Оценка экспрессии маркеров стволовых клеток в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриоидными кистами яичников

Дубровина С.О., Берлим Ю.Д., Чирский В.С., Мажутин В.Ю., Арешян К.А.

ФГБОУ ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России
Цель исследования. Сравнить уровни рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), стадиеспецифичного эмбрионального антигена 1 (SSEA-1, иначе СD15) в эутопическом, эктопическом и нормальном эндометрии.
Материал и методы. В I группу вошли 70 пациенток с эндометриоидными кистами яичников, во II группу - 24 пациентки с бесплодием неуточненного генеза без эндометриоза. Женщинам I группы выполнялось эндоскопическое удаление эндометриоидной кисты и гистероскопия, а II группы - лапароскопия, хромогидротубация и гистероскопия с забором материала для иммуногистохимического исследования.
Результаты. Выявлено повышение экспрессии CD15 в эктопическом эндометрии как в железе (35(32;37); 8(8;9); р=0,002), так и в строме (16(15;22); 1(0,8;1,3); р=0,003), а также повышение PDGFR, как в железе (38(38;41); 9(8;10); р=0,002), так и в строме (18(17;19); 1,1(0,8;1,4); р=0,001). Отмечено повышение CD15 (8(8;9); 8(6,5;8); р=0,006) и PDGFR (9(8;10); 8(7,5;9); р=0,001) в железах эутопического эндометрия в сравнении с нормальным.
Заключение. Полученные в ходе исследования результаты подтверждают теорию о роли стволовых клеток в патогенезе эндометриоза, что может лежать в основе разработок патогенетической терапии данного заболевания.

Ключевые слова

эндометриоидные кисты яичников
рецептор тромбоцитарного фактора роста
стадиеспецифичный эмбриональный антиген 1 (СD15)

Классическая теория Sampson J.A. о развитии эндометриоза базируется на попадании клеток эндометрия в брюшную полость во время ретроградной менструации [1].

Еще в 1978 году В.А. Прянишниковым была постулирована идея о том, что в циклической регенерации эндометрия играют роль стволовые клетки [2]. А 30 лет спустя в рядe работ было выдвинуто прeдположение о роли стволовых клeток в патогeнезе эндометриоза [3]. Клeточные популяции со свойствами стволовых клеток были обнаружeны на базальной мeмбране эндомeтрия [4], что открыло новые перспективы в изучении патогенеза эндометриоза [5]. Мезенхимальные стволовые клетки и эпителиальные клетки-предшественники, как две популяции стволовых клеток, были идентифицированы в эндометрии в исследованиях 2007 года, а в 2011 году стволовые клетки выявлены уже в очагах эндометриоза [6, 7]. Полученные данные привели к убеждению о формировании эндометриоидных имплантов посредством распространения стволовых клеток эндометрия через маточные трубы в период менструации [5].

Доказательством роли стволовых клеток может служить факт повышенной инвазии в культуре стромальных эндометриальных клеток, полученных от пациенток с эндометриозом [6], однако вопрос о пусковом механизме, способном активировать стволовые клетки в эутопическом и эктопическом эндометриях, остается открытым [8].

Возможно, важную роль играют генетические и иммунологические факторы, потенцирующие выживание клеток в эктопических очагах. Многочисленные исследования показали геномные различия между эутопическим и нормальным эндометрием, подтверждая, что эндометриальные стволовые клетки/предшественники могут также отличаться между женщинами с эндометриозом и без [9]. Более высокие уровни клонирования были найдены в нормальном эндометрии, по сравнению с эутопическим эндометрием и выше – в эутопическом эндометрии по отношению к эктопическому [7]. Это поддерживает мнение, что стволовые клетки/предшественники требуют внешние факторы для активации пролиферации и дифференцировки в эктопических очагах.

Периваскулярные эндометриальные мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (эМСК) локализуются, как в базальном слое эндометрия, так и в функциональном. Предположение об их распространении во время менструации в брюшную полость подтверждается данными о том, что менструальная кровь женщин с эндометриозом содержит больше фрагментов базального эндометрия, по сравнению с контролем [9]. эМСК могут быть идентифицированы специальными маркерами, включая двойную позитивность CD146 и фактор роста тромбоцитов β (platelet derived growth factor beta (PDGFRβ)) и SUSD2+ (распознаваемыми с помощью W5C5 антител) [10]. Возможно, ответ на вопрос, почему у 90% женщин ежемесячно происходит распространение эндометриальных мезенхимальных клеток, а эндометриоз развивается лишь у 6–10% из них, смогут дать исследования, направленные на изучение различий между экспрессией CD146+PDGFRβ+ эндометриальными стволовыми клетками в функциональном слое, по сравнению с базальным [11].

