agalactiae (n=39), Enterococcus faecalis (n=29) и дрожжеподобных грибов рода Candida (n=20). Данное исследование не предполагало проведение корреляционного анализа способности микроорганизмов образовывать биопленки с симптоматикой заболеваний влагалища, их рецидивирующим течением или исходами терапии.
Для культивирования, хранения и дальнейшего исследования использовали плотные и жидкие питательные среды: кровяной агар с 5% дефибринированной крови, среда Сабуро (агар и бульон), триптиказо-соевый бульон (ТСБ), триптиказо-соевый бульон с 10% глицерина, MRS агар, MRS бульон. Идентификацию выделенных микроорганизмов до вида осуществляли с применением масс-cпектрометрического анализа с использованием времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS, BRUKER Daltonics, Германия).
Оценка способности клинических изолятов микроорганизмов образовывать моновидовые биопленки проводилась на основании количественного определения оптической плотности биопленок в 96-луночном стерильном плоскодонном полистироловом планшете по модифицированному методу Christensen et al. Для проведения эксперимента чистую суточную культуру каждого изолята микроорганизмов засевали в 5 мл питательного бульона (ТСБ, MRS, среда Сабуро) инкубировали сутки при температуре 36°С и 5% концентрации СО2. Концентрацию выросших микроорганизмов доводили до 0,5 по стандарту МакФарланда, что приблизительно соответствует 1–2×108 КОЕ/мл для Escherichia coli. Плотность суспензии измеряли нефелометром CrystalSpec (Becton Dickinson, США). Суспензию встряхивали на вортексе и делали два последовательных десятикратных разведения, чтобы конечная концентрация составляла 106 КОЕ/мл. В лунки 96-луночного стерильного плоскодонного полистиролового планшета асептически вносили по 200 мкл суспензии микроорганизмов в конечном разведении. Для достоверности исследования суспензия каждого микроорганизма вносилась в три лунки. Отрицательным контролем (К(-)) служили лунки с 200 мкл питательного бульона без бактерий. После внесения образцов планшет закрывали крышкой и инкубировали 48 ч при температуре 36°С и 5% концентрации СО2. После инкубации каждую лунку трехкратно промывали 300 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,2 комнатной температуры для удаления свободно плавающих планктонных микроорганизмов. После каждого шага промывки опорожняли планшет однократным интенсивным встряхиванием. Далее сушили при комнатной температуре до полного высыхания и фиксировали в течение 20 минут, добавляя в каждую лунку 150 мкл этанола. Спирт удаляли из лунок, подсушивали планшет. Для визуализации биопленок препарат окрашивали 2% генцианвиолетом в течение 15 минут. По окончании окраски удаляли краситель и промывали лунки проточной водой до полного обесцвечивания воды. Для элюации красителя из клеток в каждую лунку добавляли 150 мкл 95% этанола, выдерживали планшет при комнатной температуре и закрытой крышке 30 минут. Элюат из окрашенных лунок переносили в новый 96-луночный планшет. Оптическую плотность (ОП) каждой лунки измеряли спектрофотометрически с использованием автоматического планшетного ридера (Tecan Sunrise) с тестовой длиной волны 570 нм и референтной длиной волны 620 нм. Рассчитывали средние оптические плотности для отрицательного контроля (ОПК-) и тестируемых образцов (ОПобр).
Интерпретировали результаты следующим образом:
1) клинические изоляты, не образующие биопленку – ОП образца менее или на уровне ОП отрицательного контроля;
2) клинические изоляты, слабо образующие биопленку – ОП образца превышала ОП отрицательного контроля не более чем в 2 раза;
3) клинические изоляты, умеренно образующие биопленку – ОП образца превышала ОП отрицательного контроля в 2–4 раза;
4) клинические изоляты, образующие выраженную биопленку – ОП образца превышала ОП отрицательного контроля более чем в 4 раза.
