На сегодняшний день стало очевидно, что теория, созданная в начале 1850-х годов и гласящая, что плацента является непреодолимым барьером для большинства белков и химических веществ между плодом и матерью, неверна. Известно, что генетическая информация плода может представлять собой способ идентификации и верификации генетических аномалий, а также выделения определенных патологий, связанных с матерью. С этой целью применение методов молекулярной биологии в неинвазивной диагностике осложнений беременности оказалось ценным инструментом в генетическом скрининге и при оценке патологических состояний, в отличие от инвазивных методов, которые обладают высокой стоимостью и связаны с большими рисками.
Внеклеточная ДНК плода (далее – cff-DNA) является молекулярным биомаркером, который полностью изменил неинвазивную пренатальную диагностику, или скрининг. Он был открыт в 1997 г. Y.M. Lo и соавт., которые доказали наличие последовательности ДНК плода в материнской плазме и сыворотке [1]. Последующие исследования показали наличие более высоких уровней ДНК плода в плазме беременных женщин по сравнению с ДНК плода, выделенной из материнской крови [2]. Основываясь на данных выводах, в качестве метода обнаружения cff-DNA стали использовать количественную полимеразную цепную реакцию; при этом дальнейшие исследования сфокусировались на клиническом применении данного маркера с определенным акцентом на прогнозировании осложнений беременности, а также на пренатальной диагностике и скрининге генетических нарушений плода [3, 4]. Последний подход заслужил значительное внимание, так как он имеет ряд преимуществ по сравнению с методом выделения исходных клеток плода, таких как скорость, надежность, низкая стоимость и меньшее количество трудоемких протоколов [3].
Точное происхождение cff-DNA неизвестно. Предполагают, что cff-DNA главным образом происходит из плаценты, о чем свидетельствует быстрое выведение ДНК плода из крови матери после родов, в отличие от большинства клеток плода, сохраняющихся в крови матери спустя недели после родов [3]. Отсутствие циркулирующей ДНК плода в случае плацентарного мозаицизма подтверждает происхождение cff-DNA из плаценты, а не самого плода [3, 4]. Более поздние исследования показали, что основным источником cff-DNA являются клетки трофобластического происхождения, которые высвобождаются из синцитиотрофобласта в виде синцитиальных узелков. Эти клетки претерпевают апоптоз, и нуклеиновые кислоты, содержащиеся внутри, в том числе ДНК и РНК, высвобождаются в материнский кровоток. В дополнение к апоптотическим механизмам, происходящим в результате нормального старения синцитиотрофобласта, случайная поломка или некроз также могут быть одной из причин высвобождения бесклеточных нуклеиновых кислот. Идея о том, что апоптотические или некротические пути деградации синцитиотрофобласта могут изменять количество ДНК плода, представляет значительный интерес [5].
В последнее время определение уровня cff-DNA начинает использоваться в пренатальном скрининге эмбриональных анеуплоидий, в частности синдрома Дауна [6, 7]. В данном обзоре мы в большей степени остановимся на связи cff-DNA и таких патологических изменений во время беременности, как преэклампсия (ПЭ), внутриутробная задержка роста плода (СЗРП) и преждевременные роды (ПР).
ПЭ представляет собой патологическое состояние, которое возникает во время беременности, характеризуется гипертензией, протеинурией и отеками и наступает во второй половине беременности. На сегодняшний день нет ни одного достоверного параметра, который можно использовать для прогнозирования развития ПЭ. Таким образом, большое количество исследований сосредоточено на разработке новых методов в этой области. В различных исследованиях сравнивались уровни cff-DNA при беременности, в дальнейшем осложненных ПЭ. Исследователи пытались сделать выводы о степени причастности cff-DNA к развитию осложнений. Спустя два года после открытия cff-DNA Y.M. Lo и соавт. в 1997 г., в небольшой группе из 20 женщин с ПЭ те же исследователи показали, что уровни cff-DNA были увеличены в 5 раз по сравнению с группой контроля [8]. Эти результаты были подтверждены более поздними исследованиями, в том числе T.N. Leung и соавт. [9] и X.Y. Zhong и соавт. [10], в которых было отмечено примерно одинаковое увеличение cff-DNA у женщин с ПЭ [8–10]. Также стоит отметить, что уровень cff-DNA, по-видимому, увеличивался до появления клинических симптомов. R.J. Levine и соавт., опираясь на эти выводы, провел широкое исследование, включившее группу из 120 беременных женщин с ПЭ и такого же числа в группе контроля, и наблюдал двух- и пятикратное увеличение уровня cff-DNA у женщин с данным осложнением [11]. Кроме того, было отмечено двухфазное повышение уровня cff-DNA в сыворотке крови у женщин с ПЭ, которых наблюдали между 17-й и 28-й неделями беременности, а также за 3 недели до появления клинических симптомов [11]. Повышенные уровни cff-DNA у женщин с ПЭ были проверены с использованием второй методики обнаружения, основанной на количественной оценке последовательности DYS14 вместо таргетного гена SRY [12]. Было показано увеличение уровней cff-DNA до 10 раз по сравнению с контрольной группой [12]. Изначально считалось, что сочетание усиленного выделения ДНК из патологически развивающейся плаценты и сниженного клиренса cff-DNA вследствие нарушения функции печени и почек связано с повышением уровня cff-DNA [10, 11].
