Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки
РФ №16.522.12.2009 от 29.09.2011.
До настоящего времени одной из нерешенных проблем в акушерстве является оценка состояния
рубца на матке после операции кесарева сечения (КС). Рост частоты оперативного родоразрешения, инвазивность и недостаточная информативность предложенных методов оценки состояния рубца у беременных диктует необходимость проведения дальнейших исследований, направленных на поиск достоверных и малоинвазивных методик. В связи с этим перспективным представляется изучение возможности использования генетических факторов в качестве предикторов формирования неполноценного рубца.
В наших предыдущих исследованиях была выявлена существенная роль локального воспаления [2] и процессов неоангиогенеза [3] в патогенезе несостоятельности рубца на матке после предыдущего КС, что обусловило интерес к про- и противовоспалительным цитокинам, таким как интерлейкины 6 и 10.
Интерлейкин-6 (IL-6) является мультифункциональным цитокином, вовлеченным в воспаление, костный метаболизм, репродукцию, развитие нервной ткани и гематопоэз. Описан полиморфизм промоторной области (-174 C>G), влияющий на функциональную активность гена.
Экспериментальные данные свидетельствуют об ассоциация G-аллеля с высоким базальным уровнем IL-6 в плазме [12], но c низким интерлейкиновым ответом ex vivo, в ответ на введение LPS [16].
Интерлейкин-10 – плейотропный цитокин. Основной его функцией является супрессия дифференцировки Th1-Т-лимфоцитов и активированных макрофагов и поляризация иммунного ответа по Th2-пути. Также участвует в регуляции синтеза IgE и апоптозе эозинофилов. Обладает противовоспалительной активностью, подавляя экспрессию активированными макрофагами провоспалительных цитокинов TNF-a, IFN-γ, IL-6, IL-12 и IL-1. Исследования близнецов показали, что от 50 до 75% вариабильности уровня экспрессии IL-10 обусловлены генетическими факторами [9; 14]. Генетической основой этой изменчивости является наличие трех двухаллельных полиморфизмов в промоторе гена IL-10 в позициях -1082, -819 и -592 [8; 10].
Мы предположили, что полиморфизм генов IL-6 и IL-10 может играть роль в формировании неполноценного рубца матки после КС.
Целью исследования явилось изучение связи между основными морфологическими признаками неполноценности рубца матки и полиморфизмом генов цитокинов.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 160 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет с рубцом на матке после
операции КС. Во время повторной операции КС производили иссечение рубца и проводили
гистологическое исследование ткани рубца и прилежащего миометрия (окраска гематоксилин-эозиноном).
Все пациентки были разделены на две группы на основании результатов морфологического
исследования биоптата миометрия: основную группу составили 80 пациенток с неполноценными рубцами матки (НР) и контрольную группу – 80 пациенток с полноценными рубцами (ПР) матки.
Диагностика неполноценного рубца основывалась на морфологических критериях:
1) наличие очагов дезорганизации соединительной ткани в виде мукоидного набухания,
фибриноидного набухания и фибриноидного некроза;
2) некроз лейомиоцитов, замурованных в рубцовую ткань и на границе с рубцом;
3) интрамуральные гематомы и множественные петехиальные кровоизлияния;
4) воспалительная инфильтрация – лимфогистиоцитарная с примесью полиморфноядерных
лейкоцитов;
5) неоангиогенез.
Наличие двух и более из вышеперечисленных признаков, выявляемых при морфологическом исследовании области рубца, расценивалось как неполноценность данного рубца.
Интраоперационная оценка области нижнего сегмента матки (НСМ) производилась визуально
во время повторной операции КС. Полноценные рубцы, как правило, не визуализировались или
были представлены в виде соединительнотканного рубца толщиной 3–5 мм. Неполноценные
рубцы были представлены в виде локального или тотального истончения миометрия менее 2 мм.
Для проведения генетического исследования до родоразрешения производили взятие крови
из кубитальной вены по стандартной методике.