Результаты
Исследовано 142 клинических изолята. Большинство из них (108/142; 76,1%) образовывали биопленки, при этом высокая способность образовывать биопленки отмечена для 38 (35,2%) клинических изолятов, 70 (64,8%) отнесены к микроорганизмам, которые слабо и умеренно образуют биопленки. Остальные 34/108 (23,9%) изолята биопленки не образовывали (табл. 1).
Большинство клинических изолятов Lactobacillus spp. (17/18; 94,4%) образовывали биопленки разной степени плотности; исключение составил один изолят L. iners, который биопленку не образовывал. Все клинические изоляты L. crispatus (9/9; 100%) и большинство L. jensenii (5/6; 83,3%) образовывали слабые или умеренные биопленки. Клинические изоляты L. rhamnosus, L. reuteri и один изолят L. jensenii образовывали выраженную биопленку (табл. 2, рис. 1).
Протестированные клинические изоляты G. vaginalis характеризовались способностью к образованию биопленки различной степени выраженности: слабые – 2/13 (15,4%), умеренные – 3/13 (23,1%) и выраженные 8/13 (61,5%) (табл. 3, рис. 2).
Большинство клинических изолятов Candida spp. 18/20 (90%) образовывали биопленки in vitro, при этом ни один из них не относился к категории слабо образующих биопленки. Среди всех протестированных изолятов Candida albicans 9/11 (81,8%) отличались умеренной и выраженной способностью к образованию биопленок, два изолята биопленки не образовывали. Все изученные клинические изоляты Candida glabrata и Candida parapsilosis образовывали выраженные биопленки in vitro (табл. 4, рис. 3).
Биопленкообразующая способность аэробных условно-патогенных микроорганизмов представлена в таблице 3. Способность образовывать биопленки разной степени плотности была выявлена у 66,7% изолятов S. agalactiae: большинство из них (16/39; 41,0%) формировали слабые биопленки, к категории умеренно образующих биопленки были отнесены 9/39 (23,1%) и только один изолят S. agalactiae (2,6%) образовал выраженную биопленку. Среди клинических изолятов E. faecalis 7 (24,1%), 5 (17,2%) и 3 (10,3%) были отнесены к слабо, умеренно и выраженно образующим биопленки соответственно. Большинство изолятов E. coli (16/23; 69,6%) формировали умеренные и выраженные биопленки, 3/23 (13%) – слабые биопленки. Не образовывали биопленки 33,3% (13/39) клинических изолята S. agalactiae, 48,3% (14/29) E. faecalis и 17,4% (4/23) E. coli. (табл. 5).
Обсуждение
Вопросы формирования биопленок и изучение их роли в патологических процессах представляют большой интерес в медицине. Недавние исследования показали, что большинство заболеваний микробной этиологии сопровождаются или опосредованы образованием биопленок, и именно с образованием биопленки связывают неэффективность терапии и рецидивирующее течение [7, 8]. Микроорганизмы в составе биопленок приобретают качественно новые свойства по сравнению с планктонной формой: более устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы. Биопленки устойчивы к высоким концентрациям антибиотиков, которые в 100–1000 раз превышают их минимальные подавляющие концентрации. В клинических условиях высокая выживаемость биопленочных микроорганизмов ведет к рецидивированию и хронизации инфекционного процесса [9, 10].
Более 90% изученных видов бактерий способны образовывать биопленки. С одной стороны, формирование биопленок представителями нормальной микробиоты человека защищает организм от инвазии патогенной микрофлорой. С другой стороны, способность бактерий формировать бактериальные биопленки рассматривается в настоящее время как один из факторов патогенности и является основной причиной развития рецидивирующих инфекционных процессов различной локализации. Согласно результатам нашего исследования, 76,1% (108/142) изолятов микроорганизмов, выделенных из вагинального биотопа, образовывали биопленки in vitro разной степени плотности.
