Большая частота заболеваний шейки матки и их неблагоприятное влияние на репродуктивное здоровье женщины определяют необходимость совершенствования диагностики и лечения данной патологии. Слизистая оболочка шейки матки как пограничный барьер между верхним отделом генитального тракта и внешней средой постоянно подвергается воздействию повреждающих факторов. Среди последних наиболее агрессивное антигенное воздействие на цервикальный слизистый покров оказывают возбудители инфекций, передающихся половым путем. На фоне генитальной инфекции развиваются воспалительные заболевания шейки матки, которые привлекают пристальное внимание клиницистов, так как могут являться основой малигнизации [7, 16].
На сегодняшний день одной из наиболее распространенных инфекций вирусной этиологии, передающихся половым путем, является папилломавирусная инфекция (ПВИ) [1, 7, 15, 17].
Инфицирование, вызванное вирусом папилломы человека высокого риска (ВПЧ ВР), ассоциировано
с риском возникновения цервикальных неоплазий и инвазивных опухолей [2, 17, 20, 22], а рак шейки
матки (РШМ), согласно данным исследователей, является одной из основных причин смерти молодых женщин [13].
Цель настоящего исследования – изучение распространенности, спектра генотипов и вирусной нагрузки ВПЧ ВР у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки и при патологии шейки матки.
В период 2007–2010 гг. на базе кафедры акушерства и гинекологии №2 и НИИ иммунологии ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава был проведен лабораторный скрининг на наличие ВПЧ ВР методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 773 пациенток женских консультаций МУЗ ГКБ № 8 и МУЗ ГКБ №2 Челябинска, ГЛПУ Челябинский окружной клинический онкологический диспансер. Женщин отбирали методом сплошной выборки по мере обращения. Возраст обследуемых варьировал от 16 до 79 лет, средний возраст составил 32,3±0,42 года.
Диагноз заболевания шейки матки ставили на основании анамнеза, активного выявления жалоб, гинекологического обследования, ультразвукового исследования органов малого таза, цитологического исследования мазков с экзои эндоцервикса с интерпретацией результатов по классификации Папаниколау, простой и расширенной кольпоскопии, по показаниям биопсии шейки матки.
Материалом для молекулярно-биологического исследования служили соскобы эпителиальных клеток цервикального канала, взятые одноразовыми цитощеточками в пробирки, содержащие 500 мкл транспортной среды производства ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии (ЦНИИЭ) Роспотребнадзора (Москва). Для выделения ДНК использовался набор реагентов «ДНК-сорб-АМ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва).
Выявление, количественное определение и дифференциацию 12 наиболее распространенных генотипов ВПЧ ВР (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59-й) проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием наборов реагентов «АмплиСенс® ВПЧ ВР скрин-титр-FL» и «АмплиСенс® ВПЧ ВР генотип-FL» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва). Анализ результатов осуществляли автоматически с помощью программ AmpliSens FRT HR HPV Genotype Quant Results Matrix.xls и AmpliSens FRT HR HPV Screen Quant Results Matrix.xls. Концентрация ДНК ВПЧ ВР выражалась в lg ВПЧ на 105 клеток и оценивалась следующим образом: вирусная нагрузка менее 3 lg ВПЧ на 105 клеток – малозначимая, от 3 до 5 lg ВПЧ на 105 клеток – значимая и более 5 lg ВПЧ на 105 клеток – повышенная вирусная нагрузка. Амплификацию и детекцию ДНК ВПЧ ВР проводили на приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия).
Полученные результаты были обработаны общепринятыми методами вариационной статистики с использованием пакета статистических программ Statistica for Windows 6.0. При анализе количественных признаков, представленных в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m), оценку достоверности различий между группами проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Оценку качественных показателей осуществляли с помощью критерия χ2 и точного критерия Фишера. Различия считались достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты лабораторного скрининга показали, что ВПЧ ВР обнаружен у 450 (58,2%) из 773 обследованных женщин. ВПЧ 16-го типа – в 30,6 % случаев, остальные типы распределились следующим образом: 31-й тип выявлен у 11,6 % обследованных, 56-й – у 8,1 %, 52-й – у 7,2%, 51-й – у 7%, 33-й – у 6,8%, 39-й – у 6,4%, 18-й – у 5,8%, 35-й – у 4,9%, 45-й и 58-й – у 4,2%, 59-й – у 3,3%. При исследовании количества генотипов у 450 ВПЧ-позитивных женщин 1 тип ВПЧ ВР был выявлен у 267 (59,4%), 2 генотипа и более – у 183 (40,6 %) обследованных женщин.
