В настоящее время задержка роста плода (ЗРП) остается актуальной проблемой современного здравоохранения, что обусловлено достаточно высокой частотой данного осложнения беременности (5—24%) и определяется большим удельным весом этой патологии в структуре перинатальной заболеваемости и смертности [1, 2]. В последнее десятилетие в медицине обсуждается гипотеза «фетального программирования», согласно которой здоровье детей, может быть связано с условиями внутриутробного развития [3]. Большинство ученых рассматривают ЗРП как мультифакториальное заболевание, являющееся результатом совместного действия генетических факторов матери и плода, а также факторов окружающей среды [4,5]. Часть факторов риска развития ЗРП связана с нарушением в работе иммунной системы беременной женщины [6]. Ранее при исследовании цитокинового профиля периферической крови беременных женщин, было выявлено статистически значимое снижение содержания IL-10 в моноцитах у женщин с ЗРП по сравнению с показателями контрольной группы [6], однако данные изменения преимущественно связывали с экзогенными факторами.
Появляющиеся в последнее время данные подтверждают взаимосвязь между генетическими факторами риска и развитием ЗРП, однако результаты этих исследований в различных популяциях разноречивы [7, 8]. Поэтому необходимо проведение комплексных исследований полиморфизмов генов, задействованных в развитии данной патологии. Уточнение генетических механизмов формирования ЗРП позволит обосновать профилактику и лечение ЗРП еще на этапе прегравидарной подготовки. Аналогичный подход реализуется в обследовании женщин на полиморфизм генов тромбофилии. [9]. Существуют работы, посвященные исследованию полиморфизма гена IL-10, связанные с синтезом данного цитокина, определяемые единичной нуклеотидной заменой в регуляторной области в развитии острого панкреатита и рака молочной железы [10, 11]. Известно, что полиморфный аллель IL-10-1082A является низкофункциональным и определяет снижение продукции белковой молекулы цитокина IL-10 [12]. В связи с чем, можно предположить, что у женщин с ЗРП при выявлении аллеля IL-10-1082A будет отмечаться снижение продукции и секреции IL-10 моноцитами периферической венозной крови. Работы, посвященные взаимосвязи выработки IL-10 с полиморфизмом его гена при ЗРП отсутствуют.
Цель исследования — уточнить факторы риска ЗРП, определить особенности генотипа по полиморфизму IL-10 А-1082G и его влияние на продукцию и секрецию IL-10 моноцитами периферической крови у женщин с ЗРП.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В условиях акушерской клиники ФГБУ «Ивановского НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова» МЗ РФ (директор – д.м.н., профессор Малышкина А.И.) обследованы 209 женщин в сроке беременности 26—39 недель. Основную группу составили 108 женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, которые в зависимости от степени ЗРП были разделены на 2 подгруппы: I подгруппа — 54 беременные с отставанием фетометрических показателей плода по данным УЗИ от нормативных значений для данного срока беременности на 2 недели (ЗРП I степени) и II подгруппа — 54 пациентки с отставанием фетометрических показателей на 3-4 недели и более (ЗРП II—III степени). Контрольную группу составили 101 беременная женщина без признаков ЗРП на момент обследования. Взятые под наблюдение пациентки являлись жительницами Ивановской, Владимирской и Костромской областей (Центральный федеральный округ) и были русскими по этнической принадлежности. Критерии исключения: тяжелая преэклампсия, тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, пороки развития плода.