Определение замен одиночных нуклеотидов (табл. 1) проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды [1; 11]. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Статистическая обработка данных проводилась с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 9.7 (J.H. Abramson WINPEPI (PEPI-for-Windows): computer programs for epidemiologists. Epidemiologic Perspectives & Innovations 2004, 1:6). Для определения статистической значимости различий применялись точный двухсторонний критерий Фишера и U-тест
Манна-Уитни для несвязанных совокупностей. Отношение шансов (OR) приведено с 95% доверительным интервалом (CI).
Таблица 1. Список изученных полиморфизмов.
Анализ неравновесности сцепления проводился с помощью свободно-распространяемого продукта Haploview версии 4.2 [4]. Подготовка данных для анализа осуществлялась с помощью SNP_tools версии 1.61 – свободно-распространяемого расширения для MS Excel [5].
Результаты исследования и обсуждение
Возраст беременных, включенных в исследование, колебался от 22 до 45 лет и составил в среднем 32,9±1,2 и 33,9±0,9 года соответственно по группам. Различий по частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве в группах выявлено не было. В соматическом анамнезе
у пациенток основной группы среди заболеваний сердечно-сосудистой системы превалировал пролапс митрального клапана – 15,0% (OR=6,3; CI 1,6–24,2) и нейро-циркуляторная дистония – 21,3%, (OR=1,2; CI 0,6–2,5), кроме того, только у пациенток данной группы отмечалась гипертоническая болезнь. Среди заболеваний мочевыделительной системы у пациенток основной группы чаще отмечались хронический пиелонефрит – 16,3% (OR=1,7; CI 0,7–3,8), хронический цистит – 8,8% (OR=1,2; CI 0,4–3,2), и только в данной группе отмечен нефроптоз (1,3%). Различий в частоте заболеваний ЛОР-органов (хронический тонзиллит, хронический фарингит, ангина) выявлено не было. Обращала внимание высокая частота миопии в обеих группах, (у каждой 3-й пациентки), при этом у пациенток основной группы превалировала миопия высокой степени – 16,3% (OR=3,5; CI 1,3–9,8),
в то время как во второй группе – слабой 15,0% (OR=0,2; CI 0,1–0,6).
При изучении структуры гинекологической заболеваемости была отмечена высокая частота цервицита (у каждой 3-й пациентки) в первой группе – 30% (OR=1,25; CI 0,7–2,3) и хронического сальпингоофорита – 15% (OR=0,9; CI 0,4 2,0). Также у пациенток данной группы в 3 раза чаще встречалась дисфункция яичников –7,5% (OR=2,9; CI 0,7–12,2). Примечательно, что в контрольной группе статистически значимо преобладали вагинит – 16,3% (р=0,04, OR=0,4; CI 0,2–1,0) и миома матки – 23,8% (р=0,03, OR=0,4; CI 0,2–0,9). Значимых различий по другим нозологиям в группах выявлено не было. Течение I триместра у пациенток основной группы чаще осложнялось ранним токсикозом – 45% (OR=1,6; CI 0,9–2,8). Во II триместре у пациенток данной группы чаще отмечалась угроза выкидыша – 35% (OR=1,3; CI 0,7–2,3) и истмикоцервикальная недостаточность – 15% (OR=3,1;
CI 1,1–8,6). В III триместре течение беременности у пациенток основной группы чаще осложнялось угрозой преждевременных родов – 21,3% (OR=1,2; CI 0,6–2,5), плацентарной недостаточностью, сопровождающейся задержкой развития плода –16,3% (OR=3,7; CI 0,9–15,0), и анемией – 18,8% (OR=1,9; CI 0,8–4,3), в то время как в группе сравнения чаще отмечали преэклампсию – 7,5% (OR=0,67; CI 0,2–2,1).
Все пациентки были родоразрешены путем операции КС. При этом частота экстренного родоразрешенияпревалировалавосновнойгруппе(65,0%), также только у пациенток этой группы отмечены преждевременные роды (3,8%). Основными показаниями к родоразрешению являлись: начало родовой деятельности (31,3 и 23,7%), подозрение на несостоятельность рубца на матке (25,0 и 5,0%) и преждевременное излитие околоплодных вод (8,8 и 10%). Течение раннего неонатального периода в основной группе чаще осложнялось развитием неонатальной желтухи, транзиторного тахипноэ, а также только в этой группе выявлено внутричерепное кровоизлияние.
