Беременность – сложный и многогранный процесс, обеспечивающий как рост и развитие эмбриона, плода, так и взаимное сосуществование двух организмов [1]. Развитие вспомогательных репродуктивных технологий с донацией яйцеклеток показало, что эти организмы могут быть и полностью генетически чужеродны [2]. Изменения материнского организма обеспечивается плацентарными структурами [3]. Давно известное явление депортации трофобласта, и существование внеплацентарного трофобласта в последнее время привлекает большое внимание исследователей, как биологов так и врачей [4]. С одной стороны, развитие современных технических средств позволяет использовать это явление в диагностическом процессе, выделяя трофобластические элементы из крови матери [5]. С другой стороны депортация трофобласта является своего рода естественной моделью взаимного существования двух генетически различных систем, позволяющей исследовать функции не только трофобласта и плаценты, но и открывать новые горизонты в трансплантологии, иммунологии, онкологии и клеточной терапии [6].
Естественные свободные трофобластические структуры
Впервые способность трофобласта существовать за пределами плаценты описана G. Schmorl в 1893 году, который нашел фрагменты трофобласта (plazentarzellen) в легких 14 из 17 женщин, умерших от эклампсии, что автор считал одним из проявлений эклампсии. Это были многоядерные синцитиальные фрагменты, овальной формы, эмболизировавшие сосуды, содержавшие 5-15 ядер [7]. Позже тем же автором были получены данные о присутствии подобных структур в аутопсийном материале, полученном от женщин, умерших от случайных причин [8]. Впоследствии подобные результаты были получены другими исследователями [9–11].
Было выяснено, что явление депортации трофобласта наблюдается при нормальной беременности, при этом элементы трофобласта обнаруживаются в маточных венах, начиная с 6–18 недель беременности [12, 13]. Впервые трофобластические структуры были выделены из периферической крови матери в 1982 году [14], их характеризовали как многоядерные фрагменты размером 12–14 мкм, диплоидные – 7 мкм и фрагменты клеток менее 5 мкм [15]. Количество трофобластических элементов в маточных венах после 6 недель беременности колеблется от 0,15 до 51,5 мл. В сутки в кровоток матери попадает около 105 трофобластов [11]; по мнению других исследователей это число может достигать 107 клеток в час [16]. Усиление депортации при преэклампсии остается дискутабельным [12].
Количество выделенных трофобластических структур, во многом определялось методами, которые использовали исследователи. Первые исследователи использовали гистологические методы, при этом удавалось обнаружить элементы трофобласта в большинстве случаев преэклампсий и менее половины случаев при случайных смертях [16–18]. При исследовании мазков крови в большинстве случаев удавалось обнаружить крупные фрагменты трофобласта в маточных венах и в не более трети случаев – в периферической или пуповинной крови [10]. При использовании современных методов исследования: проточной цитометрии, FISH-гибридизации, магнитного сортинга с различными антителами (P1, anti-H315, anti-H317, anti-18B/A5, anti-JMB2, FDO46B, FDO161G, FDO101X, CD16, anti-JMB2, anti-F71.1, anti-4H84, anti-A45-B/B3) трофобласты были обнаружены во всех источниках в большинстве случаев [19].
Количество клеток трофобласта максимально в крови, полученной из маточных вен, значительно меньше в пуповинной крови, еще меньше – в периферической крови матери [10, 15, 18].
Размеры и характер частиц трофобласта, попадающие в материнский кровоток различны. Их разделяют на фрагменты клеточного размера (cell-sized) и фрагменты размера нуклеиновых кислот (nucleid acid-sized) [12]. К первым относят синцитиальные агрегаты размером 20–200 мкм, которые содержат 2–50 ядер, могут быть как симпластом, так и отдельными клетками, часто оседают в сосудах легких и находятся в маточной вене; мононуклеарные цитотрофобласты, размером около 25 мкм; безъядерные цитоплазматические элементы, размером 2–10 мкм. Ко второй группе относят микрочастицы трофобласта, размером около 100 нм, экзосомы, размером менее 100 нм, фрагменты цитокератина и свободные фрагменты нуклеиновых кислот [12, 20].
Многоядерные фрагменты трофобласта по мнению ряда авторов могут быть конечным этапом жизненного цикла синцитиотрофобласта, результатом апоптотических изменений [21], эта гипотеза подтверждается тем, что при преэклампсии повышается как уровень апоптоза, так и количество депортированного трофобласта [18, 22]. Мононуклеарные клетки попадают в материнский кровоток как в результате апоптотического отшнуровывания, так и при процессах ремоделирования сприальных артерий, большая их часть имеет ворсинчатое происхождение [23]. Экзосомы и отдельные трофобластические молекулы ДНК, цитокератина или рецепторы являются результатом разрушения плацентарных структур и апоптоза, происходящего в плаценте и в уже депортированных структурах [8, 20].