Стадиеспецифичный эмбриональный антиген 1 (stage-specific embryotic antigen 1, SSEA, иначе CD15) – маркер дифференцированных плюриопотентных стволовых клеток человека (или нейтрофилов, у которых CD15 опосредует фагоцитоз и хемотаксис), найден в эктопических перитонеальных эндометриоидных очагах в исследованиях 2013 года [12]. CD15 является молекулой адгезии углеводов, которая может быть экспрессирована на гликопротеинах, гликолипидах и протеогликанах. А.М. Хачатрян с соавторами в 2016 году при исследовании экспрессии данного маркера в эндометриоидных гетеротопиях и аутологичном эндометрии выявили его повышенную экспрессию в эпителиальном компоненте очагов эндометриоза, что, по мнению авторов, свидетельствует об относительной незрелости эндометриоидных гетеротопий [13].

Принимая во внимание, все более возрастающий интерес к роли стволовых клеток в патогенезе эндометриоза, мы решили провести исследование клеток, позитивных в отношении рецептора PDGFR, который является белком, регулирующими пролиферацию, дифференцировку и рост клеток, а также SSEA-1, иначе CD15, являющегося посредником клеточных взаимодействий, в эутопическом и эктопическом эндометрий женщин с эндометриоидными кистами яичников и в нормальном эндометрии, что явилось целью нашего исследования.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 94 пациентки репродуктивного возраста, которые были разделены на 2 группы: в I группу вошли 70 пациенток с эндометриоидными кистами яичников, а II группу (группа сравнения) составили 24 пациентки с бесплодием неясного (неуточненного) генеза без эндометриоза.

Репродуктивный возраст, ультразвуковые признаки эндометриоидных кист яичников, лапароскопически и морфологически подтвержденный диагноз эндометриоидной кисты яичника стали критериями включения в I (основную) группу исследования. Женщины репродуктивного возраста с отсутствием эндометриоза при лапароскопическом вмешательстве вошли в группу сравнения. Исключались из исследования пациентки при наличии экстрагенитального эндометриоза, варикозного расширения вен малого таза, опухоли яичников или другой локализации, а также сопутствующей декомпенсированной экстрагенитальной патологии.

Все исследования проводились с разрешения этического комитета (протокол №50/5, от 18 ноября 2014 г.) и при добровольном информированном согласии пациентки на участие в исследовании.

Пациенткам предлагалось заполнить опросник для анализа анамнестических данных до оперативного вмешательства. Затем проводился анализ клинико-анамнестических показателей и данных гинекологического осмотра.

На следующем этапе исследования пациенткам I группы выполнялось эндоскопическое вмешательство с целью диагностики наружного генитального эндометриоза, подтверждения наличия эндометриоидных кист яичников и установления степени тяжести эндометриоза (соответственно пересмотренной классификации Американского общества фертильности (r–AFS)). Так же в ходе операции выполнялось удаление эндометриоидной кисты, сальпингоовариолизис, гистероскопия с забором материала для иммуногистохимического (ИГХ) исследования. Пациенткам II группы проводилась лапароскопия с хромогидротубацией и гистероскопией, забор цуга эндометрия для ИГХ исследования. Показанием к диагностической лапароскопии служило бесплодие неуточненного генеза. Оперативное вмешательство пациенткам обеих групп выполнялось с 8 по 11 дни менструального цикла.

Ультразвуковое сканирование органов малого таза выполняли на 5–7-й день менструального при помощи оборудования для ультразвуковой диагностики «Toshiba (Eccocce) SSA340» с использованием конвексного электронного эндовагинального датчика с диапазоном частоты 3,5–6,5 MHz (Япония).

В условиях операционной гинекологического отделения под общей анестезией с искусственной вентиляцией легких выполняли оперативное вмешательство лапароскопическим доступом и гистероскопию с использованием оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия). При этом цистэктомия у женщин первой группы проводилась по методике, способствующей максимальному сохранению нормальной ткани яичников [14, 15].