В составе вагинальной микробиоты женщин репродуктивного возраста преобладают лактобациллы. Способность лактобацилл образовывать биопленки in vivo сопровождается стабильной колонизацией слизистой половых путей, что создает барьер, препятствующий адгезии патогенов к эпителию. В работе Parolin C. et al. (2021) оценили способность 16 штаммов лактобацилл (L. crispatus, L. gasseri, L. vaginalis и L. plantarum) образовывать биопленки. Все тестируемые лактобациллы образовывали биопленки; была показана высокая вариабельность уровня образования биопленки среди штаммов L. crispatus и L. gasseri (умеренно и выраженно образующие биопленки), образование слабо выраженных биопленок L. vaginalis. L. plantarum формировали наиболее плотные биопленки, что связано с особенностями пробиотических штаммов (обладают большим геномом, кодирующим сахара, внеклеточные белки и регуляторные пептиды, позволяющие адаптироваться в различных экологических нишах) [11]. Подобный результат был получен и в нашем исследовании: 94,4% изолятов лактобацилл образовывали биопленки разной степени плотности, все изоляты L. crispatus (100%) и большинство L. jensenii (83,3%) образовывали слабые или умеренные биопленки; один изолят L. jensenii, изолят L. rhamnosus и L. reuteri образовывали выраженную биопленку.
Ограничением данного исследования является изучение единичных изолятов лактобацилл, таких как L. rhamnosus, L. reuteri и L. iners. Кроме того, L. iners относится к трудно культивируемым микроорганизмам, поэтому для изучения их способности образовывать биопленки, возможно, требуются особые условия.
Одна из наиболее актуальных проблем в акушерско-гинекологической практике – нарушение экосистемы влагалища у женщин репродуктивного возраста. Бактериальный вагиноз является наиболее распространенным нарушением нормального (физиологического) микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста. Заболевание часто принимает рецидивирующую форму: у 50–70% женщин после окончания терапии бактериальный вагиноз рецидивирует в течение 3–6 месяцев, и до 80% женщин сталкиваются с рецидивом заболевания в более поздние сроки. Формирование биопленки является ключевым механизмом патогенеза и неэффективности лекарственной терапии бактериального вагиноза [12, 13]. Среди бактерий, ассоциированных с бактериальным вагинозом, G. vaginalis имеет наибольший потенциал вирулентности, демонстрируя более высокую адгезию и цитотоксические эффекты, а также большую тенденцию к образованию биопленок [14]. Клинические изоляты G. vaginalis, протестированные в нашем исследовании, образовывали биопленки in vitro в 100% случаев, при этом для большинства из них – 84,6% (11/13) – была характерна выраженная или умеренная способность к образовыванию биопленки.
Кандидозный вульвовагинит – вторая по распространенности вагинальная инфекция; у 75–80% женщин в течение жизни встречается хотя бы один эпизод кандидозного вульвовагинита, около 9% из них сталкиваются с рецидивирующими эпизодами инфекции. Наиболее часто этиологическим фактором кандидозного вульвовагинита является вид C. albicans (около 70–90%), реже другие виды рода Candida – C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei и C. tropicalis [15]. Патогенность Candida spp. обусловлена способностью образовывать гифы, адгезией к эпителию, продукцией внеклеточных ферментов [16]. В настоящее время показано, что Candida spp. способны образовывать биопленки, что также представляет собой один из основных факторов толерантности при терапевтическом воздействии, способствующий развитию рецидивирующих форм кандидоза [17]. Клинические изоляты C. albicans, C. glabrata и C. parapsilosis, включенные в наше исследование, формировали биопленки in vitro в большинстве случаев – 80, 100 и 100% соответственно, при этом ни один из них не относился к категории слабо образующих биопленки.