У женщин с остроконечными кондиломами шейки матки (ОКК) ВПЧ ВР был обнаружен в 58,8% случаев (табл.1). У 53% пациенток с хроническим цервицитом и 27,2% женщин с лейкоплакией шейки матки выявлена ДНК ВПЧ ВР. При цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) частота встречаемости ВПЧ ВР была различной в зависимости от степени тяжести. Так, у больных с ЦИН I степени ВПЧ в цервикальном канале обнаружен в 56,5%, у пациенток с ЦИН II степени – в 92,8% и у больных с ЦИН III степени – в 77,1% случаев. ВПЧ ВР определялся у 65,8% пациенток онкологического диспансера с диагнозом РШМ 1–3-й стадии. У женщин без клиникоморфологических изменений на шейке матки ВПЧ
ВР был выявлен в 44,8% наблюдений.
Таблица 1. Частота встречаемости ВПЧ ВР у обследованных женщин.
Таблица 2. Частота встречаемости генотипов ВПЧ ВР у ВПЧ-позитивных женщин
Анализ распределения генотипов показал (табл.2), что у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки и пациенток с хроническим цервицитом превалируют ВПЧ 16, 31 и 56-го типов (25,5; 11,8; 9,8 и 23,1; 11,8; 10,1% соответственно).
Выявлена высокая частота встречаемости ВПЧ 16, 31 и 18-го типов (26,1; 19,6 и 9,8% соответственно) у больных с ЦИН I степени. С одинаковой частотой (6,5%) у этих пациенток определялись ВПЧ 33-го и 56-го типов. Частота встречаемости ВПЧ 18-го типа в группе больных с ЦИН I степени была выше, чем у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки (р=0,01).
Среди больных с ЦИН II степени в 43,2% случаев определялся ВПЧ 16-го типа, в 11,4% – ВПЧ 33-го типа, ВПЧ 18-го и 31-го типов встречался с одинаковой частотой (6,8%). В этой группе больных отмечены более высокие показатели инфицированности 16-м типом по сравнению с аналогичными показателями как у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, так и у больных с ЦИН I степени (р=0,01 и р=0,02 соответственно), 33-м типом – только при сравнении с женщинами без клинико-морфологических изменений на шейке матки (р=0,04). ВПЧ 31-го типа у больных с ЦИН II
степени встречался реже, чем у пациенток с ЦИН I степени (р=0,02). Не выявлено ни одного случая определения ВПЧ 51-го типа в данной группе больных.
При ЦИН III степени структура лидирующих типов не претерпевала существенных изменений: ВПЧ 16-го типа определяется в 40,5%, ВПЧ 33-го типа – в 11,9% , ВПЧ 56-го типа –в 9,5% случаев.
В группе больных с этой патологией частота встречаемости ВПЧ 16-го и 33-го типов выше, чем у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки (р=0,041 и р=0,043 соответственно). ВПЧ 59-го типа не определялся у больных с ЦИН III степени.
Суммарный показатель частоты встречаемости ВПЧ 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59-го типов у женщин с цервикальными неоплазиями I, II и III степени был достоверно ниже, чем у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки (р=0,02, р=0,003 и р=0,002 соответственно).
У женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки и пациенток с хроническим цервицитом практически с одинаковой частотой определялся один тип ВПЧ ВР (53,3 и 53,2% соответственно), инфицирование несколькими типами встречалось у 46,7 и 46,8% соответственно. Моноинфекция у больных с ЦИН I степени установлена в 65,6% случаев, тогда как при ЦИН II степени инфицирование одним или несколькими типами встречалось с одинаковой частотой. У больных с ЦИН III степени вновь установлено незначительное преобладание встречаемости одного типа ВПЧ – в 59,3% случаев, а сочетание нескольких типов определялось у 40,7% обследуемых изучаемой группы.