В работе проводили общеклиническое и лабораторное обследование, ультразвуковое исследование. Материалом для исследования являлась периферическая венозная кровь. Полиморфизм гена IL-10 А-1082G оценивался методом ПЦР в режиме реального времени с использованием наборов реагентов фирмы «Литех» (Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Внутриклеточная продукция IL-10 моноцитами периферической крови определялась методом проточной цитофлюорометрии с использованием моноклональных антител анти-IL-10 меченных фикоэритрином (BD bioscience, США). Обогащенную культуру моноцитов получали с помощью стандартного метода двукратной адгезии на пластике. Определение уровня IL-10 в супернатантах 24-часовых культур моноцитов периферической крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческих наборов «ИФА-IL-10» (ООО «Цитокин», Россия). Статистический анализ полученных данных осуществлялся с помощью методов статистики в пакете прикладных лицензионных программ «Microsoft Office 2010», «Statistica for Windows 6.0.». Количественное описание величин проводилось с помощью среднего арифметического и стандартного отклонения (М(SD)) и в виде медианы с указанием 25-го и 75-го перцентилей (Ме (Q1;Q3)). Уровень статистической значимости различий бинарных данных между группами оценивался с использованием критерия χ2. Уровень статистической значимости между показателями оценивали с использованием критерия Манна-Уитни (различия в группах считались, как статистически значимые при р>0,05). Расчет значений относительного риска — ОР, доверительного интервала — ДИ осуществлялся с применением системы «OpenEpi».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Клинико-анамнестические особенности обследованных женщин представлены в табл. 1. Средний возраст пациенток в основной группе составил 28,46 (6,20) года, в контрольной — 29,27 (5,89) лет (р>0,05). Сравнительный анализ не выявил значимых различий в социальном статусе обследованных женщин (р>0,05). В группе женщин с ЗРП чаще отмечено табакокурение (52,8%) по сравнению с контролем (7,9%) (ОР = 6,66, 95% ДИ: 3,35—13,26), при ЗРП I степени данную вредную привычку отмечали 50,0% женщин (ОР=3,43, 95% ДИ: 2,35—5,00), при ЗРП II—III степени - 55,6% (ОР=3,85, 95% ДИ: 2,60-5,70) (р<0,001 во всех случаях). По данным литературы, табакокурение приводит к многочисленным изменениям в организме беременной женщины (повышению АД, гиперагрегации тромбоцитов, гиперкоагуляции в плазменном звене гемостаза и к появлению маркеров активации внутрисосудистого свертывания крови), что в дальнейшем приводит к нарушению плацентарного кровообращения, хронической гипоксии плода и развитию ЗРП [13, 14].
В структуре экстрагенитальных заболеваний обращала на себя внимание более высокая частота встречаемости нейроциркуляторной дистонии у женщин с ЗРП — 51,9% (ОР=1,77, 95% ДИ: 1,38—2,28), при ЗРП I степени — 63,1% (ОР=3,08 95% ДИ: 1,96—4,85) и 40,7% при ЗРП II-III степени (ОР=1,68, 95% ДИ: 1,11—2,55). В группе женщин с ЗРП II—III степени также чаще отмечен в анамнезе хронический пиелонефрит (ОР=2,57, 95% ДИ:1,78—3,72), заболевания щитовидной железы (ОР=2,42, 95% ДИ: 1,59—3,68). Полученные нами данные о характере заболеваний обследованных женщин согласуются с результатами других исследований, в которых указывается значение экстрагенитальной патологии в развитии ЗРП [15]. В анамнезе у женщин с ЗРП I степени чаще отмечали вульвовагиниты (ОР=2,15, 95% ДИ: 1,33—3,47), привычное невынашивание ранних сроков (ОР=2,01, 95% ДИ: 1,27—3,19). Женщины с ЗРП чаще указывали на аборты перед первыми родами (ОР=1,54, 95% ДИ:1,17—2,03). Неоднократные выскабливания полости матки способствуют формированию хронического эндометрита, что приводит к нарушению васкуляризации эндометрия, нарушению адгезии зиготы и инвазии трофобласта, недостаточности децидуальной ткани и развитию ЗРП при последующих беременностях [16]. Среди осложнений беременности у женщин с ЗРП, чаще отмечалась угроза прерывания беременности в I (ОР=1,40, 95% ДИ: 1,08—1,81) и во II триместрах (ОР=1,94, 95% ДИ: 1,50—2,51); вызванная беременностью артериальная гипертензия без значительной протеинурии (ОР=1,84, 95% ДИ: 1,45-2,32). По данным литературы, угроза прерывания беременности способствует нарушению взаимодействия инвазивного цитотрофобласта и материнских факторов, приводящих к неполноценной физиологической трансформации стенок спиральных артерий, нарушению кровоснабжения плаценты, формированию плацентарной недостаточности и ЗРП во II триместре беременности [6, 17]. Пациентки с ЗРП чаще были родоразрешены досрочно (ОР=2,09, 95% ДИ: 1,72—2,55) (см. табл. 1).