При морфологическом исследовании ткани рубца признаки воспаления и неоангиогенеза обладали максимальной чувствительностью при высокой специфичности для выявления неполноценного рубца. В то же время наличие гематомы или признаков дезорганизации, обладающих высокой специфичностью, из-за недостаточной чувствительности может быть использовано только как подтверждающий тест. Некроз лейомиоцитов выявляли очень редко, в связи с чем данный признак, обладающий высокой специфичностью, имел очень низкую чувствительность (табл. 2). Также следует отметить, что сочетание воспаления и неоангиогенеза наблюдалось в 55% случаев, в то время, как сочетание любых двух других признаков выявлялось не чаще, чем в 27% наблюдений.
Таблица 2. Частота встречаемости признаков неполноценности рубца в группах и их аналитическая
ценность для характеристики состояния рубца.
Таблица 3. Ассоциация аллельных вариантов генов интерлейкинов 6 и 10 с различными признаками
неполноценности рубца.
Нами был проведен поиск ассоциаций основных признаков неполноценности рубца с аллельными вариантами генов IL-6 и IL-10 (табл. 3). Некроз лейомиоцитов не рассматривали, так как частота встречаемости данного признака была очень низкой (табл. 2).
При анализе распределения генотипов IL-6: -174 C>G нами была выявлена незначительная тенденция к повышению вероятности дезорганизации соединительной ткани и возникновению гематомы у носителей генотипа G/G, но различия не достигали уровня статистической значимости. В целом на риск неполноценности рубца данный генотип также не оказывал влияния.
Нами был проведено исследование двух полиморфных локусов гена IL-10 (-819 C>T и -592 C>A), локализующихся в промоторной области. Было подтверждено полное неравновесное сцепление данных локусов (D’=1 [0,98–1,0], LOD=104,84), что согласуется с данными других исследований [13].
В целом была отмечена связь неполноценности рубца с аллелем ТА данного гаплотипа, но различия не достигали статистической значимости. При этом наблюдалась статистически значимая ассоциация указанного аллеля с отдельными признаками неполноценности рубца.
Генотипическая частота встречаемости аллеля TA составляла 39% при наличии воспаления по сравнению с 17% без такового (OR=3,02 [1,25–7,29]; р=0,01). Неоангиогенез в ткани рубца также чаще наблюдали у носительниц аллеля TA (OR=2,55 [1,00–6,50]; р=0,05). Гомозиготное носительство этого аллеля, согласно аутосомно-рецессивной модели, статистически значимо было ассоциировано с неоангиогенезом в рубце (OR=11,81 [0,69–202,08]; р=0,04). Учитывая, что аллель TA ассоциирован с низкой экспрессией IL-10 [6, 7, 10, 15], можно сделать вывод о тормозящем действии IL-10 на развитие воспалительной реакции и, как следствие, снижению ангиогенеза, что, в конечном итоге, приводит к
формированию полноценного рубца.
Частота выявления гематом и признаков дезорганизации в ткани рубца не зависела от генотипа
IL-10, что может свидетельствовать о наличии альтернативного патогенетического механизма
формирования неполноценного рубца, морфологически проявляющегося в виде очагов дезорганизации соединительной ткани с признаками мукоидного и фибриноидного набухания и фибриноидного некроза. Снижение механической прочности соединительной ткани в этом случае
может являться основной причиной образования гематом, не связанной с локальной воспалительной реакцией.
Заключение
Показана связь между аллельными вариантами гена IL-10 и формированием неполноценного рубца матки после КС. Аллель TА гаплотипа IL-10: (-819 C>T и -592 C>A) статистически значимо ассоциирован с развитием воспаления и неоангиогенеза в ткани рубца. Есть основания полагать, что в формировании неполноценного рубца можно выделить два различных патогенетических процесса: один из них реализуется через локальные воспалительные реакции и морфологически проявляется воспалительной инфильтрацией и неоангиогенезом, в то время как второй путь патогенеза не связан с воспалением и морфологически проявляется дезорганизацией соединительной ткани, приводящей к
появлению гематом.
