Перинатальный период является ключевым в определении здоровья человека. Перинатальная медицина в настоящее время на той лишь стадии развития, когда осложнения диагностируются при появлении клинической симптоматики и часто не существует методов прогнозирования и первичной профилактики. Более того, большинство акушерских синдромов характеризуются длительным субклиническим периодом и поздней клинической манифестацией. Назрела острая необходимость в новых методах прогнозирования, профилактики и ранней диагностики данных состояний.
Осложнения беременности, такие как преэклампсия (ПЭ), преждевременные роды (ПР) и задержка роста плода (ЗРП), входят в группу больших акушерских синдромов. В то время как точная причина развития данных синдромов не ясна, предполагается, что центральную роль в их развитии играет плацентарная дисфункция или, иначе говоря, плацентарная недостаточность. Центральное место в развитии плацентарной недостаточности принадлежит нарушению инвазии цитотрофобласта, неполной трансформации спиральных артерий, приводящие к повышенной резистентности в сосудах плаценты и, как следствие, к сниженной маточно-плацентарной перфузии [1]. В настоящее время патофизиологические механизмы развития осложнений беременности активно изучаются на молекулярном и клеточном уровне.
С момента обнаружения клеток плода в кровотоке матери началось изучение механизмов трансмиссии плодовых зародышевых клеток, что позволило в дальнейшем использовать эти клетки в неинвазивной пренатальной диагностике [2]. В последующем, многообещающим событием в отношении пренатальной диагностики осложнений беременности стало обнаружение в 1997 г. Lo и соавт. последовательностей плодовой фракции внеклеточной ДНК (пДНК) в материнской плазме и сыворотке крови [3].
Общая внеклеточная ДНК (оДНК) в крови беременной представлена двумя фракциями – материнской и плодовой. Возник повышенный интерес у различных исследователей в отношении пренатальной диагностики генетических заболеваний плода на основании определения пДНК [4]. В последующих исследованиях было продемонстрировано, что основным источником пДНК являются подвергающиеся апоптозу клетки трофобласта. Вследствие апоптоза нуклеиновые кислоты, включая РНК и ДНК, попадают в кровоток женщины [5]. Данное заключение подтвердилось в исследовании Lo и соавт. (1999) при определении пДНК в течение 120 минут после родоразрешения. Было обнаружено, что 50% пДНК элиминируется из материнской крови в течение 4–30 минут после родов, а спустя 120 минут – практически не обнаруживается [6]. Помимо апоптоза, который является результатом «старения» синцитиотрофобласта, одной из причин высвобождения свободных нуклеиновых кислот могут быть случайные поломки и некроз. На основании ряда исследований было обнаружено, что осложнения беременности, ассоциированные с плацентарной дисфункцией, такие как ПЭ и ЗРП, сопровождаются повышенной концентрацией пДНК в материнской плазме крови [7, 8].
Это заключение явилось основополагающим в дальнейших исследованиях.
В данной статье, не затрагивая вопросы пренатальной диагностики нарушений развития плода, мы рассмотрели использование пДНК в качестве маркера, прогнозирующего осложнения беременности, ассоциированные с плацентарной дисфункцией.
Внеклеточная ДНК плода и преэклампсия
Одним из механизмов развития ПЭ является нарушение дифференцировки трофобласта вследствие патологии плацентации.
Спустя два года после обнаружения пДНК в материнской крови та же группа авторов продемонстрировала 5-кратное увеличение концентрации пДНК у женщин с ПЭ по сравнению с нормой [9]. Главным наблюдением явилось обнаружение повышения концентрации пДНК в плазме крови женщины до появления первых клинических симптомов заболевания. Следуя этому заключению, проведено исследование, включающее 120 женщин с ПЭ и 120 женщин без признаков заболевания, в котором наблюдался 2–5-кратный подъем уровней пДНК [10]. Более того, продемонстрировано двухфазное повышение данного маркера – между 17 и 28 неделями гестации, а также за 3 недели до развития клинических симптомов заболевания. Однако в ряде исследований было продемонстрировано отсутствие корреляции между пДНК на ранних сроках беременности (в 11–13 недель) и до 32 недель и развитием ПЭ [11, 12].