Трофобластические структуры, отделившись от плаценты, попадают в маточные вены, нижнюю полую вену и легкие, где оседают в легочных капиллярах; большая их часть элиминируется в течение 3 дней, изредка – до 2 недель [9]. Элиминация трофобласта из организма, в первую очередь из легких, осуществляется за счет фагоцитов, «литического агента» и механизмов апоптоза, что предотвращает эмболизацию легких [23].
Срок пребывания производных трофобласта в организме вне беременности установлен отдельно разными группами исследователей и составляет до 49-65 суток для человека, кролика, крысы и мыши [24–26].
Функция депортированного трофобласта во время беременности окончательно не определена и связана с его свойствами. Выдвинуты гипотезы о низкой иммуногенности трофобласта, физиологической иммуносупрессии, толерантности [23]. Показано, что трофобласт способствует переходу иммунного ответа с Th1 типа, при котором синтезируются провоспалительные цитокины к Th2, при котором синтезируются противовоспалительные факторы, уменьшается количество натуральных киллеров, изменяется функция дендритных клеток и макрофагов [3]. Кроме того, ряд трофобластических факторов (хорионический гонадотропин, альфафетопротеин, половые гормоны) также влияют на Т, В, дендритные, тучные клетки и систему макрофагов [27]. Считается, что депортированый трофобласт играет роль в формировании физиологической иммуносупрессии при беременности и толерантности по отношению к плоду [23, 28]. Известно, что введение клеток донора перед трансплантацией увеличивает сроки выживания аллографта [24]. Показана способность депортированного трофобласта усиливать в макрофагах синтез противовоспалительных цитокинов и индоламиндиоксигеназы [29]. Подобными свойствами обладают и плацентарные экзосомы, оказывая иммуносупрессивное действие [30]. Внеплацентарный трофобласт имеет общие черты с плацентарным, не экспрессирует на своей поверхности антигены HLA I и II класса, но он иногда способен экспрессировать HLA – С и HLA – G, который участвует в развитии беременности [3]. Взаимодействие многоклеточных фрагментов с макрофагами приводит к усилению секреции противовоспалительного интерлейкина (IL) -10 и угнетению провоспалительных IL-1β [23]. Описана связь апоптотического плацентарного детрита с эндотелиальной дисфункцией при эклампсии, которая проявляется продукцией CAM-1 , IL-1β , 12, 16 , трофобластического фактора роста (TGF)-1β и формированием «нейтрофильных внеклеточных ловушек» [17].
Искусственные свободные трофобластические структуры
Свободные трофобластические структуры неоднократно создавались исследователями. Целью их воспроизводства были эксперименты по исследованию явлений депортации трофобласта, имплантации, межклеточных взаимодействий в плаценте, создание модели для тестирования лекарственных средств. Разработаны методы получения клеток из всех частей последа, клетки фенотипированы, характеризованы [6, 31]. Для эксплантов плаценты человека описаны морфологические, физиологические, биохимические характеристики [25]. При этом более активны экспланты, полученные из трофобласта первого триместра беременности. Сфероиды из трофобласта человека более близки к естественным, что позволяет с их помощью изучать процессы имплантации. При этом способы получения сфероидов весьма различны: культивирование на неадгезивной поверхности, роллерное культивирование, получение из эксплантов [12].
Микрочастицы трофобласта, размером от 200 до 600 нм были получены измельчением, перфузией культуры эксплантов и плаценты [17]. При этом частицы после измельчения индуцировали апоптоз в слое эндотелиальных клеток, а микрочастицы, полученные другими методами – нет. Наиболее распространенный метод выделения наночастиц трофобласта и экзосом – ультрацентрифугирование субстрата (например, сыворотки) в градиенте плотности, или иммуномагнитная сепарация. Получены наночастицы трофобласта, размером около 50 нм путем перфузии материнской поверхности плаценты [12, 23].
В ряде работ показано, что трофобласт может существовать в организме до 65 дней, при этом элиминируясь неспецифическими макрофагами, и не вызывая типичных для трансплантата воспалительных изменений [29, 32]. Отдельные исследователи отмечают повышение артериального давления после введения животным трофобластических клеток [33]. Отрицательное влияние на эндотелий и состояние животного более выражено при апоптотических или некротических изменениях в трофобласте [23]. Также показано, что при введении экспериментальным животным экстракта или сыворотки пуповинной крови концентрация в их крови альфафетопротеина и хорионического гонадотропина достигает максимума в первые сутки и определяется до 7-го дня, в то же время при введении эксплантов плаценты или культуры клеток плаценты их содержание достигает максимума на 3–4-й день, сохраняется до 28 суток, что соответствует гистологической структуре места трансплантации [1].
