Проблема вторичного бесплодия не теряет своей актуальности в течение многих лет. Ежегодно у 80 млн женщин наступает незапланированная или нежелательная беременность, 45 млн делают аборты. По оценкам ВОЗ, ежегодно проводится 19 млн небезопасных абортов, которые приводят примерно к 68 000 случаев смерти женщин и миллионам случаев травм и стойкого нарушения репродуктивной функции. Россия, несмотря на ежегодную тенденцию к уменьшению числа абортов, до сих пор лидирует по их количеству среди государств Европы [1].
Вторичное бесплодие в России диагностируется у 3,2% женщин в возрасте от 20 до 44 лет. Заболевание чаще всего возникает в результате вмешательства при кюретаже (диагностическом, абортивном, после выкидыша, замершей беременности, осложненной беременности) или абляции эндометрия. При этом часто повреждается базальная мембрана матки, и происходит последующая замена эндометрия соединительнотканными рубцами, что в конечном итоге приводит к атрофии эндометрия и появлению внутриматочных синехий, клинически проявляющихся как дис- или аменорея и бесплодие [2, 3].
Традиционным, но не слишком успешным способом лечения этой патологии является гистероскопический адгезиолизис (механическое удаление синехий) с последующим введением в полость внутриматочных спиралей или катетеров для сохранения внутриматочного просвета в сочетании с интенсивной гормональной терапией для попыток содействия регенерации эндометрия [2, 4]. Современные способы решения проблемы последствий необратимого повреждения эндометрия и, как следствие, вторичного бесплодия различны. Условно можно выделить регенеративные методы восстановления функционального эндометрия и «органозаместительный» – трансплантацию матки с последующим экстракорпоральным оплодотворением (ЭКО).
Регенерация функционального эндометрия с помощью клеточной терапии
В последние годы появились перспективные методы улучшения регенерации функционального эндометрия. Клеточная терапия направлена на лечение заболеваний, в том числе связанных с хроническим воспалением и фиброзом, вызванных травмой. В экспериментах на крысах было показано покрытие мест повреждения эндометрия различными клеточными пластами, состоящими из клеток эндометрия, слизистой оболочки ротовой полости, мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК), культивируемыми на подложке из биоразлагаемого коллагенового матрикса [5–8]. В ряде исследований на модельных животных используется инъекционное ведение суспензии ММСК внутриматочно [3, 9–11], также используются аутологичные стволовые клетки из менструальной крови, полученные при культивировании in vitro [12].
Существующие методы повышения регенерации функционального эндометрия на практике представляют собой «гибридные» технологии, которые условно можно подразделить на клеточную терапию и/или стимуляцию ангиогенеза с помощью различных гуморальных факторов.
В настоящее время в мире для регенеративной терапии различных заболеваний применяются и разрешены, как правило, ММСК костномозгового происхождения (КММСК) [12, 13]. Аллогенные КММСК широко используются для терапии диабета второго типа, кардиоваскулярных и других системных заболеваний. С этой целью в США созданы компании, нарабатывающие и подготавливающие специальным способом КММСК из костного мозга молодых здоровых доноров. Примером являются препараты Rexlemestrocel-L (Angioblast Systems; Mesoblast; Teva, Mesoblast), полученные выделением с помощью антител STRO-3 [13], аналогично препарат Ixmyelocel-T (Aastrom Biosciences Inc.) является комбинацией КММСК с дополнительной популяцией макрофагоподобных клеток (http://stemcellassays.com/2014/10/pipeline-ixmyelocel-t/).
В ряде работ показан регенеративный эффект КММСК в модельной системе синдрома Ашермана на крысах [14–16]. В пилотном исследовании Cao et al. больным с синдромом Ашермана вводили аллогенные ММСК, выделенные из вартонова студня пупочного канатика. Лечение 26 пациенток, проведенное после гистероскопического адгезиолизиса, приводило к увеличению толщины эндометрия [8]. Десять из пролеченных женщин (38%) забеременели в течение периода наблюдения.
