Изучению микробиоценоза и микрогеномики различных локусов организма человека в настоящее время уделяется огромное внимание ученых всего мира. На фоне ухудшения экологического состояния окружающей среды, нарастания социальных проблем, проблем в системе «здоровья нации» и широкого, чаще бесконтрольного применения различных фармакологических препаратов, в том числе и антибактериальных средств, влияющих на иммунный статус человека XXI века, происходят значительные изменения в эволюционно сложившихся взаимоотношениях «человек-микросообщество».
Научно-технический прогресс последних десятилетий, приведший к методологическому и техническому развитию научной мысли, помогли по-новому взглянуть на всю глубину и сложную взаимосвязь огромной экологической ниши симбиотических микроорганизмов, составляющих микробиотические системы организма человека. Микробных клеток, которые располагаются на поверхности и внутри тела человека, примерно в 10 раз больше, чем наших собственных клеток, и они в совокупности содержат примерно в 100 раз больше генов, что приводит к предположению, что люди и микробные симбионты представляют собой «сверхорганизм» [1]. Развитие инновационных технологий в медицине способствует широкому внедрению новых лабораторных методов диагностики дисбиотических состояний и фармакологической коррекции дисбаланса взаимоотношений в экологической системе «человек – микроорганизм».
Реализация геномно-протеомного типирования с привлечением протеомных исследований и изучение новых молекулярных механизмов с учетом данных бактериологического тестирования и метагеномного анализа, возможно, откроют новые знания о колонизационных механизмах формирования микробиоценозов.
Лактобактерии как представители микробиоценоза организма человека
Лактобактерии относятся к облигатным представителям микрофлоры человека, они в большей или меньшей степени присутствуют во всех открытых полостях организма и обладают полезными качествами, присущими нормальной микрофлоре. Лактобактерии (лактобациллы) являются превалирующими видами нормальной микрофлоры вульвы и влагалища (6-8 Lg КОЕ/мл отделяемого). Видовой состав лактобактерий весьма разнообразен, но изучение штаммовых свойств лактобактерий нельзя считать завершенным. До последнего времени, по данным большинства исследователей, преобладающим видом считались L. acidophilus [2, 3].
До сих пор не вполне ясно, кому принадлежит честь первооткрывателя этих бактерий. Одни исследователи склоняются к тому, что впервые это сделал Луи Пастер в 1857 г., другие – что Стамен Григоров в 1905 г., изучая айран, обнаружил этот вид бактерий. Гинекологи исторически называют лактобациллу «палочкой Додерлейна» в честь немецкого гинеколога A. Додерлейна, который описал ее в 1895 г.
Безопасность лактобактерий для здоровья человека является установленным фактом. Однако хотя они и считаются «полезной» флорой влагалища, но их обильный рост способен вызвать патологическое состояние (цитолитический вагиноз, лактобациллез) [4]. Представители рода Lactobacillus выявлены в качестве этиологических факторов развития сальпингита, цервицита, перитонита, эндокардитов, пневмоний, менингита, сепсиса и уроинфекций [5–7].
Лактобактерии представляют интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов, продуктов функционального питания, способов коррекции микробиотических нарушений, потому что, обладая многогранными биологическими свойствами, играют важную роль в обменных и регуляторных процессах организма человека. Дальнейшее изучение видовых и штаммовых различий лактобактерий в норме и патологии станет основой для отбора штаммов, наиболее перспективных в качестве пробиотических препаратов.
Молекулярно-генетическая характеристика лактобактерий
Фенотипическая характеристика представителей подвидов Lactobaccilus часто не коррелирует с генотипической классификацией, поэтому не является достаточной для установления их таксономического положения. В таких случаях, когда при идентификации традиционными микробиологическими методами организмы трудноотличимы, применение молекулярно-генетических методов для установления таксономического положения бактерий следует рассматривать как обязательную процедуру [8].
Среди этих методов молекулярной дактилоскопии полимеразная цепная реакция (ПЦР) DGGE представляет собой быстрый и надежный метод для выявления преобладающей микрофлоры в различных экологических нишах. Секвенирование генов 16S рРНК из различных образцов путем построения клон библиотеки произвели революцию в нашем понимании микробной систематики и ее разнообразия. Ставший доступным на сегодняшний день метод 454 пиросеквенирования благодаря углубленному секвенированию позволяет анализировать состав микробных сообществ [9–11].
Исследования последних десятилетий показали, что род Lactobacillus – это гетерогенная группа с нестабильной таксономией. В настоящее время ни одна из известных таксономических схем не получила общего признания, поэтому единая классификация лактобактерий в нашей стране не принята [8].
