Эндометрий является специализированной гормонально регулируемой популяцией клеток, которая характеризуется рядом циклических морфологических и биохимических изменений, необходимых для создания оптимальных условий для развития эмбриона [1]. Нормальная анатомия полости матки и состояние эндометрия обеспечивают оптимальные условия для имплантации эмбриона и поддержания беременности. Любые отклонения в эндометрии способны повлечь за собой нарушения репродуктивной функции. Именно поэтому, по мнению многих исследователей, оценка состояния полости матки и эндометрия является необходимым этапом подготовки к программам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2]. Эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) определяется многими факторами, в числе которых прежде всего качество полученных эмбрионов и восприимчивость эндометрия на этапе имплантации.
Хронический эндометрит занимает первое место в структуре патологических изменений эндометрия, его распространенность у женщин с бесплодием варьирует от 2,8 до 68%, достигая своего максимума при наличии трубно-перитонеального фактора бесплодия [3, 4].
У пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе частота хронического эндометрита колеблется от 30 до 60%, частота обнаружения полипов эндометрия составляет 13%, гиперплазии эндометрия – 10% [3].
Хронический эндометрит – клинико-морфологический синдром, при котором в результате персистирующего повреждения эндометрия инфекционным агентом возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую биотрансформацию и рецептивность слизистой оболочки тела матки.
Многие авторы связывают хронический эндометрит с бесплодием неясного генеза, привычным невынашиванием беременности, самопроизвольными выкидышами и преждевременными родами [3, 5–7].
Гистологической верификацией диагноза является наличие в биоптатах эндометрия в первую фазу менструального цикла плазматических клеток [8–10]. Дополнительная морфологическая диагностика хронического эндометрита основана на выявлении очаговой лимфо-лейкоцитарной инфильтрации, эозинофилов, очагового фиброза стромы, склеротических изменений стенок спиральных артерий. Обсуждается возможность диагностики хронического эндометрита с помощью иммуногистохимических маркеров (в частности CD 138), пока не нашедших применения в рутинной практике ввиду увеличения экономических затрат [11, 12].
На сегодняшний день данные, касающиеся влияния хронического эндометрита на имплантацию эмбриона и эффективность попыток ЭКО, неоднозначны. Хронический эндометрит, по мнению одних авторов, часто ассоциируется с бесплодием и неудачными попытками ЭКО, по мнению других – не влияет на репродуктивную систему и успех программ ВРТ [3, 4, 13].
Внимание исследователей в последние годы сфокусировано на изучении мРНК экспрессии генов в эндометрии у пациенток с бесплодием, однако работы, посвященные изучению экспрессии генов при патологии эндометрия, единичны. Имеются данные о том, что в «окно имплантации» у пациенток с хроническим эндометритом экспрессия некоторых генов (маркеров ростовых факторов, апоптоза, цитокинов, матриксных металлопротеиназ, гемобоксных генов, эстрогенового и прогестеронового рецепторов) значительно отличается от экспрессии тех же генов у здоровых женщин, что обосновывает проведение дальнейших исследований в этом направлении [14].
Целью настоящего исследования стал анализ профиля экспрессии мРНК генов ростовых факторов инсулиноподобного фактора роста, связывающего протеин-1 (IGFBP1), эндотелиального фактора роста сосудов-А (VEGFA) и цитокинов: интерлейкина-15 (IL15), интерлейкина-18 (IL18) в эндометрии в период «имплантационного окна» при хроническом эндометрите у женщин с бесплодием.
Материал и методы исследования
Для достижения поставленной цели на базе ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России были обследованы 78 женщин репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, планирующих реализацию репродуктивной функции в программе ЭКО. Из них: 39 пациенток (1-я группа – основная) с верифицированным диагнозом хронического эндометрита и 39 пациенток (2-я группа – сравнения) с трубно-перитонеальным фактором бесплодия без хронического эндометрита.
Биопсию эндометрия проводили в амбулаторных условиях в день менструального цикла ЛГ+7, который определяли с помощью мочевого теста Clear Blue (Unipath Ltd, Великобритания), основанного на определении увеличения уровня ЛГ в моче. С помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier (Laboratorie C.C.D., Франция) получали биоптат эндометрия и помещали в пробирки со средой для стабилизации РНК (лизирующий раствор из системы для выделения нуклеиновых кислот «ПРОБА-НК», «ДНК-Технология», Россия).