В отличие от данных вышеупомянутых исследований, в 2007 г. A. Crowley и соавт. продемонстрировали фактическое отсутствие разницы в уровнях cff-DNA в группах с ПЭ и группой контроля, измеряя количество гена SRY [13]. Эти результаты были подтверждены другими исследованиями, демонстрирующими, что уровень cff-DNA значительно не отличался при нормально протекающей беременности и беременности, осложненной ПЭ [14, 15].
Предыдущее исследование показало, что уровень cff-DNA в сыворотке был выше у женщин с ПЭ по сравнению с группой контроля в промежутке от 17 до 20 недель беременности; однако эти уровни существенно не отличались от контроля на ранних сроках беременности (13–16 недель) [11]. S. Sifakis и соавт. [16] показали, что уровень cff-DNA увеличивался в раннем гестационном периоде (11–13 недель) у беременных женщин, которые затем страдали тяжелой ПЭ на более поздних сроках; в частности, у женщин с поздней (мягкой) ПЭ, уровень cff-DNA был аналогичен уровню у женщин с нормально протекающей беременностью [16]. Кроме того, повышение уровня cff-DNA не было столь велико, как отмечалось в других исследованиях [8–11], так как авторы использовали более чувствительный метод количественной оценки последовательности DYS14. Разница в результатах в последнем исследовании могла произойти из-за нарушений перфузии плаценты, что вызывает оксидативный стресс и апоптоз на ранней стадии до появления клинических симптомов. В противоположность этому, R.J. Levine и соавт. предположили, что апоптоз трофобласта происходит вторично в ответ на гипоксию, которая требуется для дифференцировки плаценты в первом триместре, а уровень cff-DNA остается стабильным на ранних сроках беременности при ПЭ [11]. A. Scharfe-Nugent и соавт. предположили, что cff-DNA имеет провоспалительное действие, а быстрое возрастание его уровня во время беременности может играть роль сигнала об опасности для матери, означающего, что клетки плода гибнут [17]. Это было продемонстрировано на BALB/с мышах путем измерения уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6), которое проводили после внутрибрюшинного введения cff-DNA. Кроме того, этот эффект оказался зависимым от Toll-подобного рецептора-9 (TLR-9), так как было показано, что TLR-9(-/-) мыши были защищены от резорбции плода и развития воспаления [17].
Таким образом, данные о роли повышения уровня cff-DNA при ПЭ противоречивы [11, 16]. Тем не менее, сформировано общее мнение, подтвержденное большим количеством экспериментальных результатов, что уровень cff-DNA увеличивается до развития симптомов патологического состояния и может быть использован в качестве прогностического маркера при ПЭ, по крайней мере, при тяжелой ПЭ и ее раннем начале. Механизмы оказались более сложными, чем предполагалось ранее, и включают в себя сочетание путей апоптоза, гипоксии и воспаления, что требует проведения дальнейших исследований. Кроме того, ПЭ часто ассоциирована с CЗРП и ПР.