Получeнный в ходe опeрации материал помещался в одноразовые герметичные контейнеры с соотношением фиксирующего раствора (10% забуференный формалин нейтральной реакции) к ткани как 10 и более к 1. Срезы толщиной не более 4 мкм получали путем проводки на ротационном микротоме Accu-Cut SRM Sakura.

Подготовка к ИГХ исследованию проводилась по стандартной схеме гистологического исследования. Перед окрашиванием гистологические срезы депарафинизировали. В работе использовались следующие антитела:

  • антитела PDGFR Rabbit Polyclonal 0.1 ml (Спринг Биосайенс Корпорейшн);
  • мышиные моноклональные антитела к CD15 0,1 мл (Cell Marque Corporation. 6600 Sierra College Park Boulevard Rocklin, Ca 95677 United States).

Оценка результатов ИГХ реакции проводилась с помощью балльной шкалы: 0, 1+, 2+, 3+; при этом 0 – отсутствие мембранного окрашивания или наличие слабого окрашивания менее 10% клеток, 1+ – слабое мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ – умеренное мембранное окрашивание более 10% клеток или сильное мембранное окрашивание менее 30% клеток, 3+ – сильное полное окрашивание мембран более 30% клеток. Так как при таком кодировании переменных их вариативность и, соответственно, информативность очень мала, было решено перейти к их точному процентному выражению.

Для количественных признаков в сравниваемых группах производилась оценка среднего и его стандартного отклонения, медианы с определением 25 и 75% процентилей (1–3 квартиль). Для оценки межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни для независимых выборок, а также проводили анализ четырехпольных таблиц. В случае анализа четырехпольных таблиц при ожидаемом явлении хотя бы в одной ячейке менее 10, нами рассчитывался критерий χ2 с поправкой Йейтса, позволяющей уменьшить вероятность ошибки первого типа, то есть обнаружения различий там, где их нет. В тех случаях, когда число ожидаемых наблюдений в любой из ячеек четырехпольной таблицы было менее 5, для оценки уровня значимости различий использовался точный критерий Фишера.

Обработка исходных признаков осуществлялась с использованием пакетов прикладных программ Statistica версии 12.5 и EXCEL 2010, SPSS 25.002 и пакета MedCalc 18.9.1.

Результаты исследования и обсуждение

Согласно клинико-анамнестической оценке пациенток с эндометриоидными кистами яичников и без эндометриоза, выявлено отсутствие различий между группами по возрасту, началу менархе, продолжительности менструального цикла и альгодисменорее (р=0,6). Статистически значимые различия были выявлены в отношении гиперполименореи (р=0,003) (табл. 1, 2).

Анализ структуры гинекологических заболеваний выявил большую частоту выявления дисплазии шейки матки у пациенток с эндометриозом, по сравнению с отсутствием такового (табл. 3).

Определение стадии эндометриоза и оценка степени спаечного процесса осуществлялась согласно классификации Американского общества по репродуктивной медицине (r-AFS) (1996 год). У пациенток с эндометриоидными кистами яичников в 100% случаев была III-IV степень распространения эндометриоза, а тяжесть спаечного процесса была достоверно выше у пациенток первой группы (табл. 4).

Согласно полученным результатам, статистически значимые различия выявлены у пациенток первой группы в эутопическом и эктопическом эндометрии по всем маркерам, как в строме, так и в железах (р<0,05), при этом CD15 и PDGFR повышены в эктопическом эндометрии, в сравнении с эутопическим (табл. 5).

Далее был проведен анализ исследуемых параметров в эутопическом и нормальном эндометрии. Статистически значимые отличия были отмечены в отношении PDGFR и CD15 в железах с повышением в эутопическом эндометрии (табл. 6).

Таким образом, между эутопическим и эктопическим эндометрием статистически значимые различия выявлены по обоим маркерам, как в строме, так и в железах.

Количество CD15 (SSEA) позитивных клеток было идентичным в эутопическом и нормальном эндометрии в строме. Согласно проведенному математическому анализу, количество этих клеток незначительно, но статистически значимо повышено в эутопическом эндометрии. При этом, их число в эктопическом эндометрии многократно превышает таковое в эутопическом эндометрии, что подтверждает факт обладания эндометриоидными гетеротопиями более высокой экспрессии маркеров стволовых клеток [12, 13].