Sifakis и соавт. (2009), проанализировав концентрацию пДНК у 44 женщин с ПЭ, заключили, что пДНК при сроке беременности 11–13 недель у женщин с последующим развитием ранней ПЭ существенно выше, чем в группе контроля [13]. Кроме того, концентрация пДНК в 11–13 недель при развитии поздней ПЭ и нормальном течении беременности не различается [13].
Следует отметить, что в качестве маркеров определения внеклеточных фрагментов пДНК были использованы SRY и DYS-14 локусы Y-хромосомы, которые представлены в крови женщины с плодом мужского пола. Другим маркером пДНК являлся RhD ген в крови RhD-отрицательных женщин с RhD-положительным плодом. Использование данных методов ограничивает выборку по полу и резус-принадлежности матери и плода, что не позволяет исключить возможность получения ложноотрицательных результатов.
Позднее были обнаружены эпигенетические различия между материнской и плодовой фракцией внеклеточной ДНК. В результате поисков эпигенетических маркеров клеток плода Chan и соавт. (2006) продемонстрировали, что промотор RASSF1A гена гипометилирован в клетках крови матери, но гиперметилирован в плаценте [14]. Следовательно, методом полимеразной цепной реакции стало возможным определение гиперметилированных RASSF1A генов пДНК после селективного разрушения гипометилированной ДНК матери (мДНК) при помощи метил-чувствительных ферментов – ДНК-рестриктаз. Данный метод позволяет определить концентрацию пДНК в материнской плазме крови у всех беременных независимо от пола плода и резус-принадлежности. После описания данной методики Tsui и соавт. (2007), проанализировав концентрацию оДНК и пДНК у 10 женщин с ПЭ и 20 женщин с неосложненным течением беременности в третьем триместре, первыми сделали вывод о возможности использования гиперметилированных RASSF1A генов, как потенциальных маркеров ПЭ [15]. В дальнейшем, в ходе проведенных исследований была продемонстрирована прогностическая значимость определения концентрации пДНК на сроках 11–13 и 15–28 недель беременности при последующем развитии ПЭ [16, 17].
В 2015 г. Salvianti и соавт. опубликовали результаты исследования, в котором внеклеточная ДНК была определена в течение беременности методом RASSF1A генов у 3 групп женщин: I – с ПЭ, II – с факторами риска развития ПЭ (IIa – ПЭ развилась, IIb – осложнение не развилось) и в III – контрольной группе [18]. Авторы учитывали такие факторы риска развития ПЭ, как семейный анамнез ПЭ, наличие в анамнезе ПЭ, хроническую артериальную гипертензию и гестационную артериальную гипертензию. Достоверно выше была концентрация оДНК в группе женщин с ПЭ по сравнению с остальными группами. При этом, концентрация оДНК достоверно различалась во IIa и III группах (р=0,001). Медиана концентрации пДНК в I группе составила 199,51 ГЕ/мл, что достоверно выше концентрации в остальных группах (IIa-14,48 ГЕ\мл, IIb-7,87 ГЕ/мл, III-6,07 ГЕ/мл) (р<0,001). Главным заключением исследователей явилось то, что концентрация внеклеточной ДНК повышается за несколько недель (от 2 до 18 недель для оДНК, от 8 до 17 недель для пДНК) до появления первых клинических симптомов ПЭ, что свидетельствует о высокой прогностической значимости данного маркера. Однако данные различных исследователей о сроках на момент повышения уровня внеклеточной ДНК остаются противоречивыми [7, 11].
Внеклеточная ДНК плода и задержка роста плода
ЗРП встречается у 10–15% беременных и связана с неблагоприятными перинатальными исходами. Риск антенатальной гибели плода на доношенном сроке беременности повышается в 4 раза при ЗРП. При этом, только у 25% новорожденных маловесных к сроку гестации данный синдром диагностируется антенатально [19, 20]. Причины, приводящие к развитию ЗРП, различны, основным и наиболее изученным фактором является плацентарная дисфункция.