CЗРП характеризуется нарушением внутриутробного роста плода и ассоциировано с перинатальной заболеваемостью и смертностью так же, как сердечно-сосудистые заболевания у взрослых людей [18]. Хотя считается, что ряд различных механизмов приводят к развитию CЗРП, плацентарная недостаточность является одной из лидирующих причин. Исследований, в которых изучали зависимость возникновения СЗРП и уровня cff-DNA, меньше, чем посвященных ПЭ. В исследовании 2003 г. A. Sekizawa и соавт. рассмотрели вопрос об уровне cff-DNA при беременностях, осложненных СЗРП. Было обнаружено, что уровни cff-DNA при беременности, осложненной СЗРП, были равны уровню в группе контроля, хотя исследование включало только 9 случаев СЗРП и 20 случаев в группе контроля [19]. В более позднем исследовании в 2006 г. M. Smid и соавт. продемонстрировали повышенный уровень cff-DNA у плода с СЗРП [20]. Эти выводы были подтверждены еще более поздними исследованиями M.S. Alberry и соавт. [21] и Аль Nakib и соавт. [22], которые рассматривали большие выборки по сравнению с A. Sekizawa и соавт. в 2003 г. [19]. Уровень cff-DNA был значительно выше при беременностях, осложненных СЗРП, чем при нормально протекающих [21, 22], что частично было обусловлено плацентарной недостаточностью [22].
Преждевременными считаются роды, произошедшие до 37 недели беременности. Это связано с преждевременным созреванием шейки и разрывом плодных оболочек. Данное состояние является главной причиной смерти в неонатальном периоде и дальнейшей инвалидности [23]. Предполагают участие нескольких этиологических факторов в развитии данного состояния, в том числе недостаточное кровоснабжение трофобласта [24–26].
Попытки использования cff-DNA в качестве прогностического биомаркера гипоксии плаценты предпринимались во многих работах последних лет. Предварительное исследование I. Hoesli и соавт. в 2002 году не показало значимой разницы в числе эритробластов у 47 беременных с преждевременным началом схваток на 20-й и 34-й неделе беременности и группой контроля [24]. В 2005 г. A. Farina и соавт. показали повышение уровня cff-DNA в сыворотке матери в группе пациенток с высоким риском спонтанного преждевременного родоразрешения путем самопроизвольных родов или преждевременного разрыва плодных оболочек [25]. С другой стороны, S. Illanes и соавт. продемонстрировали отсутствие существенной зависимости между уровнем cff-DNA с 22-й по 24-ю неделю беременности и гестационным возрастом недоношенного ребенка, что подтвердило гипотезу о том, что уровень cff-DNA не может предсказать ПР у женщин с укорочением шейки матки [26]. Данные, полученные A. Farina и соавт., не противоречат результатам недавнего исследования, в котором уровень cff-DNA был использован в качестве предиктора ПР в общей выборке из 1316 женщин [27]. Статистически значимая разница наблюдалась между уровнем cff-DNA выше 95-го центиля, измеренного рутинным генотипированием по RНD на 25-й неделе беременности и последующим спонтанным родоразрешением с особенно значимой взаимосвязью при родах на сроке до 34 недель [27]. В меньшей выборке из 60 беременных, в том числе 30 пациенток с угрозой ПР, средние уровни cff-DNA были примерно в 6 раз выше в группе с наличием патологии гестационного процесса по сравнению с контрольной группой [28]. Кроме того, M.S. Quezada и соавт. [29] измеряли фракцию cff-DNA в общей сложности у 3169 беременных на 10–19-й неделях беременности, среди которых было 103 беременных, родивших на сроке до 37 недель, 21 пациентка, родившая на сроке менее 34 недель и 82 родивших в срок между 34-й и 37-й неделями. Авторы не обнаружили никаких существенных различий между группой с ПР и группой контроля [29]. Наиболее убедительным является отчет, предполагающий вероятный механизм взаимосвязи между ПР и уровнем cff-DNA, который был представлен в исследовании A. Scharfe-Nugent и соавт. В этом исследовании авторы предположили, что cff-DNA играет роль провоспалительного фактора и способен активировать ядерный фактор (NF)-κB через деградацию IκB, в результате чего производится провоспалительный ИЛ-6 в мононуклеарных клетках периферической крови человека [17]. ПР были индуцированы у мышей после внутрибрюшинного введения ДНК плода на 10–14 неделях беременности, в то время как у TLR9(-/-) мышей такой эффект не наблюдался, что позволило выделить TLR9 как потенциальную мишень для терапевтического воздействия при риске ПР [17].