Для коррекции вторичного бесплодия особый интерес представляют клетки эндометрия как наиболее близкие по составу к собственному эндометрию. Клетки эндометрия получают во время пролиферативной фазы (5–14-й день менструального цикла) либо непосредственно из менструальной крови пациентки или доноров [17], в их составе идентифицирована мультипотентная клеточная популяция, имеющая фенотипическое сходство с ММСК, полученными из других источников [17–20]. Gargett et al. показали наличие популяций стволовых клеток, а также перицитов в стромальном компартменте эндометрия [20].
В клиническом исследовании Tan et al. показали, что трехкратное введение аутологичных клеток эндометрия, полученных в достаточном количестве в условиях in vitro, в полость матки 7 пациенткам с тяжелой формой синдрома Ашермана приводило к увеличению толщины эндометрия [21]. У 5 из них (70%) толщина эндометрия после терапии достигала 7–8 мм, что является достаточным для имплантации. У одной пациентки наступила беременность естественным путем, у двух родились дети после ЭКО [21]. В экспериментальной работе Saribas et al. показали, что введение клеток эндометрия уменьшило фиброз и усилило ангиогенез в матке крыс [22].
Несмотря на многообещающие результаты клинического исследования Tan et al. [21] терапии синдрома Ашермана аутологичными клетками эндометрия, в большинстве случаев остается нерешенной проблема получения достаточного количества менструальной крови, так как для тяжелой формы синдрома Ашермана характерна дис- или даже аменорея. В этих случаях возможно использование аллогенных клеток эндометрия.
Следует отметить, что при тяжелых формах синдрома Ашермана проблема имплантации яйцеклетки осложнена выраженным фиброзом даже при наличии областей с нормальным эндометрием [2–4]. В редких случаях у пациенток с синдромом Ашермана может наблюдаться разрастание эндометрия в окружающие ткани (ретроградная менструация), в том числе в брюшную полость, что считается одной из возможных причин происхождения очагов инфильтративного поражения [23]. Ретроградная менструация вызвана препятствиями для оттока крови естественным путем и не связана с клеточной терапией.
Во всех случаях при трансплантации клеток не наблюдали эффекта замещения, что подтверждает сложившееся в современной научной литературе мнение о системном и паракринном характере терапевтического воздействия ММСК [24].
В попытке повысить эффективность терапии с помощью трансплантации ММСК используются различные методы введения пациенткам клеточных элементов, включая внутрисосудистый внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный в субэндометриальную область, а также непосредственное введение в маточную полость как собственно клеток [25–29], так и стромально-клеточных композитов [7, 8].
В целом данные клинических исследований показали безопасность и потенциальную эффективность терапии синдрома Ашермана и гипоплазии эндометрия с помощью ММСК.
Стимуляция ангиогенеза
Матка содержит большое количество сосудов. Нарушение верхних слоев матки в процессе кюретажа вызывает потерю не только эндометрия, но и сосудистой ткани. Восстановление нормальной функции матки невозможно без полноценного кровоснабжения. Соответственно, стимуляция ангиогенеза может улучшить состояние эндометрия и индуцировать его физиологический рост. Предшественники эндотелиальных клеток (эКП) могут быть как выделены из периферической крови путем афереза, так и получены непосредственно из костного мозга, что обеспечивает примерно в 18 раз более высокий выход CD34+ эКП [30]. Повысить количество эКП в периферической крови можно с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ), что существенно уменьшает инвазивность процесса получения мононуклеарных клеток с повышенным количеством CD34+-фракции [30]. Впервые подобная тактика была применена для лечения больной с синдромом Ашермана в 2011 г. Пациентке провели предварительный кюретаж и ввели аутологичный аспират костного мозга в полость матки [31]. В результате терапии у пациентки наступила успешная беременность. Другое исследование, проведенное в 2014 г. в группе из 6 пациенток, страдающих синдромом Ашермана, показало, что локальное введение аутологичных КММСК в субэндометриальный миометрий увеличивало толщину эндометрия и нормализовало менструальный цикл [32]. Однако, несмотря на