На основании данных исследования 16S рРНК проведена реорганизация генетической систематики, и некоторые виды лактобактерий, ранее включенные в род Lactobacillus, были реклассифицированы в роды Atopobium, Carnobacterium, Weissella, Oenococcus и Leuconostoc. И наоборот, вид P.dextrinicus рода Pediococcus были реклассифицированы в род Lactobacillus [34]. С помощью метода молекулярного анализа генома RAPD-PCR Du Plessis Dicks и соавт. в 1995 г. наглядно продемонстрировали дифференциацию вида L. acidophilus, L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri и L. johnsonii, которые ранее, вследствие сходства биохимического профиля, были идентифицированы и определялись как вид L. acidophilus [12].
В настоящее время считается, что видовой спектр вагинальных лактобактерий преимущественно представлен 4 видами: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri и Lactobacillus iners. Причем Lactobacillus iners только в последнее время стали культивировать и исследовать как вагинальную лактобактерию.
Основываясь на филогенетических и фенотипических различиях, Lactobacillus iners была отнесена к роду Lactobacillus и обозначена как Lactobacillus iners в CCUG 28746T. Сравнительный анализ гена 16S рРНК последовательности показал, что неизвестная бактерия была близкородственной L. delbrueckii, L. gasseri и L. johnsonii. При этом расхождение значений по 16S рРНК последовательности было более 4%, что дало право отнести ее к новому виду лактобактерии [13]. Геном L. iners является наименьшим из геномов лактобактерий, зарегистрированных на сегодняшний день. Геном L. iners содержит низкое (32,7%) соотношение цитозин + гуанин (CG), что аналогично родственным лактобактериям L. johnsonii (34,0%) и L. gasseri (35,3%) [14]. Возможно, сокращение генома произошло после отделения от линии лактобактерий L. johnsonii и L. gasseri, но рРНК кластеры были сохранены. Еще более поразительно, что в геноме L. iners выявлены 26 чужеродных генов и до 80% аминокислот, нехарактерных для рода Lactobacillus. Необходимость конкурировать с другими организмами, в том числе и с другими видами лактобактерий, возможно, стали причиной приобретения чужеродных генов L. iners, таких как адгезины и цитолизины. Изучение генома L. iners показало отсутствие специфических для лактобактерий адгезинов, а адгезия происходила благодаря консервативным доменам: фибронектин-связывающий белок (LINAB1_0564) и фибриноген-связывающий белок (LINAB1_0798) [15].
L. jensenii является еще одним из доминирующих видов, выделенных из отделяемого влагалища женщин. Он был впервые обнаружен при попытке провести сравнительный анализ воздействия молочной дегидрогеназы L.lichmannii. Хотя оба организма фенотипически оказались подобны, состав ДНК этого изолята (36,1±1,2% моль гуанин+цитозин) значительно отличается от состава ДНК L. lichmannii (50,8±0,5 моль гуанин+цитозин) [16].
Оптимизированные и вновь разработанные праймеры для индикации бактерий рода Lactobacillus на основе гена 16S рРНК: FLg, RLg I, RLg II легли в основу унифицированной комплексной схемы идентификации бактерий L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР [17].
Видовая структура лактобактерий влагалища
Впервые лактобактерии влагалища были изучены немецким гинекологом Альбертом Додерлейном, который предположил, что молочнокислые бактерии действуют как оборонительный барьер для предотвращения заселения другими бактериями половых путей. За более чем вековую исследовательскую историю было установлено, что у здоровой женщины репродуктивного возраста, несмотря на мутуалистический характер микроценоза влагалища, основными доминирующими представителями остаются лактобактерии, которые обусловливают степень антимикробной защиты влагалища против как экзогенных, так и эндогенных инфекционных агентов, вызывающих восходящие и системные инфекционные заболевания женской половой сферы [18]. Однако, несмотря на свой внутренний антимикробный потенциал, у большинства женщин, как мы часто наблюдаем, лактобактерии не в состоянии удерживать господство в микробиоценозе, вследствие чего происходит увеличение роста оппортунистических УПМ во влагалище. Чаще всего это происходит за счет увеличения анаэробных полимикробных видов при бактериальном вагинозе, или, реже, с увеличением количества аэробных микроорганизмов, в том числе стрептококков группы В, и колиформных бактерий, таких как E. coli [18–20]. Потери аутоштаммов лактобактерий сильно предрасполагают к развитию урогенитальных инфекций, которые при беременности являются одной из основных причин хориоамнионита и преждевременных родов. Эти осложнения тесно связаны с неонатальной заболеваемостью и смертностью во всем мире [18, 19].