В настоящее время считается, что микрофлора при аэробном вагините состоит из комменсальных аэробных микроорганизмов кишечного происхождения, а наиболее часто встречающимися бактериями являются E. coli, E. faecalis и S. agalactiae [18]. Способность к формированию биопленки является одним из важных факторов вирулентности E. coli. В исследовании Mahale R.P. et al (2025) сравнили способность к формированию биопленок комменсальными и уропатогенными изолятами E. coli: 72,22% изолятов уропатогенной E. coli образовывали биопленки в то время, как только у 6,6% комменсальных E. coli был выявлен данный признак [19]. Согласно результатам систематического обзора, формирование биопленок клиническими изолятами E. faecalis широко распространено во всем мире и составляет 68,68%. Плотность образования биопленки E. faecalis варьировала в широких пределах: выраженные биопленки формировали 47,92% клинических изолятов, умеренные – 38,06% и слабовыраженные – 26,88% [20]. Как и другие бактерии, S. agalactiae также образуют биопленки, которые способствуют колонизации слизистой оболочки влагалища и являются фактором вирулентности, играющим роль в патогенезе. В исследовании Kaminska D. et al. (2020) оценили чувствительность к противомикробным препаратам, распределение серотипов и детерминант вирулентности, а также способность к образованию биопленок 165 изолятов S. agalactiae, выделенных от беременных, новорожденных и взрослых с клиническими проявлениями. Все штаммы S. agalactiae образовывали биопленки: более половины исследуемых изолятов (86/165; 52,1%) формировали умеренные биопленки; 72/165 (43,6%) – слабовыраженные и 7/165 (4,2%) – выраженные биопленки [21]. Согласно результатам нашего исследования, E. faecalis, выделенные из вагинального биотопа, формировали биопленки почти в половине случаев (51,7%), однако только в 10,3% было отмечено образование выраженных биопленок; больше половины изолятов S. agalactiae (66,7%), выделенных от бессимптомных беременных женщин, образовывали биопленки; 82,6% E. coli образовывали биопленки разной степени плотности.
В состав биопленки могут входить микроорганизмы одного вида, но чаще всего биопленка представляет собой полимикробное сообщество. Например, было показано, что образование полимикробных биопленок, состоящих из Candida spp., G. vaginalis и E. coli в составе вагинальной микробиоты, сопровождалось более тяжелым течением вследствие снижения эффективности антимикробной терапии [22]. Кроме того, в смешанной биопленке микроорганизмы могут взаимодействовать как синергетически, так и антагонистически. Например, экзополисахарид, секретируемый лактобациллами, стимулирует их рост и образование собственных биопленок, и, наоборот, ингибирует образование биопленок, образованных E. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., S. agalactiae и Candida spp. [23]. В исследовании, проведенном Li M. et al. (2024), изучалось влияние S. agalactiae на формирование биопленки G. vaginalis при совместном культивировании. Результаты показали, что S. agalactiae значительно увеличивает биомассу G. vaginalis в 48-часовых двухвидовых биопленках [24]. Необходимо отметить, что на данный момент количество исследований, направленных на изучение межвидового взаимодействия между несколькими возбудителями, все еще ограничено. Большой научный интерес представляет разработка новых методов культивирования и создание условий образования «смешанных» или полимикробных биопленок in vitro для оценки их роли в патогенезе инфекционных заболеваний и оценки возможности терапии смешанных инфекций.
Заключение
Таким образом, нами показано, что изоляты условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из вагинального биотопа, способны образовывать моновидовые биопленки in vitro. Однако микроорганизмы, участвующие в патологических процессах, существуют в виде сложных микробных сообществ. Необходимо проводить дальнейшие исследования для разработки методик по созданию условий образования «смешанных» или полимикробных биопленок in vitro, а также изучения синергетического и/или антагонистического взаимодействия микроорганизмов при формировании биопленки. Крайне перспективны исследования по изучению корреляционных связей между микроорганизмами, способными образовывать биопленки, и клиническими проявлениями вагинальных инфекций, особенно при их рецидивирующем течении.
