Исследования последних лет показали, что единственным реальным путем профилактики тяжелых осложнений гестации, перинатальной патологии и смертности является своевременное прогнозирование, ранняя диагностика и коррекция патологического течения беременности [5, 12].
Согласно современным представлениям, в формировании и функционировании фетоплацентарного комплекса важная роль отводится оптимальному влиянию взаимозависимых ангиогенных факторов, факторов роста и запрограммированной клеточной гибели в плаценте [3, 15]. Для разработки новых подходов к прогнозированию и диагностике плацентарной недостаточности (ПН) и степени ее тяжести, основанных на комплексной динамической оценке эндотелиальной дисфункции, децидуализации стромальных клеток, клеточной пролиферации и апоптоза, нами проведено проспективное обследование беременных женщин группы высокого риска по реализации тяжелых форм ПН в динамике гестации с последующим ретроспективным анализом полученных данных с учетом клинического течения беременности, перинатальных исходов и результатов морфологического исследования последа.
Целью исследования являлась оценка прогностических и диагностических возможностей маркеров эндотелиальной дисфункции, децидуализации, апоптоза и клеточной пролиферации в отношении реализации тяжелых форм ПН.
Материал и методы исследования
Для решения поставленной цели с применением ранее разработанной прогностической шкалы факторов риска развития тяжелых форм ПН [4] была сформирована группа наблюдения, состоящая из 154 беременных женщин, которым в сроки 18–24 нед и 28–38 нед гестации проведено определение в крови содержания следующих маркеров эндотелиальной дисфункции (МЭД):
· индекса цитотоксичности антиэндотелиальных антител (ИЦ АЭАТ) по технике перекрестной пробы с моноцитами [18];
· уровня общего иммуноглобулина Е (IgE) [7];
· маркера децидуализации стромальных клеток (МД) – плацентарного альфа-1-микроглобулина
(ПАМГ) [9];
· маркеров апоптоза (МА) – лимфоцитов с фенотипом CD95+ FasR (CD95) [13, 17];
· фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) [15, 19];
· маркера клеточной пролиферации – фактора роста плаценты (ФРП )[1].
Уровень перекрестных антител к моноцитам и эндотелиальным клеткам (АЭАТ) в сыворотке крови беременных определялся по стандарту Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (США) – технике перекрестной пробы. Цитотоксическое действие сыворотки (ИЦ АЭАТ) оценивали по следующей шкале: до 10% разрушенных клеток – результат отрицательный, 10–20% – слабоположительный, 20–50% – положительный, 50–100% – резко положительный [18]. Идентификацию лимфоцитов с фенотипом СД95+ осуществляли стандартным методом иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов человека, меченных FITS Fab- фрагментами антимышиных иммуноглобулинов. Относительное число СД95+ лимфоцитов определяли на проточном цитометре Becton Dickinson FACS Calibur. Уровни общего IgE, ПАМГ, ФНО-α и ФРП в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с применением наборов реагентов [14]. Гистологические срезы плацент изучали светооптически и телеметрически с помощью видеокамеры ССД КОСОМ КСС-310РД и светового микроскопа Nicon ALPHAPHOT-2 YS2-H (Япония). Всем беременным в динамике гестации проводили ультразвуковое исследование (УЗИ) по трансабдоминальной методике на аппарате «Philips Tangens» с цветовым допплеровским картированием [16].
Ретроспективно с учетом клинического течения беременности из 154 женщин были сформированы две группы сравнения: I группа – 109 женщин с ПН; II группа – 45 женщин с ПН в сочетании с гестозом и экстрагенитальной патологией. Во II группе сравнения гестоз диагностирован в 100% случаев: легкой степени – у 40 (88,9%) беременных; средней степени – у 5 (11,1%) беременных, причем сочетанный гестоз имел место у 31 (68,9%) женщины. Фоновые экстрагенитальные заболевания были представлены хроническим пиелонефритом – 6 (13,3%) случаев, нейро-циркуляторной дистонией по гипертоническому и смешанному типам – 14 (31,1%), гипертонической болезнью – 3 (6,7%), сахарным диабетом – 2 (4,4%), хроническим бронхитом – 6 (13,3%).