увеличение, у всех пациенток толщина эндометрия оставалась ниже 6,8 мм, что непригодно для попыток ЭКО. В 2016 г. в клиническом перспективном экспериментальном неконтролируемом исследовании 16 пациенткам с синдромом Ашермана или атрофией эндометрия внутривенно вводили ГКСФ для стимуляции выхода из костного мозга эКП CD133+-клеток, после чего выделяли эти клетки из периферической крови и вводили в область спиральных артерий (42–200 млн в зависимости от полученного количества) методом внутриартериальной микрокатетеризации, обычно выполняемой для эмболизации миомы [12]. В результате у всех 16 пациенток в течение 3 месяцев восстановился менструальный цикл и увеличилась толщина эндометрия. У 3 пациенток наступила спонтанная беременность, в 2 случаях закончившаяся рождением здоровых детей. Впоследствии возникло еще 7 беременностей после ЭКО с рождением двух здоровых детей [12]. В результате у 25% больных с синдромом Ашермана родились дети. При наблюдении в течение 6 месяцев у всех пациенток менструальный цикл опять становился нерегулярным, что означает кратковременный эффект лечения. Авторы отмечают, что методика доставки эПК ММСК непосредственно к спиральным артериолам является сложной, длительной, дорогостоящей и потенциально небезопасной инвазивной процедурой. В данном исследовании побочных эффектов не выявили. Авторы предположили, что терапевтический эффект достигался за счет системного и паракринного воздействия введенных клеток, как было показано раннее в ряде работ [33–38].
Оценка безопасности клеточной терапии
При синдроме Ашермана на трансвагинальной сонографии часто выявляется обструкция кровотока спиральных артериол [12], что исключает внутрисосудистый способ доставки клеточных элементов. Кроме того, сам размер ММСК превышает диаметр капилляров у человека, так что у людей и крупных подопытных животных они, очевидно, разрушаются на этапе прохождения 15–20 мкм артериол, не создавая явных проблем, однако у мышей и, в ряде случаев, у крыс вызывают тромбозы и легочные инфаркты [39].
В настоящее время предполагается, что ММСК оказывают системное и паракринное терапевтическое воздействие, в первую очередь регенеративное и противовоспалительное, посредством факторов, выделяемых при разрушении ММСК, и поглощения дебриса периферическими моноцитами [39–41], а также, по-видимому, за счет стимуляции фибринолиза тромбов в мелких сосудах [39].
Применение экзосом/микровезикул, выбрасываемых ММСК во внеклеточную среду, может быть перспективным для регенеративной медицины [33–38]. Экскреторные микровезикулы (эМВ) с находящимися внутри микроРНК (miRNA) были выделены из внутриматочной жидкости, что позволяет предположить их роль во взаимодействии клеток эндометрия и эмбриональных клеток [33, 36]. Эти выводы подтверждаются также тем фактом, что эмбриональные стволовые клетки способны продуцировать эМВ, которые оказывают иммуномодулирующее действие на T-клетки [37]. Кроме того, при совместном культивировании мышиных эмбрионов с эМВ эндометриального происхождения у эмбрионов увеличиваются количество бластомеров и концентрация факторов роста сосудистого эндотелия и тромбоцитов [38].
Еще одним подходом использования эМВ-содержащей биологической жидкости является тромбоцитарный лизат (ТЛ) [42–46]. Введение в полость матки ТЛ приводит к увеличению толщины эндометрия, числа имплантаций и беременностей [42–45]. Помимо эМВ и экзосом, в ТЛ содержится множество факторов роста, включая фактор роста тромбоцитов α, который продемонстрировал свою эффективность в восстановлении и регенерации тканей [46]. Соответственно, экзосомы, эМВ, ТЛ и ряд других факторов могут составить альтернативу клеточной терапии при невозможности ее применения.
Законодательное регулирование
Различные виды клеточной терапии успешно применяются в медицине, в частности, для лечения синдрома Ашермана. В Европе эти методы классифицируются как медицинские препараты для продвинутой терапии (Advanced therapy medicinal products, ATMPs), что подпадает под нормативный надзор Комитета по передовой терапии (The Committee for Advanced Therapies, CAT) Европейского агентства лекарственных средств (European Medicines Agency, EMA). Нормативно-правовая база для ATMP в Европейском Союзе (ЕС) была создана Комиссией ЕС в 2007 г. (Регламент ЕС № 1394/2007) и впервые применена в декабре 2008 г.