Исследование вирусной нагрузки показало, что среднее значение вирусной нагрузки у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки составило 4,84±0,5 lg на 105 клеток человека (табл.3). Тогда как в группах больных с хроническим цервицитом и ЦИН I степени показатель вирусной нагрузки был выше (5,32±0,56 и 5,79±0,25 lg на 105 клеток человека соответственно), но без достоверно значимых различий. У больных с ЦИН II и III степени вирусная нагрузка была в пределах значимой концентрации (4,8±0,33 и 4,9±0,2 lg на 105 клеток человека соответственно) и практически не отличалась от уровня у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки. Однако у больных с ЦИН II степени вирусная нагрузка была ниже, чем у больных с ЦИН I степени (р=0,02).
Таблица 3. Концентрация и распределение вирусной нагрузки у ВПЧ-позитивных женщин.
При анализе распределения вирусной нагрузки установлено, что малозначимая нагрузка определялась только у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки и пациенток с хроническим цервицитом. У женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, пациенток с хроническим цервицитом и ЦИН I степени в большем проценте случаев преобладала повышенная нагрузка (более 5 lg на 105 клеток человека), а при ЦИН II и III степени – значимая вирусная нагрузка (от 3 до 5 lg на 105 клеток человека).
Лабораторный скрининг, проведенный методом ПЦР, показал, что среди 773 пациенток амбулаторно-поликлинического приема ВПЧ высокого канцерогенного риска обнаружен в 58,2% случаев. Данные о вариациях встречаемости различных генотипов на территории РФ и при патологии шейки матки крайне важны для организации целевых мероприятий по ранней диагностике и профилактике РШМ [12]. С использованием типоспецифических праймеров, предназначенных для детекции 12 самых
распространенных типов ВПЧ ВР, были определены типы вируса у ВПЧ-позитивных женщин. На первом месте по распространенности оказался 16-й тип, выявленный в 30,6% случаев, что превышает аналогичные показатели в некоторых регионах РФ, в том числе Московской и Екатеринбургской областях [12]. Полученные результаты согласуются с данными литературы о лидирующей позиции ВПЧ 16-го типа на территории РФ [3, 12]. Второе и третье место по частоте встречаемости заняли ВПЧ 31-го и 56-го типов (11,6 и 8,1% соответственно). Частота определения других генотипов ВПЧ ВР (18, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59-й) колебалась от 7,2 до 3,2%.
У женщин с патологией шейки матки наиболее часто ВПЧ ВР выявляется при цервикальных неоплазиях I, II, III степени, что подтверждает современные представления о роли ПВИ в развитии неопластической патологии шейки матки [6, 9, 20]. Среди больных с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки пациентки с хроническим цервицитом составляют 35,1%. Хроническое воспаление создает фон для развития неопластического процесса, особенно в сочетании с ВПЧ ВР [5, 11, 16, 18]. Необходимо подчеркнуть, что женщины без клинико-морфологических изменений на шейке занимают третье место в этой структуре и составляют 13,6%. Анализ количества определяемых генотипов среди 450 ВПЧ-позитивных женщин установил преобладание инфицирования одним генотипом ВПЧ ВР в 59,4% случаев. Наши данные отличаются от результатов, полученных И.Г. Видяевой и соавт., согласно которым, микстинфекция несколькими типами ВПЧ характерна для населения европейской и центральной части России [3].
Изучение спектра генотипов ВПЧ ВР у женщин с патологией шейки матки показало, что независимо от наличия или отсутствия клинико-морфологических изменений на шейке матки ВПЧ 16-го типа в разном проценте случаев занимает лидирующую позицию. У больных с ЦИН II–III степени ВПЧ 16-го типа встречался чаще, чем у женщин без клинико-морфологических изменений, что подтверждает связь 16-го типа со степенью диспластических изменений и согласуется с данными других исследователей [4, 21].
У женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, больных хроническим цервицитом и ЦИН I степени второе место занимает ВПЧ 31-го типа, а у больных с ЦИН II–III степени – ВПЧ 33-го типа. ВПЧ 31-го и 33-го типов, относящихся к филогенетической группе α9, являются генетически родственными типами по отношению к ВПЧ 16-го типа и как следствие, по данным некоторых авторов, могут обладать значительным канцерогенным потенциалом [15].
У женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, пациенток с хроническим цервицитом и ЦИН I степени в разном проценте случаев встречались все другие определяемые типы ВПЧ ВР, тогда как при ЦИН II степени не выявлен ВПЧ 51-го типа, а при ЦИН III степени – ВПЧ 59-го типа. При анализе данных молекулярного генотипирования выявлено постепенное нарастание частоты встречаемости ВПЧ 33-го типа – от 2% у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки до 11,9% при ЦИН III степени и снижение инфицированности ВПЧ 59-го типа – от 5,9% у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки до полного отсутствия при ЦИН
III степени.
Суммарный показатель ВПЧ 16-го и 18-го типов, обладающих максимальным канцерогенным потенциалом, составил от 27,5% у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки до 50% у больных с ЦИН III степени. Однако кумулятивный показатель остальных 10 генотипов ВПЧ ВР варьировал от 72,5 до 50% соответственно, указывая на значимость и необходимость проведения молекулярного генотипирования.
С точки зрения некоторых авторов, инфицирование несколькими типами ВПЧ может являться одним из показателей активации вирусной инфекции и фактором прогрессии заболевания [12]. При анализе количества определяемых генотипов не было установлено ассоциации инфицирования несколькими типами в зависимости от тяжести заболевания шейки матки. У женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, больных с хроническим цервицитом и ЦИН I и III степени преобладал один тип ВПЧ ВР (53,3; 53,2; 65,6 и 59,3% соответственно), а при ЦИН II степени моно- и микстинфекция встречалась с одинаковой частотой.
Установлено, что вирусная нагрузка может отражать тяжесть и влиять на исход течения заболеваний шейки матки, ассоциированных с ПВИ [8, 10, 19]. Изучение вирусной нагрузки показало, что у больных с хроническим цервицитом и ЦИН I степени показатель вирусной нагрузки превышал порог прогрессии (5,02±0,56 и 5,79±0,25 lg на 105 клеток человека соответственно). По мере углубления морфологических изменений вирусная нагрузка снижалась и у больных с ЦИН II и III степени была в пределах верхней границы значимой концентрации (4,8±0,33 и 4,9±0,2 lg на 105 клеток человека соответственно), что не противоречит данным литературы [14].
Выводы
1. Среди женщин амбулаторно-поликлинического приема ВПЧ высокого риска определяется в 58,2% случаев. У ВПЧ-позитивных женщин в 30,6% случаев встречается ВПЧ 16-го типа, второе и третье место по частоте встречаемости занимают ВПЧ 31-го и 56-го типов. Анализ количества определяемых генотипов среди ВПЧ-позитивных женщин установил преобладание инфицирования одним генотипом ВПЧ ВР у 59,4% обследованных.
2. Независимо от наличия или отсутствия клинико-морфологических изменений на шейке матки ВПЧ 16-го типа занимает лидирующую позицию. На втором месте по частоте встречаемости у женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки, больных с хроническим цервицитом и ЦИН I степени находится ВПЧ 31-го типа и в разном проценте случаев встречаются все другие определяемые типы ВПЧ ВР. У больных с ЦИН II–III степени вторую позицию занимает ВПЧ 33-го типа. ВПЧ 51-го
типа не определялся при ЦИН II степени, а ВПЧ 59-го типа – при ЦИН III степени.
3. У больных с хроническим цервицитом и ЦИН I степени показатель вирусной нагрузки превышал порог прогрессии. По мере углубления морфологических изменений вирусная нагрузка снижалась и у больных с ЦИН II и III степени была в пределах верхней границы значимой концентрации.
4. Результаты исследования подтверждают необходимость проведения молекулярного генотипирования ВПЧ высокого канцерогенного риска при патологии шейки матки. Поиск методом ПЦР только ВПЧ 16-го и 18-го типов недостаточен для определения контингентов риска по развитию неопластических процессов шейки матки.