Контрольную группу (III группа) составили 30 здоровых беременных женщин, обследованных в сроки, аналогичные таковым в I и II группах сравнения. Для диагностики ПН в период гестации использовали алгоритм обследования, включающий УЗИ фетоплацентарного комплекса, ультразвуковую допплерографию (УЗДГ) кровотоков в маточных артериях и артерии пуповины, кардиотокографию (КТГ), результаты клинического обследования [16]. Ретроспективно уровни МЭД, МД, МА, ФРП в крови сопоставляли со степенью тяжести ПН (компенсированная – КПН, субкомпенсированная – СПН, декомпенсированная – ДПН), верифицированной морфологическим исследованием плаценты с учетом критериев, разработанных А.П. Миловановым [6]. При гистологическом исследовании оценивали вариант нарушения созревания ворсин; выраженность компенсаторных реакций; выраженность инволюционно-дистрофических и циркуляторных изменений; состояние межворсинчатого пространства; состояние децидуальной части плаценты; патологические изменения в плаценте (инфаркты, кальцинаты, кисты и др.).
Математическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере AMD Athlon II в среде Windows XP с использованием программы Microsoft Office Excel 2003, статистического пакета Statistica 6.0 фирмы STATSOFT. Весь полученный числовой материал подвергали статистической обработке с заданной надежностью 95% или уровнем значимости (р) 0,05. Оценка значимости различий средних арифметических значений проводилась с помощью критерия Стъюдента, возможность использования которого определялась критерием Фишера-Снедекора. Степень корреляционной связи оценивалась по величине коэффициента корреляции «r» по системе Кендалл:
r<0,1 - связь отсутствует; 0,1<г<0,3 - слабая степень связи; 0,3<r<0,6 - умеренная степень связи; 0,6<r<1,0 - сильная степень связи. Для расчета необходимого числа измерений (случаев) и получения достоверных результатов применяли метод математического планирования [9].
Для оценки прогностической и диагностической значимости предлагаемого диагностического
комплекса были рассчитаны чувствительность (Sn), специфичность (Рр), предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов, диагностическая точность методов прогнозирования и диагностики ПН (Ex). Sn - вероятность позитивного теста у лиц с наличием заболевания: Sn=ТР/Д+х100, где ТР - число истинно положительных ответов, Д+ - число истинно положительных и ложноотрицательных ответов. Рр - вероятность отрицательного результата у лиц с отсутствием заболевания: Pp=TN/71-x100, где TN - число истинно отрицательных ответов, Д- - число ложноположительных и истинно отрицательных ответов. Ех - пропорция правильных результатов среди всех обследованныхлиц: Ex=(TP+TN)/Nx100, где N - число всех обследованных лиц. Прогностичность результатов оценивали исходя из преваленса частоты признака в исследуемой группе пациентов: PV+=TP/T+x100; PV—=TN/T-xlob. Критерий PV+напрямую показывает, насколько велика вероятность болезни при положительных результатах исследования, а критерий PV- - насколько велика
вероятность отсутствия болезни при отрицательных результатах [9|.
Результаты Исследования и обсуждение
Сроки обследования были выбраны с учетом того, что I триместр и начало 11 триместра характеризуются выраженными сосудистыми повреждениями, связанными с формированием гемохориального типа плацентации, ростом и дифференцировкой русла кровообращения плода,
совершенствованием поверхностных структур синцитиотрофобласта, инвазией цитотрофобласта в спиральные артерии. В этот период физиологической беременности происходят значительные адаптационные процессы во всех звеньях регуляции (иммунной, эндокринной, нервной и других систем), что создает серьезные трудности в интерпретации показателей гомеосгомеостаза
[2]. Период с 18-й по 24-ю нед характеризует стабилизация маточно-плацентарной системы, замедление роста матки, некоторое снижение активности компенсаторных и защитных реакций организма, иммунной системы здоровой беременной женщины. На этом фоне фиксация отклонений от физиологического течения гестации более доступна и очевидна. Имеется возможность проведения персонифицированных профилактических мероприятий [11].
Период с 28-й по 38-ю нед выбран в связи с тем, что на этом этапе ПН реализуется клинически
и важна оценка степени ее тяжести, состояния плода. Необходимо продолжать превентивные
мероприятия для снижения риска реализации тяжелых форм ПН, внутриутробного страдания плода [8, 10].