В биоптатах эндометрия проанализирована экспрессия мРНК генов маркеров ростовых факторов (IGFBP1, VEGF) и цитокинов (IL15, IL18), учавствующих в процессах имплантации. Оценку уровня экспрессии мРНК проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции с предварительной стадией обратной транскрипции ОТ-ПЦР) в режиме реального времени коммерческими тест-системами («ДНК-Технология», Россия). Реакция амплификации проводилась с помощью детектирующего амплификата ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия).
Нормировка уровня экпрессии генов выполнена с использованием метода сравнения индикаторных циклов (метод Δ∆Cq) по четырем референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB. В качестве меры центральной тенденции выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки – верхний (L) и нижний квартили (H). Результаты представлены в виде Ме (0,25–0,75). Медиана значения уровня экспрессии в группе сравнения было принята за единицу. Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна–Уитни для несвязанных совокупностей.
Результаты исследования и обсуждение
Возраст обследованных женщин не различался между группами и составил в среднем 31,94±0,5 года в 1-й и 30,98±0,5 года во 2-й группе. Длительность бесплодия колебалась от 1 года до 15 лет, не имела межгрупповых различий и составила в среднем 5,4±0,35 года. На момент обследования все пациентки имели регулярный ритм менструаций. При анализе данных было отмечено, что хронические воспалительные заболевания органов малого таза в анамнезе выявлялись у 21 пациентки 1-й группы и у 16 пациенток 2-й (53,9 и 41,0% соответственно), однако значения не достигли уровня статистической значимости.
Первичное бесплодие было выявлено у 16 женщин (41,0%) в 1-й группе и у 21 (53,9%) во 2-й. Вторичное бесплодие диагностировано у 23 пациенток (59,0%) 1-й группы и у 18 женщин (46,2%) 2-й. Анализ исходов предыдущих беременностей выявил более высокую частоту медицинских абортов (51,3 против 45,2%) и самопроизвольных выкидышей (21,2 против 16,4%) у пациенток 1-й группы.
Результаты исследования, касающиеся особенностей экспрессия мРНК генов, кодирующих провоспалительные цитокины (IL15, IL18) и факторы роста (IGFBP1, VEGF) в «окно имплантации» у пациенток с хроническим эндометритом, продемонстрировали их значительные отличия по сравнению с аналогичными показателями женщин без хронического эндометрита. Так, при хроническом эндометрите у пациенток 1-й группы экспрессия мРНК гена IGFBP1 была снижена в 3,4 раза (р=0,031), Ме=0,29 (0,1–3,3) по сравнению с женщинами 2-й группы, Ме=1 (0,2–41,1); экспрессия мРНК гена IL-15 снижена в 1,5 раза (р=0,034), Ме = 0,7 (0,3–1,2), во 2-й группе – Ме=1 (0,8–1,4); экспрессия мРНК гена VEGF-A – также снижена в 1,5 раза (р=0,034), Ме=0,7 (0,4–1,0), во 2-й группе – Ме=1 (0,5–1,5); экспрессия мРНК гена IL18 снижена в 1,4 раза (р=0,041) Ме=0,7 (0,5–1,2), во 2-й группе – Ме=1 (0,8–1,2) (рисунок).
Полученные в нашем исследовании данные подтверждают мнение многих авторов относительно отрицательного влияния хронического эндометрита на репродуктивную функцию женщины.
Несомненная роль цитокинов: лейкемия-ингибирующего фактора (LIF), IL-6, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18 в процессах имплантации доказана в ранее выполненных исследованиях.
Результаты настоящего исследования также демонстрируют снижение в эндометрии экспрессии IL-15 в 1,5 раза у женщин с хроническим эндометритом. Биологические свойства IL-15 похожи на свойства IL-2, кроме того, показано, что в среднесекреторную фазу менструального цикла происходит переключение синтеза с IL-2 на IL-15 [15].
Согласно полученным нами данным, у женщин с хроническим эндометритом снижена экспрессия мРНК IL-18 в 1,4 раза по сравнению с пациентками без эндометрита. IL-18 – цитокин, принадлежащий к семейству IL-1, производится макрофагами и некоторыми другими клетками. IL-15 связывает рецепторы IL-18 и IL-12, тем самым стимулируя клеточный иммунитет. Вследствие этого естественные киллеры (NK клетки) и некоторые Т-клетки стимулируют выработку такого цитокина, как интерферон γ, который играет важную роль в активации макрофагов. Данные, касающиеся влияния IL-18 на рецептивность эндометрия, указывают на то, что отрицательным является как избыточное повышение его экспрессии, так и снижение [16].
