В последние годы методы ВРТ продолжают совершенствоваться, постоянно ведется поиск новых методик, которые могли бы повысить частоту живорождения в исходе программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Успех проведения программ ЭКО в значительной степени определяется количеством и качеством полученных ооцитов [1] и выбором эмбрионов с высоким имплантационным потенциалом [2]. В настоящее время оценка эмбрионов основывается преимущественно на морфологических критериях, однако точность такого метода отбора эмбрионов остается недостаточно высокой, хотя его использование и привело к значительному повышению результативности программ ЭКО [3].
В последние годы ведется активный поиск и разработка альтернативных неинвазивных методик по анализу качества ооцитов, эмбрионов и успешности имплантации. Материалами для исследования служат фолликулярная жидкость, клетки кумулюса, отделяемое цервикального канала, аспират эндометрия, биоптат трофэктодермы эмбриона.
Среди широкого спектра биохимических маркеров, определяемых в этих материалах, в последнее время внимание исследователей привлекает исследование длины теломер и активности теломеразы в клетках кумулюса, а также в лимфоцитах периферической крови, так как теломеры являются «молекулярными часами», которые определяют репликативный потенциал и продолжительность жизни клетки [4], а теломераза – фермент, который регулирует длину теломер.
Значение теломер и теломеразной активности
Теломеры играют ключевую функцию в поддержании стабильности ДНК в клетке [4]. Это концевые участки хромосом, образованные теломерной ДНК и специфическими белками. У человека и всех позвоночных теломерная ДНК представлена в виде гексонуклеотидного повтора TTAGGG общей длиной в сотни и тысячи оснований [5]. Теломера заканчивается однонитевым 3'-концом (оверхэнгом). Сама теломера свернута в структуру, называемую t-петлей, которая не позволяет концам хромосом соединяться друг с другом; при этом однонитевой конец теломеры проникает в двунитевой участок t-петли, образуя d-петлю (displacement loop). При каждой репликации ДНК теломеры укорачиваются, то есть дочерняя ДНК оказывается несколько короче материнской, поскольку ДНК-полимераза неспособна синтезировать дочернюю копию ДНК непосредственно с 3’-конца цепи – она может лишь добавлять нуклеотиды к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе дезоксирибозы, т.е. нуждается в праймере [6]. Также на укорочение теломер оказывают влияние метилирование ДНК [7], активные формы кислорода, основными поставщиками которых в клетке являются митохондрии [8]. При укорочении теломерной ДНК наступает момент, когда длина теломерного повтора не позволяет образоваться t-петле, теломерный конец (оверхэнг) при этом приобретает свободную конформацию, что воспринимается клеткой как сигнал повреждения ДНК (двуцепочечный разрыв). В результате запускается механизм репликативного старения клетки, и в клетке включаются механизмы, блокирующие деление [5]. Укорочение теломер происходит не только в делящихся клетках, но и в ооцитах. Это укорочение начинается уже в периоде фетального оогенеза, продолжается в течение жизни человека и ускоряется после 35 лет [9].
Теломераза – фермент, удлиняющий теломеры и тем самым рещающий проблему концевой недорепликации ДНК. Основу фермента составляют 2 компонента: РНК-компонент – TR или TER (Telomerase RNA component), и белковая часть – TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) – теломеразная обратная транскриптаза [5]. TR-компонент экспрессируется во всех клетках, а белковая часть TERT – только в гаметах и в трансформированных (опухолевых) клетках, а также ограниченно в стволовых клетках и ряде других тканей с высокой пролиферативной активностью. Только при наличии обеих субъединиц теломераза является активной [5]. Механизм работы теломеразы состоит в копировании теломерной ДНК-матрицы, включающий этап связывания фермента с теломерной ДНК, этап элонгации, во время которого дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к концу G-богатой цепи теломеры, и этап транслокации фермента на конец новообразованной цепи. Теломераза проявляет активность в клетках с высоким пролиферативным потенциалом – это клетки кроветворной системы [10], эпидермиса и опухолевых тканей [11], и это позволяет этим клеткам избежать старения и пролиферировать с высокой скоростью [10, 11]. Большинство соматических клеток не содержит регистрируемых уровней активности теломеразы; соответственно, их теломеры становятся короче после каждого деления клеток. После того, как ДНК теломер достигает критически короткой длины [5], клетка перестает делиться и, в конечном счете, претерпевает апоптоз и/или приобретает хромосомные повреждения [5, 6]. Существуют альтернативные способы удлинения теломер – ALT (альтернативный механизм удлинения теломер). Механизмы ALT основаны на генетической рекомбинации [12]. Эти механизмы иногда действуют при канцерогенезе, участвуют в удлинении теломер соматических клеток и в процессе раннего эмбриогенеза. Помимо регуляции длины теломер у теломеразы выявлен ряд других функций. Выявлена способность теломеразы влиять на процесс запуска апоптоза посредством прямого взаимодействия с митохондриями. Проведен ряд работ, которые демонстрируют антиапоптозное действие теломеразы на уровне модификации митохондриальных функций, в частности продукции активных форм кислорода [8].