Прогноз и ведение беременных с ЗРП определяется на основании данных допплерометрии, указывающих на возможную причину, так как часть плодов с низкой массой тела к сроку гестации – конституционально маловесные. Допплерометрическое исследование маточно-плацентарного и фето-плацентарного кровотока необходимо для определения наличия ЗРП, развившейся вторично вследствие плацентарной недостаточности [21]. На сегодняшний день проведено лишь незначительное количество исследований, изучавших взаимосвязь концентрации пДНК и развития ЗРП. В 2001 г. Smid и соавт. опубликовали результаты исследования пДНК при ЗРП и других осложнениях беременности, ассоциированных с плацентарной дисфункцией, где отметили положительную корреляцию [22]. Однако изолированно ЗРП была проанализирована лишь у 3 беременных. При наблюдении за 8 женщинами с нарушением кровотока маточных артерий во второй половине беременности было установлено, что у 4 беременных с последующим развитием ЗРП концентрация пДНК более чем в 2 раза была выше по сравнению с контрольной группой [23]. Позднее при проведении более масштабного исследования Smid и соавт. (2006) продемонстрировали, что высокая концентрация пДНК в материнской крови может служить показателем плацентарной патологии даже при отсутствии нарушения кровотока в маточных артериях [24]. При этом авторы указывают на значительную корреляцию между высокой концентрацией пДНК и нарушением кровотока в артерии пуповины при ЗРП изолированно (47%) и при ЗРП в сочетании с ПЭ (42%). В 2007 г. Crowley и соавт. с помощью обнаружения ДНК последовательностей Y-хромосомы от плодов мужского пола пришли к выводу, что количественное определение концентрации пДНК в материнской плазме крови до 20 недель беременности с целью прогнозирования ПЭ и ЗРП не информативно, в то время как Sekizawa и соавт. (2003), используя аналогичный метод обнаружения пДНК при сроке беременности 7–16 недель, первыми продемонстрировали отрицательный результат взаимосвязи концентрации пДНК в крови женщины с ЗРП [25, 26]. Однако, все исследования имели ограничения из-за используемой методики определения пДНК и малого числа наблюдений. В связи с этим представляет интерес исследование Kim и соавт. (2013), проведенное путем определения гиперметилированного RASSF1A гена [17]. Исследователи подтвердили прогностическую значимость пДНК при осложнениях беременности, ассоциированных с дисфункцией плаценты, но необходимо проведение дальнейших исследований.
Внеклеточная ДНК плода и преждевременные роды
ПР, определяемые как роды до 37 недель беременности, осложняют от 5 до 18% беременностей [27]. В инициации спонтанных ПР играют роль множество факторов. Пусковые механизмы включают в себя инфекционный фактор или воспаление, нарушение маточно-плацентарного кровообращения, кровотечение, перерастяжение стенок матки, стресс и другие иммунологически опосредованные процессы [28]. Существуют клинические и гистологические данные, свидетельствующие о роли нарушения маточно-плацентарного кровообращения в этиологии ПР [29]. В результате проведенного исследования Arias и соавт. (1993) показали, что аномалии сосудов децидуальной ткани встречаются в 3 раза чаще у женщин с ПР [30]. С другой стороны, при допплерометрическом исследовании маточно-плацентарного и фето-плацентарного кровотока также была выявлена положительная корреляция между плацентарной ишемией и преждевременным началом родовой деятельности [31].
Обнаружение пДНК в качестве биомаркера дисфункциональных нарушений плаценты определило дальнейшее его изучение при ПР. В 2002 г. Hoesli и соавт. продемонстрировали отсутствие существенных различий в количестве эритробластов у 47 женщин с преждевременным началом маточных сокращений и аналогичным количеством беременных группы контроля между 20 и 34 неделями гестации [32]. Однако в такие же сроки беременности Farina и соавт. (2005) установили взаимосвязь между повышенной концентрацией пДНК у женщин с риском развития ПР как путем спонтанного начала регулярной родовой деятельности, так и преждевременного излития околоплодных вод [33]. Аналогичные результаты были получены в исследовании Jakobsen и соавт. (2012) при определении пДНК у 1316 беременных при сроке 23–28 недель, в результате которого обнаружена корреляция между уровнем пДНК более 95-го центиля и развитием ПР [34]. При этом наибольшая взаимосвязь была установлена при развитии ПР до 34 недели беременности. Illanes и соавторы (2011) не обнаружили корреляции между концентрацией пДНК у женщин с короткой шейкой матки (менее 15 мм) и ПР, у беременных с короткой шейкой матки и своевременными родами и женщин группы контроля [35].