Экспрессия различных факторов роста и их рецепторов наряду с цитокинами важна для процессов имплантации.
В нашем исследовании было выявлено уменьшение экспрессии мРНК VEGF-A в 1,5 раза при хроническом эндометрите по сравнению с данными женщин без хронического эндометрита. VEGFA наиболее значимый регулятор васкулогенеза (образование эмбриональной сосудистой системы) и физиологического и патологического ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе). VEGFA играет главную роль в развитии ангиогенеза и обеспечении доставки кислорода в эндометрии, выполняет иммунорегулирующие функции [17]. Семейство эндотелиальных факторов роста включает VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и плацентарный фактор роста, два трансмембранных рецептора – KDR (или Flk-1) и Flt-1 и один единственный растворимый рецептор (sFlt), который действует как антагонист VEGF.
Известно, что в эндометрии, кроме эпителиальных и стромальных клеток, источником VEGF служат скопления нейтрофильных гранулоцитов, которые непосредственным образом участвуют в пролиферации сосудов эндометрия [17]. В эндометрии VEGF был обнаружен в течение всего менструального цикла с увеличением уровня экспрессии от средней фазы пролиферации до секреторной. Это и соответствует наибольшей активности эндометриальных клеток. Снижение экспрессии эндотелиальных факторов роста в эндометрии может привести к неадекватной сосудистой перфузии и к нарушению рецептивности эндометрия и самопроизвольному выкидышу [17, 18].
М. Ольховская показала снижение в 3,2 раза уровня VEGF в эндометрии у женщин с безуспешными попытками ЭКО. Автором предложено рассматривать снижение содержания VEGF как прогностически неблагоприятный фактор исхода программы ВРТ, свидетельствующий о неполноценной функциональной активности эндометрия в период «имплантационного окна» [19].
Наряду со снижением экспрессии мРНК гена VEGF-A у женщин с хроническим эндометритом нами было выявлено снижение экспрессии мРНК гена фактора роста – IGFBP1в 3,4 раза. IGFBP1 относят к семейству эпидермальных факторов роста и рассматривают его как важный маркер имплантации. IGFBP1 образуется стромальными клетками, особенно во время их децидуализации. Экспрессия IGFBP1 контролируется несколькими факторами, включая инсулин и IGF.
В работе N.C. Douglas и соавт. было показано, что у пациенток с беременностями, наступившими в программе ЭКО, экспрессия мРНК гена IGFBP1 была значительна выше, чем в группе женщин с отрицательным результатом программы [20]. Таким образом, авторы делают вывод, что IGFBP1 является значимым маркером успешной имплантации в программе ЭКО и ПЭ.
В исследовании M.M. Elbehery и соавт. (2011) было выявлено снижение экспрессии мРНК гена IGFBP1 в среднесекреторную фазу менструального цикла у пациенток с полипом эндометрия перед гистероскопией по сравнению с экспрессией мРНК гена после гистероскопии и полипэктомии [21]. Известно также, что экспрессия IGFBP1 резко увеличивается во время беременности [22].
Структурные и молекулярные перестройки эндометрия при хроническом эндометрите характеризуются наличием клеток воспалительного инфильтрата, фибробластическими реакциями и изменениями в составе экстрацеллюлярного матрикса, апоптозом функционального слоя, вызывая тем самым неспособность эндометрия воспринимать регуляторные импульсы. Структурно-функциональные и молекулярные нарушения в эндометрии при хроническом эндометрите в период «окна имплантации» определяют исход имплантации и могут являться причиной бесплодия [23].
Заключение
В результате проведенного исследования установлено, что у женщин с хроническим эндометритом в период «окна имплантации» в слизистой оболочке матки снижен уровень экспрессии мРНК генов, значимых для успешной имплантации: IGFBP1, VEGF-A, IL-15, IL-18. Полученные результаты позволяют предположить, что ассоциация хронического эндометрита с бесплодием и привычным невынашиванием беременности может быть обусловлена нарушением рецептивности эндометрия.