Теломеры и теломераза в клетках кумулюса для прогнозирования исходов программ эко
Клетки кумулюса – гранулезные клетки, непосредственно прилежащие к ооциту и формирующие с ним единый кумулюс-ооцитный комплекс, который остается интактным вплоть до процесса оплодотворения [13]. Гранулезные клетки – соматические клетки фолликула, располагающиеся в несколько рядов вдоль базальной мембраны. Они проходят определенные морфологические и физиологические изменения в процессе пролиферации, дифференцировки, овуляции, лютеинизации и атрезии [14]. Гранулезные клетки на периферии преовуляторного фолликула и клетки, непосредственно окружающие ооцит – кумулюсные, различаются между собой, однако это различие функциональное, а не морфологическое [15]. Функции клеток кумулюса реализуются посредством формирования межклеточных взаимодействий через щелевые контакты между собственными клетками и оолеммой [16]. Клетки кумулюса участвуют в созревании цитоплазмы ооцита, обеспечивают блокаду мейотического деления и индукцию овуляции под воздействием лютеинизирующего гормона, формируют запас питательных веществ для дальнейшего развития эмбриона [16]. После созревания фолликула и овуляции клетки гранулезы перестают пролиферировать и подвергаются лютеинизации. Долгое время считалось, что лютеинизация клеток гранулезы является терминальной стадией дифференцировки, но недавно было показано, что лютеинизированные клетки гранулезы можно дедифференцировать при культивировании в среде с добавлением ростового фактора LIF (лейкемия-ингибирующий фактор) [17]. При этом они постепенно приобретают поверхностные маркеры, характерные для мезенхимных стволовых клеток. Мультипотентность этих дедифференцированных клеток гранулезы была продемонстрирована путем направленных дифференцировок in vitro в те типы клеток, которые в норме не встречаются в фолликулах: в нейроны, хондроциты и остеобласты.
Опубликованные данные, касающиеся экспрессии и роли теломеразы в кумулюсных клетках фолликулов, ограничены. Впервые сообщили о том, что в овариальной и тестикулярной ткани можно обнаружить активность теломеразы, N.W. Kim и соавт. [10]. Дальнейшие исследования показали, что обнаруживаемая активность теломеразы в яичнике происходит именно из кумулюсных клеток фолликулов [18].
V. Russo и соавт. [19] обнаружили, что субъединица обратной транскриптазы, которая отвечает за ферментативную активность теломеразы, была обнаружена в гранулезных клетках на всех стадиях развития овариальных фолликулов свиньи, от примордиальных до антральных. Установлено, что активность теломеразы в гранулезных клетках фолликулов с атретическими изменениями была значительно ниже, чем у нормально развивающихся фолликулов [14]. Эти результаты свидетельствуют о том, что теломераза в клетках гранулезы и кумулюса может играть важную роль в жизни нормально развивающегося фолликула и что снижение ее активности может быть связано с фолликулярной атрезией, хотя все вышеперечисленные исследования были проведены в яичниках животных.
Исследование S. Butts и соавт. [20] в Госпитале при Университете Пенсильвании в 2009 г. было посвящено исследованию длины теломер и активности теломеразы в кумулюсных клетках и их взаимосвязи с идиопатической яичниковой недостаточностью. К сожалению, в большинстве случаев у молодых женщин с яичниковой недостаточностью причину этого состояния не удается установить. Важнейшим фактором, определяющим овариальный резерв и продолжительность репродуктивного периода жизни, является формирование первичной когорты фолликулов из предшествующих стволовых клеток – оогоний, во внутриутробном состоянии. Известно, что максимальное количество клеток – около 6 млн достигается к 20 неделям гестации. Далее количество клеток начинает уменьшаться за счет запрограммированной гибели ооцитов и клеток гранулезы [21, 22]. Изучено и описано не так много генов и генетических механизмов, которые влияют на развитие фолликулов в яичниках и повреждение которых может привести к преждевременной яичниковой недостаточности [23].
В исследование были включены 54 пациентки в возрасте до 37 лет, участвовавшие в программе ЭКО, которые были разделены на 2 группы. В первую группу вошли 12 пациенток со сниженным овариальным резервом. Критериями включения были сохраненный менструальный цикл, сниженное число антральных фолликулов по данным ультразвукового исследования, уровень ФСГ более 11,7 МЕ/л в раннюю фолликулярную фазу цикла, нормальный кариотип. Во вторую группу – группу сравнения – вошли 42 пациентки с трубно-перитонеальным и мужским факторами бесплодия. Всем пациенткам проводилась стимуляция суперовуляции по длинному протоколу, кумулюсные клетки получали в день трансвагинальной пункции яичников. Далее выделяли ДНК из кумулюсных клеток и исследовали длину теломер методом модифицированной полимеразной цепной реакции. Также у всех пациенток исследовали активность теломеразы методом TRAP (telomeric repeat amplification protocol) [24]. На основании данных проведенного анализа была выявлена взаимосвязь между уровнем активности теломеразы и случаями идиопатической яичниковой недостаточности. У пациенток с нерегистрируемым уровнем активности теломеразы в клетках кумулюса в 11 раз чаще выявлялась идиопатическая яичниковая недостаточность, чем у пациенток с регистрируемым уровнем активности теломеразы. Также была замечена разница в длине теломер (T/S) кумулюсных клеток – 1,88 в 1-й группе против 3,66 во 2-й группе. Количество полученных фолликулов, зрелых и оплодотворившихся ооцитов, эмбрионов на стадии дробления также положительно коррелировало с уровнем активности теломеразы. Исходы программ лечения бесплодия методами ЭКО не имели в группах статистически значимых различий по данным авторов данного исследования.