Механизмы, приводящие к потере свойств, определяющих господство лактобактерий, остаются в значительной степени неизвестными и, следовательно, остается непонятным, по какой причине лактобактерии теряют преимущественное положение, позволяя другим микроорганизмам размножаться и тем самым вытеснять аутоштаммы лактобактерий из основного состава микробиоценоза влагалища. Неизученным также остается вопрос о «межличностных» взаимоотношениях различных видов лактобактерий, входящих в состав микробиоты влагалища, их взаимное сосуществование, а также устойчивое доминирование отдельных штаммов лактобактерий при различных инфекционных состояниях влагалища.
В 2007 году H. Kiss и соавт. изучали вагинальные образцы 126 клинически здоровых беременных шведских женщин (Nugent 0-3) в период с 11 до 14 недель беременности с использованием видо-специфической ПЦР. Автор определил наличие восьми различных видов лактобактерий. Лидирующими явились L. gasseri (26,4%), L. crispatus (23,6%), L. jensenii (19,4%), L. rhamnosus (9,7%). В данном исследовании не были обнаружены L. acidophilus и L. iners [21].
В 2007 г. Tamrakar с соавторами исследовали 98 здоровых беременных японских женщин в возрасте от 5 до 36 недель беременности с использованием метода видо-специфической ПЦР и выявили наличие четырнадцати видов лактобактерий в вагинальных образцах. Наиболее часто встречающимися видами были L. crispatus (61,2%), L. jensenii (29,6%), L. gasseri (33,7%), L. iners (39,8%). В исследовании не были обнаружены L. delbrueckii, а вид L. acidophilus не был включен в качестве целевого исследования [22].
В 2011 г. были опубликованы результаты исследования микробиоты влагалища 140 клинически здоровых беременных мексиканских женщин на различных сроках гестации. В вагинальных образцах были обнаружены четыре вида лактобактерий: преобладали L. acidophilus (78%), затем L. iners (54%), L. gasseri (20%) и L. delbrueckii (6%) [23].
Исследования, проведенные в этой области, показывают широкое варьирование результатов видового спектра влагалищных лактобактерий в зависимости от конкретных групп обследованных женщин. Возможно, это связано с бытовыми условиями, кулинарными пристрастиями, поведенческими факторами, привычками и обычаями в различных этнических популяциях. Для получения большей информации о видовом спектре влагалищных лактобактерий необходимы исследования видового состава лактобактерий с использованием методик (секвенирование, масс-спектрометрия), дающих возможность исследовать всё разнообразие видов лактобактерий с участием женщин различных этнических групп [24, 25].
Лабораторные методы идентификации лактобактерий в оценке состояния микробиоты влагалища
В мировой медицинской практике для оценки состояния микробиоты влагалища широко используют две системы координат – критерии Ричарда Амселя и соавт. (1983) и критерии Роберта Нугента и соавт. (1993).
Оценка с учетом критериев Amsel является больше клинической, чем лабораторной, и её проводит врач акушер-гинеколог на амбулаторном приеме. Невысокая чувствительность критериев Amsel и наличие бессимптомных форм бактериального вагиноза (БВ) заставило искать другие методы и критерии подтверждения диагноза.
В конце 80-х годов C. Spiegel предложил использовать балльную систему для диагностики БВ с учетом соотношения морфотипов лактобацилл и вагинальной гарднереллы. Однако система не прижилась и только в 1991 году R.P. Nugent и соавт. предложили свои лабораторные критерии диагностики БВ (Nugent’s Diagnostic Criteria for Bacterial Vaginosis), которыми до сих пор широко пользуются в мировой медицине [26, 27].
Хотя критерии Amsel являются принятым «золотым стандартом» для клинической диагностики БВ, балльная оценка, основанная на различие бактериальных морфотипов, разработанная Nugent и соавт. получила широкое признание как скрининговая система [28].
Скрининговые системы оценки микробиоты были подвергнуты критике за то, что являются глубоко субъективными методами с низкой чувствительностью и специфичностью [29]. Кроме того, система скрининга Nugent была первоначально создана для использования в диагностике БВ при беременности. Стоит также отметить, что критерии Amsel и Nugent оценивают состояние БВ, но с помощью этих методик нельзя изучить другие инфекционно-патологические состояния влагалища, например, такие как аэробные и кандидозные вагиниты.
Для российского здравоохранения эти диагностические критерии чрезвычайно привлекательны: для их внедрения не нужны большие финансовые вливания и никакие другие вложения, ведь красить мазок из влагалища по Граму умеют во всех лабораториях. Но большим его недостатком является субъективизм, а также зависимость результатов от квалификации врача. Существуют и косвенные причины недостоверности результатов: качество взятия мазков, правильность окраски препаратов, разрешающая способность оптики, которая дает возможность выявлять микроорганизмы при их количестве в биоматериале выше 5 lg КОЕ/мл [30].