Согласно полученным данным, в группе высокого риска развития тяжелых форм ПН она имела
место в 100% случаев, причем КПН составила 15,6% (24 случая), СПН - 14,3% (22 случая), ДПН - 70,1% (108 случаев). Из 154 беременных группы высокого риска реализация СПН и ДПН составила 84,4% (130 беременных).
Результаты исследования МЭД, МД, МА, ФРП в сравниваемых группах в сроке 18-24 нед гестации
представлены в табл. 1 и 3. В середине II триместра гестации параметры ИЦ АЭАТ и общего IgE у беременных I группы достоверно отличаются от контроля (p<0,05) лишь при СПН и ДПН (табл. 1). ИЦ АЭАТ по сравнению с контролем увеличен в 2 раза для СПН и в 4 раза для ДПН, уровень общего IgE - в 1,2 раза для СПН и в 1,4 раза для ДПН.
Во II клинической группе в сроке 18-24 нед уровни МЭД достоверно (p<0,05) отличаются от показателей контрольной группы независимо от степени тяжести ПН (табл. 1). При этом более высокие показатели, достоверно отличающиеся от КПН (р<0,05), отмечены при ДПН: ИЦ АЭАТ выше в 4 и 1,6 раза, уровень IgE - в 1,4 и 1,2 раза соответственно данным контроля и по КПН.
Полученные данные по МЭД во II триместре беременности в сравниваемых группах можно интерпретировать следующим образом. Эндотелиальная дисфункция на ранних этапах беременности характерна для многих осложнений гестации [3, 15, 20]. Вследствие этого уровни МЭД у беременных с последующей реализацией ПН изолированно и на фоне гестоза достоверно отличались в обеих группах сравнения от контрольных значений. В данную закономерность не укладывается подгруппа I группы с КПН, что можно объяснить минимальными сосудистыми изменениями в данном сроке беременности.
Однако в связи с отсутствием строгой специфичности в отношении изученных осложнений
беременности (гестоза, ПН) показатели МЭД можно использовать для прогнозирования осложненного течения беременности, а целенаправленно в отношении прогнозирования ПН, лишь в комбинации с другими показателями. В некоторой степени исключение составляет ДПН как в сочетании с гестозом, так и без него, так как в сравниваемых группах МЭД достоверно (p<0,05) не отличаются при реализации ПН данной степени тяжести (табл. 1, 3).
Таблица 1. Содержание маркеров эндотелиальной дисфункции, дицидуализации, апоптоза и
клеточной пролиферации у беременных групп сравнения в сроке 18–24 нед беременности (M±δ).
Таблица 2. Содержание маркеров эндотелиальной дисфункции, дицидуализации, апоптоза и
клеточной пролиферации у беременных групп сравнения в сроке 28–38 нед беременности (M±δ).
Таблица 3. Среднее значение показателей маркеров эндотелиальной дисфункции, децидуализации,
апоптоза и клеточной пролиферации у беременных с плацентарной недостаточностью различной
степени тяжести I и II групп сравнения в сроках 18–24 нед и 28–38 нед беременности (M±δ).
Следовательно, уровни МЭД в крови беременных группы высокого риска по ПН достоверно изменяются во II триместре беременности, но применять их для прогнозирования ПН и ее тяжелых форм следует в комбинации с другими маркерами.
В 18–24 нед гестации содержание в периферической крови лимфоцитов с фенотипом CD95+,
концентрации ПАМГ, ФНО-α и ФРП у беременных достоверно не отличаются (p>0,05) между собой в сравниваемых клинических группах, но имеются достоверные (p<0,05) отличия от группы контроля (табл. 1, 3). С учетом данного обстоятельства, применение изученных тестов может позволить прогнозировать ПН и ее тяжелые формы (СПН, ДПН), что важно при составлении индивидуальной программы превентивных мероприятий и контроля их эффективности (табл. 3). Комплексное тестирование на выделение группы высокого риска по тяжелым формам ПН обосновано тем, что в ранние сроки может преобладать то или иное патогенетическое звено развития данного осложнения беременности (нарушение ангиогенеза, децидуализации и регулирующего действия ростовых факторов, эндотелиальная дисфункция, нарушение процессов апоптоза, клеточной пролиферации и др.) [3, 11, 20].