В последующей работе H. Chen и соавт. (2011) [25] определялась активность теломеразы в клетках кумулюса и корреляция этого показателя с исходами программ ВРТ. Это проспективное исследование, включающее 56 пациенток в возрасте 23–39 лет, с трубно-перитонеальным или мужским факторами бесплодия. Синдром поликистозных яичников, ановуляторное бесплодие, эндометриоидные кисты и другие объемные образования яичников, а также матки, являлись критериями исключения. Материалом для исследования служили клетки кумулюса, которые были получены в день трансвагинальной пункции яичников. Определение активности теломеразы проводилось методом TRAP. На основании уровня активности теломеразы (ТА) пациентки были разделены на 4 группы: 1) ТА не определялась – 17 пациенток 2) низкий уровень ТА – 16 пациенток 3) средний уровень ТА – 14 пациенток 4) высокий уровень ТА – 9 пациенток. Группы не отличались между собой по возрасту пациенток, количеству антральных фолликулов, базальному уровню ФСГ, во всех группах был применен длинный протокол стимуляции суперовуляции. На основании проанализированных данных (количество полученных зрелых ооцитов, процент оплодотворенных ооцитов, интенсивность дробления эмбрионов, количество полученных эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки) был сделан вывод о том, что уровень ТА никак достоверно не влияет на эти показатели. Но самые высокие показатели имплантации эмбрионов и клинической беременности были в 4-й группе (52,63 и 77,78% соответственно по сравнению с 18,92 и 29,41% в 1-й группе, 25,71 и 37,50% во 2-й группе и 48 и 50% в 3-й группе). Таким образом, был сделан вывод о том, что пациентки с высоким уровнем ТА имели большую вероятность забеременеть, чем пациентки с ее низким уровнем.
Возможное объяснение этого явления, по мнению авторов данной работы, состоит в положительном влиянии ТА на гормон-продуцирующую функцию гранулезных клеток в лютеиновой фазе цикла и состояние эндометрия. Ранее в исследованиях говорилось о том, что оптимальное соотношение эстрадиола к прогестерону в день введения хорионического гонадотропина (триггера овуляции) составляет от 1 до 5, особенно от 3 до 4, для успешности дальнейшей имплантации эмбриона [26]. В проведенном исследовании соотношение эстрадиола к прогестерону в день введения триггера овуляции положительно коррелировало с уровнем активности теломеразы, и в 4-й группе было оптимальным. Также более высокий уровень ТА в кумулюсных клетках может оказывать влияние на состояние эмбриона, его имплантационный потенциал, но точная роль этого фактора в развитии эмбриона пока неизвестна.
Длина теломер и теломеразной активности в лимфоцитах и корреляция этих показателей с исходами программ ЭКО
В 2015 г. J. Gzamanski-Cohen и O. Sarid провели работу [27], целью которой был поиск неинвазивных биомаркеров, которые могли бы объяснить неудачные исходы ВРТ. В исследование были включены 20 пациенток не старше 32 лет, которым проводилось лечение бесплодия, обусловленного трубно-перитонеальным и мужским факторами, методом ЭКО, и 10 здоровых пациенток, не страдающих бесплодием – группа контроля. Проводилось исследование длины теломер лимфоцитов периферической крови. Было установлено, что у пациенток в программе ВРТ отмечалось статистически значимое снижение длины теломер (1,15 T/S) по сравнению с группой контроля (1,53 T/S) [28]. В настоящее время нет установленной нормы длины теломер лимфоцитов периферической крови для оценки состояния общего здоровья и предикции исходов программ ВРТ, в частности, но ведутся исследования для разработки этого стандарта.
Заключение
Таким образом, в настоящее время активно проводятся исследования, посвященные изучению неинвазивных биомаркеров оценки состояния ооцитов, эмбрионов, успешности имплантации, которые могут быть использованы в качестве предикторов эффективности программ ВРТ. Такие неинвазивные маркеры могут дополнять, а в некоторых клинических ситуациях заменять наиболее используемый на сегодняшний день в клинической практике метод диагностики состояния эмбриона – биопсию трофэктодермы преимплантационной бластоцисты, который незаменим для анализа хромосомного набора эмбриона, но является инвазивным, довольно дорогостоящим, и не позволяет оценить имплантационный потенциал эмбриона.
Применение неинвазивных биомаркеров может способствовать оптимизации стоимости и улучшению исходов программ ВРТ. Определение длины теломер, активности теломеразы в кумулюсных клетках и лимфоцитах периферической крови может стать актуальным и современным методом, который будет успешно использоваться в качестве предиктора для оценки эффективности программ ВРТ.