По данным литературы, нарушение баланса цитокинов способно приводить к различным осложнениям беременности [18—20]. Цитокины способны оказывать как эмбриотоксическое (IL-1 и IL-6), так и эмбриопротекторное (IL-4, IL-10) влияние [21, 22]. Наличие полиморфных вариантов в генах цитокинов, влияющих на их синтез и функциональную активность, может быть фактором риска осложненного течения беременности [6]. Можно предположить, что взаимосвязь синтеза IL-10 с аллельным полиморфизмом гена IL-10 является одним из механизмов развития ЗРП. Данный цитокин является одним из важнейших противовоспалительных цитокинов. IL-10 ингибирует высвобождение цитокинов Th1, передачу сигналов NF-κB, экспрессию молекул HLA класса II, функцию макрофагов и дендритных клеток [23]. Известно, что IL-10 является регуляторным цитокином, контролирующим иммунный ответ организма беременной женщины и формирование плаценты [24]. Снижение уровня IL-10 может нарушать баланс иммунных процессов при беременности, а нарушение контроля над проходящими иммунологическими процессами, в свою очередь, может приводить к нарушению дифференцировки и инвазии трофобласта с развитием угрозы прерывания беременности, что в последующем может привести к формированию плацентарной недостаточности и развитию ЗРП [2, 6, 17].
Анализ генотипа по полиморфизму IL-10 А-1082G всех обследованных выявил, что 24,4% женщин являлись гомозиготами по аллелю IL-10 -1082G; 32,8% имели гетерозиготный генотип IL-10 -1082А/G; 42,8% — гомозиготный генотип IL-10 -1082А/А. В группе беременных с ЗРП гомозиготный генотип по аллелю -1082G выявлен у 20 (19,1%) обследованных. У 85 (80,9%) женщин данной группы было установлено присутствие в генотипе низко функционального аллеля IL-10 -1082А. При этом у 54 (51,4%) женщин был выявлен гомозиготный генотип IL-10 -1082А/А и у 31 (29,5%) - гетерозиготный генотип IL-10 -1082А/G.
У женщин основной группы с ЗРП, засчет подгруппы с ЗРП II—III степени, чаще встречался гомозиготный генотип по аллелю -1082А по сравнению с женщинами контрольной группой (51,4% основной группы против 33,3% контрольной, р=0,01; ОР=1,42, 95% ДИ: 1,09—1,84 и 58,5% подгруппы с ЗРП II—III степени против 33,3% контрольной, р=0,005; ОР=1,92, 95% ДИ: 1,24—2,98, соответственно). У женщин с ЗРП независимо от ее степени по сравнению с группой контроля, статистически значимых отличий в частотах с гомозиготным и гетерозиготным генотипом по аллелю -1082G выявлено не было (p>0,05). По данным литературы частота встречаемости гомозигот по аллелю IL-10 -1082G в европеоидной популяции составляет 52,0—62,5%; частота гетерозиготного генотипа IL-10 -1082G/А составляет 13,0—49,9% и 18,0—39,0% обследованных имеют гомозиготный генотип IL-10 -1082А [25]. По нашим данным среди населения трех областей Центрального федерального округа России (Ивановская, Костромская, Владимирская области) гомозиготы по аллелю IL-10 -1082G встречались в два раза реже, чем среди европейского населения; а обладатели гетерозиготного генотипа IL-10 -1082А/G и гомозиготного генотипа IL-10 - 1082А/А напротив у обследованных русских выявлялся чаще, чем в европейских популяциях [25]. Поведенное нами исследование характера распределения частот аллелей и генотипов по полиморфизму IL-10 А-1082G у беременных женщин показало, что наличие гомозиготного генотипа по аллелю -1082А, повышает относительный риск развития ЗРП (р=0,01; ОР=1,42, 95% ДИ: 1,09—1,84) и ЗРП II—III степени (р=0,005; ОР=1,92, 95% ДИ: 1,24-2,98).
При этом сочетание факторов риска табакокурения и наличия генотипов IL-10 -1082A/А или IL-10-1082G/А повышало риск развития ЗРП при беременности. (ОР=3,19, 95% ДИ:1,61—6,30) [патент на изобретение №2646505 от 5.03.18].
Известно, что полиморфизм-1082А промоторного участка гена IL-10 оказывает негативное влияние на гестационный процесс в ранние сроки беременности [26]. Учитывая ассоциацию данного полиморфизма с риском невынашивания беременности, можно предположить, что нарушение процессов инвазии трофобласта, являющееся причиной прерывания беременности в ранние сроки, а в случае сохранения и пролонгирования беременности может привести к развитию плацентарной недостаточности и ЗРП [27].