Результаты исследования МЭД, МД, МА, ФРП в сравниваемых группах в сроке 28–38 нед гестации представлены в табл. 2 и 3.
Учитывая неспецифичность показателей, характеризующих эндотелиальную дисфункцию у беременных женщин с осложненным течением гестации, нами была проведена количественная оценка МЭД в отношении возможности диагностики тяжелых форм ПН (СПН, ДПН).
Анализ уровней ИЦ АЭАТ и общего IgE у беременных с ПН в III триместре гестации показал достоверные их отличия (p<0,05) независимо от степени тяжести ПН от данных контрольной группы: при КПН, СПН, ДПН ИЦ АЭАТ превышает контрольные значения соответственно в 1,6 раза, 2,4 раза, 3,6 раза; уровень общего IgE – в 1,2 раза, 1,3 раза, 1,6 раза (табл. 2, 3). При этом, несмотря на некоторую разницу между показателями I и II клинических групп (ПН без гестоза и в сочетании с гестозом), прослеживается четкая зависимость изученных показателей от степени тяжести ПН. Данная закономерность, согласно полученным данным, позволяет оценивать степень эндотелиальной дисфункции у беременных с осложненным течением гестации (ПН, гестоз) и выделять группу беременных с тяжелыми формами ПН Кроме того, изученные МЭД могут быть использованы для оценки эффективности профилактических и лечебных мероприятий.
В III триместре физиологической и осложненной ПН беременности выявлены достоверные
различия в содержании периферических лимфоцитов, экспрессирующих антиген активации
запрограммированной клеточной гибели CD95 (табл. 2, 3).
Согласно полученным данным, содержание лимфоцитов CD95+ у беременных контрольной группы достоверно (p<0,05) отличается от их уровня в группах женщин с ПН. При этом ста-тистический анализ не выявил достоверных различий (p>0,05) между беременными с ПН без гестоза и с наличием гестоза. Данное обстоятельство указывает на связь повышения содержания лимфоцитов CD95+ с ПН, а не с другой патологией. Среднее значение показателя у беременных с ПН (I и II групп) составило 55,7±5,8%. Содержание лимфоцитов с фенотипом CD95+ в зависимости от степени тяжести ПН представлено в табл. 2, 3.
Отмечено, что имеется сильная и средней силы положительная корреляционная связь между уровнем лимфоцитов CD95+ периферической крови беременных и степенью тяжести ПН: при КПН r=0,66; при СПН r=0,81; при ДПН r=0,92. Различия между полученными значениями достоверны (p<0,05) во всех группах с ПН различной степени тяжести.
Выявление Fas антигена (CD95) на мембране иммунокомпетентных клеток, индуцированного цито- и синцитиотрофобластом, свидетельствует о готовности клеток к апоптозу, их элиминации из организма в случае вступления в процесс запрограммированной клеточной гибели, что снижает иммунопатологические реакции иммунокомпетентных клеток на фетоплацентарный комплекс [17, 19, 21].
Если уровень лимфоцитов, экспрессирующих Fas/APO-1/CD95-рецептор, зависит от состояния цито- и синцитиотрофобласта (плодовой части плаценты), индуцирующих апоптоз лимфоцитов [13, 17, 21], то характер изменений в децидуальной оболочке (материнской части плаценты) можно оценить по содержанию ПАМГ в сыворотке крови беременных женщин [9].
Концентрация ПАМГ в III триместре осложненной ПН беременности свидетельствует о достоверных различиях показателя при ПН, особенно при ее тяжелых формах, от данных при физиологической гестации: при КПН уровень МД превышает контрольные значения в 2,9 раза, при СПН – в 5,3 раза, при ДПН – в 6,5 раза. При этом отсутствие достоверных различий между I и II группами сравнения (p<0,05) указывает на специфичность данного маркера в отношении ПН (табл. 2).