Принимая во внимание имеющиеся данные, остается спорным вопрос о том, предшествует ли повышение уровня cff-DNA в случае ПР клиническому событию и может ли cff-DNA использоваться в качестве суррогатного прогностического маркера. Общепризнано, что cff-DNA высвобождается в результате раннего нарушения плацентарного барьера до начала родовой деятельности [25]. Однако в большинстве случаев повышенный уровень cff-DNA является, вероятно, следствием другого процесса, инициирующего начало родовой деятельности, а не предиктивным маркером данной патологии [30]. В соответствии с этим выводом недавнее исследование, проведенное L.S. Poon и соавт., показало, что уровни cff-DNA матери и плода изменялись за счет влияния матери, хотя по скорректированным данным в 20 случаях спонтанного преждевременного родоразрешения уровень значительно не отличался от такового у 1805 здоровых беременных [14].
cff-DNA был рассмотрен в качестве суррогатного биомаркера при других патологиях течения беременности помимо ПЭ, СЗРП и ПР. Vora и соавт. сообщили о корреляции между индексом массы тела и уровнем cff-DNA у 16 женщин с ожирением и 14 женщин с низкой массой тела, по сравнению с 10 беременностями из группы контроля. Предположили, что эта связь может отражать увеличение некроза адипоцитов и стромы сосудов, встречающееся при ожирении [31]. Это было подтверждено экспериментами in vitro, в которых стромальные клетки сосудов показали повышенную экспрессию белка каспазы-9 и каспазы-3. Предположили, что у беременных с ожирением процесс ремоделирования жировой ткани может привести к увеличению cff-DNA [32]. Уровень cff-DNA также исследовался у беременных с предлежанием плаценты. Полученные результаты показали, что на 15–28-й неделях беременности концентрация гиперметилированного RASSF14A была значительно выше в группе с наличием патологии (n=14) по сравнению с группой контроля (n=161) [33]. Кроме того, cff-DNA, по-видимому, играет важную роль при развитии рвоты беременных в качестве прогностического маркера проявления клинических симптомов. Как и в предыдущем исследовании, концентрация cff-DNA была значительно выше у 16 женщин, страдающих от данного состояния (диапазон значений 21,6–311,2 геномные эквиваленты/мл) по сравнению с 23 женщинами с нормально протекающей беременностью (диапазон значений 6,6–59,6 геномные эквиваленты/мл) [34]. Та же группа исследователей опубликовала краткий отчет через два года, подтверждая вышеупомянутые выводы в большем объеме выборки из 157 пациенток в группе контроля и 45 пациентов в группе с наличием патологии [35]. В этом исследовании было обнаружено, что уровень cff-DNA значительно выше (примерно в 2,5 раза) в случаях с тяжелой формой по сравнению с мягкой и умеренной формами данного состояния (1,26 и 1,6-кратное увеличение) [35]. Предполагается, что причиной этого могла стать гиперактивация материнской иммунной системы, которая ответственна за наступление рвоты беременных, в то время как иммунотолерантность матери только формируется. Это, в свою очередь, может привести к врастанию трофобластов из плаценты в миометрий [35].
Заключение
Открытие эмбриональных клеток и cff-DNA совершило революцию в области неинвазивной пренатальной диагностики и открыло новые возможности в области акушерских исследований. Обнаружение cff-DNA путем количественной полимеразной цепной реакции проводится легко, быстро и недорого, и таким образом обладает преимуществом перед рядом старых методик, включая выделение клеток плода. Хорошо известно, что повышение уровня cff-DNA может быть использовано в качестве прогностического маркера для ранней диагностики патологических состояний, связанных с беременностью, таких как ПЭ, СЗРП, ПР, предлежание плаценты и др. Существуют противоречивые данные, свидетельствующие о том, что уровень cff-DNA может увеличиваться на ранних стадиях патологических изменений, а впоследствии уменьшаться по мере прогрессирования патологического состояния. Несмотря на это несоответствие, большинством исследователей принято, что уровень cff-DNA увеличивается до начала проявления клинических симптомов осложнений беременности. Механизмом действия, предположительно, является сочетание апоптоза, апонекротических и воспалительных явлений, которые проявляются в ходе развития плаценты.
Таким образом, требуются дальнейшие более глубокие исследования для выяснения путей регулирования высвобождения cff-DNA и его взаимосвязи с осложнениями беременности. Представленные в данном обзоре результаты показывают, что cff-DNA следует рассматривать в качестве перспективного метода неинвазивного скрининга и ранней оценки тяжелых осложнений беременности.