Данные по продукции и секреции IL-10 в крови у женщин с ЗРП представлены в табл. 2. Анализ продукции и секреции IL-10 моноцитами периферической венозной крови в зависимости от генотипа женщины по полиморфизму IL-10 А-1082G показал, что сывороточный уровень IL-10 в периферической венозной крови у женщин с ЗРП I степени и генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А был статистически значимо выше его уровня в контрольной группе (р=0,02).
У беременных контрольной группы с генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А по сравнению с показателями женщин, имеющих генотип IL-10 -1082G/G было выявлено снижение внутриклеточной продукции IL-10 моноцитами периферической крови (р=0,03). Только в группе женщин с ЗРП II-III степени и генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А отмечено снижение внутриклеточной продукции IL-10 моноцитами периферической крови по сравнению с контрольной группой (р=0,03).
В супернатантах 24-часовых культур моноцитов периферической крови, у женщин с генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А в группах с ЗРП, ЗРП I и ЗРП II-III степени имело статистически значимое снижение уровня IL-10 по сравнению с группой контроля (р=0,005, р=0,007 и р=0,03 соответственно). У женщин с ЗРП с генотипом IL-10 -1082G/G, независимо от степени ее тяжести, статистически значимых различий в уровне сывороточного IL-10, содержании периферических IL-10+-моноцитов, количестве IL-10 в супернатантах 24-часовых культур моноцитов выявлено не было (р>0,05 во всех случаях).
Ранее во многих работах было показано что низкий уровень IL-10 приводит к осложненному течению беременности, таким как угрожающий выкидыш, преэклампсия, ЗРП [18—20]. E. Nouvellon и соавт. [12] в 2015 г. показали, что аллельный вариант гена IL-10 - 1082А определяет низкую продукцию белковой молекулы IL-10. Это соответствует полученным нами данным о снижении внутриклеточной продукции IL-10 периферическими моноцитами женщин контрольной группы с генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А по сравнению с женщинами, имеющими генотип IL-10 -1082G/G. Однако в группах с ЗРП мы не выявили статистически значимых различий в продукции и секреции IL-10 в зависимости от генотипа. Можно предположить, что у женщин с ЗРП с низкофункциональным аллелем IL-10 -1082А включаются какие-то дополнительные механизмы регуляции синтеза IL-10, возможно, за счет подключения других клеточных популяций, внутриклеточно продуцирующих данный цитокин. Снижение уровня продукции IL-10 при осложненном течении беременности было выявлено в исследованиях Shi-Bin Cheng [28]. Непосредственная связь низкого уровня IL-10 и развития ЗРП показана в работе F.Y. Azizieh и R. Raghupathy [18]. Напротив, в исследованиях А.В. Кудряшовой и соавт. [6] в группе женщин с ЗРП, было обнаружено повышение содержания IL-10 в сыворотке периферической крови, что совпадает с результатами нашего исследования в подгруппе женщин с ЗРП I степени и генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А. Повышение сывороточного содержания IL-10, может быть связано с его секрецией разными клеточными популяциями и отражать суммарное содержание цитокина [6], что косвенно подтверждает высказанное выше предположение.
Мы оценили относительное содержание IL-10+-моноцитов периферической крови и спонтанную секрецию IL-10 по содержанию цитокина в супернатантах 24-часовых культур моноцитов периферической венозной крови. А.В. Кудряшовой и соавт. (2009) у женщин с ЗРП отмечалось снижение относительного содержания IL-10+-моноцитов периферической крови и IL-10 в супернатантах 24-часовых культур моноцитов периферической крови [6]. По нашим данным снижение уровня периферических IL-10+-моноцитов наблюдалось только у женщин с ЗРП II-III степени и генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А, а уровня IL-10 в супернатантах у женщин с генотипом IL-10 -1082А/G или IL-10 -1082А/А - у всех женщин с ЗРП. В то время как у женщин с генотипом IL-10 -1082G/G статистически значимых изменений в уровне моноцитов IL-10+ и IL-10 в супернатантах 24-часовых культур моноцитов периферической крови нами выявлено не было. Снижение внутриклеточной продукции и секреции IL-10 моноцитами периферической крови может быть обусловлено наличием у женщин с ЗРП низкофункционального аллельного варианта гена IL-10 - 1082А.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наиболее значимыми факторами риска развития ЗРП являются табакокурение, экстрагенитальная патология, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Результаты исследования позволяют предполагать, что полиморфизм гена IL-10 А-1082G является дополнительным фактором, регулирующим иммунный баланс в течение беременности при развитии ЗРП.