Микроскопический метод в ряде случаев может быть рекомендован только как начальный скрининговый этап диагностики и для выбора тактики назначения дальнейших лабораторных анализов. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования по улучшению методологии проведения микроскопического метода. Одним из таких путей, возможно, окажется создание цифровой библиотеки слайдов с превосходным качеством изображения различных морфотипов. Это облегчит оценку мазков, окрашенных по Граму – они могут быть детально проанализированы и сопоставлены с цифровыми изображениями с использованием компьютерных технологий [31].
В 2011 году в ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России была разработана и зарегистрирована новая медицинская технология оценки состояния микроценоза влагалища А.С. Анкирской и В.В. Муравьевой [30], которая включает в себя комплексную оценку с учетом микроскопии (модификация критериев R.P. Nugent) и результатов культуральной диагностики. Оценка состояний микробиоты проводится с учетом состояния вагинального эпителия, лейкоцитарной реакции, состава микробиоты, а также выделенных микроорганизмов в посеве. Технология дает врачу-клиницисту информацию о состоянии микробиоты влагалища и чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам.
Более века морфологические свойства оставались единственным критерием родовой идентификации лактобактерий. Сегодня мы можем утверждать, что такая диагностика недостаточна и недостоверна, с учетом морфологического разнообразия этих бактерий, а также с тем обстоятельством, что во влагалище, кроме лактобактерий, могут присутствовать и другие грамположительные палочки (бифидобактерии, клостридии, коринебактерии, актиномицеты, листерииС конца XX века с широким внедрением в практику микробиологических лабораторий бактериологических анализаторов появилась возможность видовой идентификации культивируемых лактобактерий на основе фенотипических свойств по биохимической активности [3, 32]. Опыт работы в этой области показывает, что данная методика трудоемка, длительна и малодостоверна [32].
Изучению микробиоты влагалища посвящено много работ. В большинстве из них используют метод ПЦР в «реальном времени» [33–35] в то время как классическое культуральное исследование уходит на второй план. Такая тенденция связана с высокой стоимостью, трудоемкостью микробиологических исследований, слабым внедрением новых технологий в клиническую микробиологию, а также отсутствием единого методологического подхода.
Для молекулярно-генетического типирования лактобактерий используются ряд методов – это метод молекулярного анализа генома (RAPD), мультиплексной ПЦР, риботипирование с последующим сравнением с рибосомной базой данных (RDP) и секвенирование бактериальных генов 16S рРНК.
Безусловно, метод ПЦР позволяет быстро идентифицировать микроорганизмы в клиническом образце без выделения чистой культуры, однако на сегодняшний день этого часто оказывается недостаточно для того, чтобы быстро установить этиологию заболевания, так как еще нет разработанных и сертифицированных комплексных панелей, учитывающих широкое разнообразие возможных возбудителей из группы УПМ. Также отсутствует возможность определить антибактериальную чувствительность выявляемых микроорганизмов и другие их штаммовые различия. Поэтому задачи, связанные с разработкой и внедрением в рутинную практику микробиологических лабораторий новых эффективных подходов к идентификации, характеристике и типированию клинически-значимых патогенов, являются актуальными и своевременными [36, 37].
В последние десятилетия возросли требования клиницистов к качеству и срокам выполнения микробиологических исследований. Внедрение измерительных приборов и тест-систем нового поколения с использованием методов молекулярного анализа и реализующих принципы «быстрой бактериологии» первостепенно в концепции развития микробиологической службы.
Одним из таких направлений является внедрение принципиально нового метода время-пролетной масс-спектрометрии, который позволяет проводить точную идентификацию более 4000 видов микроорганизмов, сокращать сроки идентификации на 24–72 часа и что особо привлекательно – методика почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. Использование специальных условий позволяет регистрировать масс-спектры молекул белковой природы, которые хорошо представлены в клетке в количественном соотношении и характеризуются определенной изменчивостью. Анализ микроорганизмов с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии является на данный момент, самым бурно развивающимся направлением. Изучение с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии видового спектра лактобактерий влагалища у женщин репродуктивного возраста показало, что оно отличается широким разнообразием и представлено 21 видом, лидирующими из которых являются L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri [38].
Внедрение метода MALDI TOF мaсс-спектрометрии в практическую работу микробиологических лабораторий является инновационным и открывает новые возможности диагностики микрогенома различных локусов организма.