Корреляционный анализ между ПАМГ и уровнем лимфоцитов CD95+ показал наличие сильной и средней положительной корреляционной связи (r от 0,51 до 0,8); при этом, чем больше степень тяжести ПН, тем выше корреляционная связь между показателями, характеризующими степень выраженности нарушений в материнской и плодовой частях плаценты. Выявленную сильную положительную корреляционную связь между ПАМГ и ИЦ АЭАТ (r от 0,71 до 0,85) можно объяснить тем, что нарушение формирования гемохориального типа плацентации, сопровождающегося «физиологическим повреждением» эндотелиальной оболочки спиральных маточных артерий и в случае осложненного течения гестации – аутоиммунным повреждением цитотоксическими антиэндотелиальными антителами (ИЦ АЭАТ), ведет к нарушению децидуализации материнской части плаценты и изменениям маточно-плацентарной гемоциркуляции [2, 11, 15, 20].
В работах многих исследователей [3, 15, 17, 19] получены данные о влиянии цитокинов и, в частности цитокинов семейства ФНО, на процессы апоптоза и клеточной пролиферации. В связи с этим мы изучили концентрацию ФНО-α в сыворотке крови беременных женщин при физиологическом и осложненном ПН течении беременности с последующим сопоставлением полученных результатов со степенью тяжести ПН и с данными по экспрессии Fas-антигена на лимфоцитах периферической крови.
Концентрация ФНО-α в III триместре физиологической и осложненной ПН беременности представлена в табл. 2 и 3. Согласно полученным данным, концентрация ФНО-α у беременных контрольной группы достоверно (p<0,05) отличается от концентрации «лиганда смерти» в группах женщин с ПН (табл. 2). Среднее содержание цитокина у беременных I и II групп составило 912±123 пкг/мл (табл. 3). Статистическая обработка результатов выявила достоверные различия (p<0,05) между группами беременных с физиологической гестацией, беременными с ПН (I группа) и беременными с ПН на фоне
гестоза (II группа). Несмотря на десятикратное увеличение по средним значениям (табл. 3) в сыворотке крови ФНО-α у женщин с ПН, мы не выявили достоверных различий между I и II клиническими группами сравнения (p >0,05), что указывает на связь данного показателя с ПН, а не с гестозом.
Концентрация ФНО-α в сыворотке крови беременных в зависимости от степени тяжести ПН представлена в табл. 2, 3. В I и II группах сравнения межгрупповых достоверных различий при одинаковой степени ПН выявлено не было (p>0,05).
Корреляционный анализ между содержанием ФНО-α и уровнем лимфоцитов CD95+ в периферической крови беременных при ПН показал наличие средней положительной корреляционной связи между указанными показателями (r~ от 0,41 до 0,65). Сильная и средней силы положительная корреляция выявлена между концентрацией ФНО-α и степенью тяжести ПН (r от 0,54 до 0,88). Однонаправленность изменений содержания МА (лимфоциты CD95+, ФНО-α) в крови беременных женщин с различной степенью тяжести ПН и наличие положительной корреляционной связи между ними подтверждает заключение ряда исследователей [2, 19] о том, что ФНО-α оказывает регулирующее (индуцирующее) влияние на экспрессию Fas-антигена (СД95) и, возможно, может участвовать в запуске запрограммированной клеточной гибели не только системой ФНОR1-ФНО-α,
но и косвенно (через непрямые пути активации) системой FasR-FasL. Кроме того, достоверная
разница в концентрации ФНО-α в сыворотке крови беременных с различной степенью ПН дает возможность включить данный показатель в комплексную диагностику ПН и степени ее тяжести.
Клеточная пролиферация и запрограммированная клеточная гибель являются разнонаправленными процессами, определяющими судьбу конкретной клетки в клеточной популяции [1, 3, 15, 21]. В связи с этим мы провели оценку содержания в сыворотке крови беременных с физиологической и осложненной ПН беременностью ростового фактора, влияющего на пролиферацию и ангиогенез в плаценте (ФРП). Данные о содержании ФРП в крови женщин с физиологической и осложненной ПН беременностью в III триместре гестации представлены в табл. 2 и 3. Средний показатель содержания ФРП при физиологической беременности в III триместре достоверно (p<0,05) отличается от уровня
данного показателя в группах женщин с ПН. Достоверной разницы (p>0,05) между беременными с ПН без гестоза и беременными с гестозом по концентрации ФРП выявлено не было. Отсутствие влияния гестоза на уровень ФРП в крови беременных (беременные II клинической группы) можно объяснить специфичностью данного ростового фактора для плацентарной ткани. Среднее значение показателя у беременных с ПН (I и II группы) составило 174±25 пкг/мл.