В США аналогичная классификация была создана Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA), где такие клеточные продукты именуются «существенно модифицированными продуктами клеточной и генной терапии» (more than minimal manipulated cell and gene therapy, CGT). Таким образом, они приравнены к фармакологическим препаратам, от которых FDA обязательно требует количественного определения действующего вещества и разработки анализа эффективности, который будет отражать механизм действия продукта [47]. Такие рекомендации предполагают значительные проблемы. Согласно классификации ATMP/CGT, клеточные продукты обязаны демонстрировать эффективность при любом отдельном заболевании, дозировке и методе доставки, при котором применяются. Клеточные продукты, полученные от разных доноров, обладают разной биологической активностью, а также различаются по количеству клеток, что сложно стандартизовать. Даже при использовании таких коммерческих продуктов, как Rexlemestrocel-L и Ixmyelocel-T, невозможно добиться стандартной биологической активности, поскольку она зависит от количественного и качественного состояния костного мозга доноров, из которого эти ММСК получают.
В 2014 г. правительство Японии сумело по большей части устранить эти ограничения, разработав новую нормативно-правовую базу, приняв «Закон о фармацевтических препаратах, медицинских приборах и других лекарственных средствах» (the Pharmaceuticals, Medical Devices and Other Therapeutics Products Act) [48]. Все продукты подразделяются на 3 класса в зависимости от предполагаемого потенциального риска для здоровья человека, и определяются конкретные процедуры, относящиеся к каждому классу. Кроме того, закон позволяет медицинским учреждениям поручать обработку клеток коммерческим предприятиям за пределами учреждения, которые отвечают требованиям, установленным Министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения, с целью содействия сотрудничеству между научными кругами и промышленностью на ранней стадии. Согласно последнему закону, терапевтический продукт для регенеративной медицины определяется как продукт, отличный от фармацевтических препаратов и медицинских изделий, что позволяет регенеративным медицинским продуктам получать условное, ограниченное по времени разрешение на продажу гораздо раньше, чем это было сделано в рамках предыдущей системы. Ожидается, что новая правовая база регенеративной медицины позволит достичь цели развития и продвижения регенеративной медицины, направленной на своевременное предоставление безопасных и эффективных методов лечения и продуктов.
Аналогичные тенденции появляются и в других странах. Так, в конце 2017 г. FDA объявило о пересмотре принципов регуляции в сфере регенеративной медицины и применения стволовых клеток для облегчения доступа больных к новым продуктам [47]. Это в целом простимулировало интерес к данной тематике в США, но пока не привело к значимым изменениям в области законодательного регулирования клеточных технологий в мировом масштабе.
В России из многочисленных нормативно-правовых актов, регулирующих разработку и использование клеточных продуктов, можно выделить Федеральный закон № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах». Законом определены положения в сфере создания и обращения клеточных продуктов, даны понятия качества, безопасности и эффективности биомедицинского клеточного продукта, однако столкнувшиеся с ним исследователи подвергают критике его отдельные положения. В соответствии с этим законом количественное определение эффективности было заменено оценкой соотношения вероятных преимуществ в сравнении с риском для пациента. Такое изменение в подходе значительно увеличило шансы клеточной терапии достичь широкого применения в клинической практике.
Заключение
В последние десятилетия наметился большой прогресс в борьбе с бесплодием, начиная с ЭКО и заканчивая трансплантацией матки и реконструктивными подходами к лечению вторичного бесплодия. В целом стратегия направлена на усиление эндогенного репаративного потенциала и восстановление поврежденной ткани эндометрия. Достижения в области применения ММСК для восстановления эндометрия привели к ряду прорывов в методах лечения синдрома Ашермана, о чем свидетельствуют увеличивающееся количество посвященных этой тематике научных работ, а также накапливающийся с каждым годом клинический опыт.