Исследователи утверждали, что нет корреляции между концентрацией пДНК в 22–24 недели и сроком беременности на момент родов. В дальнейших исследованиях Stein и соавт. (2013) и Quezada и соавт. (2015) также отрицалась прогностическая значимость определения концентрации пДНК в первом и втором триместрах беременности при ПР [12, 36]. В 2016 г. были опубликованы результаты исследования пДНК у 1349 беременных [37]. У 199 женщин (8,8%) роды начались преждевременно, при этом в 49 наблюдениях (3,6%) до 34 недели беременности. Авторы продемонстрировали, что пДНК является маркером ПР при определении концентрации в 14–20 недель беременности и отсутствует корреляция в 10–14 недель. Используя RASSF1A ген El-Garf и соавторы (2013) определили концентрацию пДНК у 30 женщин с угрожающими ПР (10%) или начавшейся регулярной родовой деятельностью (90%) в 28–32 недели беременности [38]. Авторы продемонстрировали 6-кратное увеличение концентрации пДНК при угрожающих или начавшихся ПР по сравнению с контрольной группой (р<0,05).
Большинство исследователей пришли к выводу, что существует взаимосвязь между повышенной концентрацией пДНК и началом родовой деятельности [39]. Однако не было известно, каким образом данная связь осуществляется на уровне патофизиологических механизмов. В 2012 г. группа авторов предположила, что чрезмерное разрушение материнских и плодовых клеток, приводящее к быстрому повышению концентрации пДНК, является тревожным сигналом, так как пДНК обладает провоспалительным действием [40]. Данные выводы были получены при исследовании уровня интерлейкина-6 у мышей после введения им пДНК. Более того, авторы обнаружили, что данный эффект Toll-like receptor-9 (TLR‑9) опосредованный, так как у TLR‑9 (‑/‑) мышей не наблюдалось активации воспалительных процессов. Следовательно, пДНК, в отличие от мДНК, активируя TLR‑9 способна индуцировать воспалительную реакцию и, как следствие, начало родовой деятельности [41]. В 2017 г. Herrera и соавт. продемонстрировали, что спонтанное начало родов на доношенном сроке беременности связано с более высокой концентрацией оДНК и интерлейкина-6 по сравнению с беременными без регулярной родовой деятельности [42].
Принимая во внимание приведенные выше результаты исследований, имеются противоречивые данные о прогностической значимости повышения концентрации пДНК при развитии ПР.
Внеклеточная ДНК плода и конфаундеры
Помимо определения прогностической значимости пДНК в материнской крови при осложнениях беременности, исследователи уделяют внимание изучению различных материнских и плодовых факторов, влияющих на концентрацию внеклеточной ДНК.
Wataganara и соавт. (2004) установили достоверную обратную корреляцию между массой тела женщины и концентрацией пДНК во втором триместре беременности, при этом не обнаружено связи с возрастом беременной, этнической принадлежностью, курением [43]. Ashoor и соавт. (2013) продемонстрировали аналогичную корреляцию с массой тела женщины в первом триместре беременности [44]. Galbiati и соавт. (2005) продемонстрировали влияние возраста женщины на концентрацию пДНК (увеличение) и В (III) группы крови (уменьшение) [45]. Также в результате проведенных исследований обнаружено влияние на концентрацию пДНК таких факторов, как курение, привычный выкидыш, многоводие, паритет родов, инвазивные диагностические процедуры во время беременности, внутрипеченочный холестаз беременных, а также аномалии прикрепления и расположения плаценты [11, 17, 36, 46–49].
Заключение
Обнаружение клеток плода и внеклеточной ДНК плода в материнской крови открыло новые возможности прогнозирования и диагностики осложнений беременности. Определение пДНК в крови женщины при использовании современных методов ПЦР диагностики, основанное на эпигенетических различиях фракций внеклеточной ДНК, является быстрым, недорогостоящим методом и имеет ряд преимуществ, позволяющих не ограничивать выборку. Повышение уровня пДНК в материнской крови может быть использовано в качестве прогнозирующего маркера осложнений беременности, таких как ПЭ, ПР, ЗРП. Наиболее изученным механизмом развития данных осложнений является дисфункция плаценты, реализующаяся в усилении апоптотических, некротических и воспалительных процессов. Однако имеющиеся данные литературы противоречивы. Не все авторы согласны с утверждением, что развитие больших акушерских синдромов сочетается с повышением концентрации пДНК, нет единого мнения о сроках, с которых начинается увеличение ее концентрации, не изучено влияние конфаундеров. Необходимы дальнейшие исследования патофизиологических процессов, лежащих в основе повышенного высвобождения пДНК в кровоток женщины, и возможной связи с осложнениями беременности.