В последнее время структуры плаценты все больше привлекают внимание ученых и врачей, как источник стволовых клеток для лечения ряда заболеваний: инфаркт, инсульт, мышечная дистрофия, сахарный диабет, болезнь Крона и др. [34, 35]. Использование этого материала открывает широкие перспективы для клеточной терапии и аутобанкинга [6, 36, 37]. Ряд методов находятся уже на стадиях клинических исследований [35, 38, 39]. В то же время исследование трофобластических клеток позволяет глубже понять функцию плаценты и депортацию трофобласта. Мезинхимальные стволовые клетки плацентарного происхождения имеют ряд особенностей, делающих их удобным объектом для клеточной терапии. Это низкая иммуногенность, способность вызывать иммуносупрессию, высокая пролиферативная активность. Плацентарные клетки, экспрессирующие CD90, CD73 CD105, и CD 200 в системе in vitro обладают способностью к направленной дифференцировке, угнетают антиген- специфическую пролиферацию Т-клеток, реакцию гиперчувствительности замедленного типа, в системе in vitro улучшают течение экспериментального энцефаломиелита, индуцируют толерогенный иммунный ответ за счет дифференцировки дендритных клеток и угнетений Th1 иммунного ответа в пользу Th2 [40]. Показана клиническая эффективность применения эксплантов плаценты, экстракта плаценты и сыворотки плацентарной крови во вспомогательных репродуктивных технологиях, при бесплодии иммунного и эндокринного генеза, антифосфолипидном синдроме, климактерическом синдроме, сахарном диабете, стенокардии, пародонтозе, подагре [34, 41].
Учитывая тот факт, что инвазия и депортация являются естественными свойствами трофобласта, особое внимание уделяется онкологической настороженности при трансплантации как клеток, так и органов. Известно, что прогноз онкозаболеваний при беременности резко ухудшается [42]. Трофобластическая модель рака, сформулированная в 1902 году не потеряла своей актуальности и сегодня [43]. В соответствии с ней клетки трофобласта мигрируют в разные части эмбриона, ускользая из-под генетического контроля и могут давать начало опухолям. Хорионкарцинома в анамнезе у донора является абсолютным противопоказанием к трансплантации, риск ее последующего проявления у реципиента составляет более 90% со смертностью более 60%, что обусловлено необходимой послеоперационной иммуносупрессией [44]. Однако малигнизация и развитие трофобластической болезни предполагает генетические нарушения в клетках трофобласта или эмбриона в целом, наличие патологии беременности [45]. В доступной литературе не описано случаев онкопатологии при использовании клеток плаценты или экспериментах по депортации трофобласта. Было отмечено, что мезенхимальные клетки плаценты угнетают пролиферацию раковых клеток и могут быть даже использованы для лечения онкопатологии [46].
Диагностическое значение свободных трофобластических структур
Циркуляция в материнской крови трофобласта открывает широкие перспективы для неинвазивной пренатальной диагностики: с одной стороны, это генетическое исследование, с другой – исследование состояния плаценты и вероятности развития преэклампсии. Содержание плодовой ДНК в крови матери по данным различных авторов колеблется в широких пределах и составляет в среднем 7,7% общего содержания внеклеточной ДНК [47]. Метод неинвазивной пренатальной диагностики с использованием внеклеточной ДНК основан на выделении из периферической венозной крови матери плодовой ДНК центрифугированием в градиенте плотности с последующим использованием для полимеразной цепной реакции [48]. Метод применим с 10 недель беременности и позволяет проводить тест на отцовство, определять пол плода, наличие генетических аномалий, является высокоинформативным, точным и в ряде стран экономически выгодным по сравнению с существующими биохимическими и ультразвуковыми методами пренатального скрининга [5, 49, 50]. Информативность подобных методик для диагностики и установления степени тяжести преэклампсии не однозначно оценивается разными группами исследователей [19, 22], однако увеличение депортации некротических элементов трофобласта связывают с ухудшением прогноза, являясь одним из факторов повреждения эндотелия при данной патологии [17].
Заключение
Плацентарные структуры человека обладают рядом уникальных, характеризующих их особенностей: инвазия, гормональная функция, низкая иммуногенность, способность к иммуносупрессии, индукции толерантности и депортации. При этом депортированный трофобласт не является онкогенным, являясь естественной моделью трансплантации. Изучение его функции открывает перспективы в клинической диагностике генетических расстройств и состояния плаценты, в понимании процессов формирования толерантности при беременности, онкогенеза и имплантации. Мезенхимальные стволовые клетки, экспланты плаценты, плацентарные факторы могут эффективно применяться в клеточной и тканевой терапии, и в силу своей естественной тропности к органам репродуктивной системы особенно эффективны в лечении гинекологической патологии: бесплодия, эндокринных расстройств, аутоиммунных реакций.