В зависимости от степени тяжести ПН средние показатели содержания ФРП в сыворотке крови у беременных в III триместре гестации распределились следующим образом: при КПН – 282±23 пкг/мл; при СПН –182±13 пкг/мл; при ДПН – 141±10 пкг/мл (p <0,05; p <0,05; p <0,05). При межгрупповом
анализе содержания ФРП у беременных с одинаковой степенью тяжести ПН достоверных различий выявлено не было (p>0,05).
Корреляционный анализ между содержанием ФРП и уровнем лимфоцитов СД95+ в периферической крови беременных при ПН показал наличие отрицательной корреляционной связи средней силы между указанными показателями (r=-0,42; -0,57; -0,69 соответственно КПН, СПН и ДПН). Отрицательная корреляционная связь слабой и средней силы выявлена между концентрациями ФРП и ФНО-α при различных степенях тяжести ПН (r=-0,29; -0,43; -0,61 соответственно). Схожая закономерность получена и при корреляционном анализе уровне ФРП и ПАМГ (r=-0,39; -0,44, -0,55 соответственно), что свидетельствует о патогенетической связи ФРП и децидуального регулятора биоактивности инсулиноподобных факторов роста.
Разнонаправленность изменений содержания МА, МД и ФРП в крови беременных женщин с различной степенью тяжести ПН и наличие отрицательной корреляционной связи между ними свидетельствует о взаимообусловленности процессов клеточной пролиферации, децидуализации и запрограммированной клеточной гибели при беременности и может служить патогенетической основой для разработки дополнительных лабораторных критериев прогнозирования и ранней диагностики ПН, оценки степени
ее тяжести.
Показатели чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительного
и отрицательного результатов, диагностической точности метода для изученных способов комплексного тестирования по выделению групп высокого риска реализации тяжелых форм ПН
и диагностики ПН составили соответственно 91,0%, 88,6, 87,4, 86,6, 87,1% (для прогнозирования); 93,9%, 92,2, 90,4, 98,5, 93,5% (для диагностики), что свидетельствует о высокой прогностической и диагностической значимости разработанных методов.
При отсутствии возможности комплексного тестирования для прогнозирования тяжелых форм плацентарной недостаточности с применением четырех параметров (лимфоциты CD95+, ПАМГ, ФНО-α, ФРП) можно рекомендовать минимальный объем обследования, включающий 2 теста: определение ПАМГ, характеризующего состояние базальной (материнской) части плаценты, и маркера апоптоза (лимфоциты CD95+), характеризующего состояние синцитиотрофобласта (плодовой часть плаценты),
индуцирующего апоптоз лимфоцитов при ПН для снижения иммунопатологических реакций в системе «мать-плацента-плод».
Заключение
Таким образом, сроки реализации и степень тяжести ПН обусловлены началом и степенью дезадаптации эндотелиальной системы, активацией иммунопатологических реакций в плаценте,
проявляющихся индуцированной трофобластом запрограммированной клеточной гибелью лимфоцитов, изменениями регуляции клеточной пролиферации и децидуализации стромальных клеток. Наличие корреляционной связи между маркерами эндотелиальной дисфункции, децидуализации, апоптоза и клеточной пролиферации указывает на тесную патогенетическую связь между нарушениями ангиогенеза, функций сосудистого эндотелия, иммунопатологическими и пролиферативными процессами у беременных с ПН.
Прогнозирование и ранняя диагностика тяжелых форм ПН может осуществляться путем мониторинга содержания в крови маркеров эндотелиальной дисфункции, плацентарных белков материнской оболочки плаценты, апоптоза и клеточной пролиферации. Во II триместре беременности прогностически значимыми критериями в отношении ДПН являются повышение уровня ИЦ АЭАТ до 36,9±4,2%, общего IgE – до 351±18 нг/мл, ПАМГ – до 74,7±6,5 нг/мл, лимфоцитов, экспрессирующих Fas/APO-1/CD95-рецептор – до 48,3±3,2%, ФНО-α – до 202±18 пкг/мл, понижение сывороточной концентрации ФРП – до 248±13 пкг/мл.