Очень важным является тот факт, что для эктопического эндометрия характерно значительное повышение уровня PDGFRβ позитивных клеток, по сравнению с эутопическим. При этом, нами были отмечены лишь незначительные различия эутопического и нормального эндометрия в отношении этого маркера. Повышение уровня PDGFRβ позитивных клеток свидетельствует о возможном увеличении эМСК в эутопическом и эктопическом эндометрии при эндометриозе.

Заключение

С 2007 года внимание исследователей сосредоточено на доказательстве роли стволовых клеток в патогенезе эндометриоза, что не исключает, а, напротив, унифицирует все существующие на сегодняшний день теории развития этой патологии. Сложность идентификации стволовых клеток – главное препятствие для изучения этого вопроса. В представленной нами работе проведено исследование двух маркеров стволовых клеток не только в стенках эндометриоидных кист, но и в эутопическом эндометрии женщин с эндометриомами. Сравнение эутопического эндометрия выполнено также с нормальным (у женщин без эндометриоза). В результате было зафиксировано значительное повышение количества PDGFR и CD15 позитивных клеток в эктопическом эндометрии. Эутопический и нормальный эндометрий незначительно, но статистически значимо отличаются по CD15 и PDGFR в железах с преобладанием в эутопическом эндометрии. Впечатляющее повышение количества PDGFR и CD15 позитивных клеток в стенках эндометриоидных кист подтверждают роль стволовых клеток в патогенезе эндометриоза.

Вопрос о том, что «мотивирует» стволовые клетки мигрировать в брюшную полость и, в частности, в яичники, формируя очаги эндометриоза, – тема дальнейших исследований, где несомненная роль будет принадлежать исследованию генетических и эпигенетических факторов. Также требует объяснения тот факт, что эутопический эндометрий пациенток с эндометриоидными кистами яичников, пусть совсем незначительно, но отличается от нормального эндометрия.

В перспективе данные исследования позволят обосновать этиопатогенетическую терапию, направленную на уменьшение «притока» стволовых клеток к очагам эндометриоза.

Список литературы

  1. Sampson J.A. Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity. Am. J. Obstet. Gynaecol. 1927; 14: 422-9.
  2. Prianishnikov V.A. On the concept of stem cell and a model of functional-morphological structure of the endometrium. Contraception. 1978; 18: 213-23.
  3. Maruyama T., Yoshimura Y. Stem cell theory for the pathogenesis of endometriosis. Front. Biosci. (Elite Ed). 2012; 4: 2854-63.
  4. Cervello I., Mas A., Gil-Sanchis C., Peris L., Faus A., Saunders P.T. et al. Reconstruction of endometrium from human endometrial side population cell lines. PLoS One. 2011; 6(6): e21221. https://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0021221.
  5. Oliveira F.R., Dela Cruz C., Del Puerto H.L., Vilamil Q.T., Reis F.M., Camargos A.F. Stem cells: are they the answer to the puzzling etiology of endometriosis? Histol. Histopathol. 2012; 27(1): 23-9.
  6. Kao A.P., Wang K.H., Chang C.C., Lee J.N., Long C.Y., Chen H.S., Tsai C.F. et al. Comparative study of human eutopic and ectopic endometrial mesenchymal stem cells and the development of an in vivo endometriotic invasion model. Fertil. Steril. 2011; 95(4): 1308-15. e1.
  7. Chan R.W., Ng E.H., Yeung W.S. Identification of cells with colony-forming activity, self-renewal capacity, and multipotency in ovarian endometriosis. Am. J. Pathol. 2011; 178(6): 2832-44.
  8. Moggio A., Pittatore G., Cassoni P., Marchino G.L., Revelli A., Bussolati B. Sorafen ibinhibits growth, migration, and angiogenic potential of ectopic endometrial mesenchymal stem cells derived from patients with endometriosis. Fertil. Steril. 2012; 98(6): 1521-30. e2.
  9. Cousins F.L., Xiao L., Gargett C. Adult stem cells in the pathogenesis and treatment of endometriosis. J. Endometr. Pelvic Pain Disord. 2017; 9(4): 223-31. https://dx.doi.org/10.5301/jeppd.5000310.
  10. Masuda H., Anwar S.S., Bühring H.J., Rao J.R., Gargett C.E. A novel marker of human endometrial mesenchymal stem-like cells. Cell Transplant. 2012; 21(10): 2201-14.
  11. Gargett C.E., Schwab K.E., Brosens J.J., Puttemans P., Benagiano G., Brosens I. Potential role of endometrial stem/progenitor cells in the pathogenesis of early-onset endometriosis. Mol. Hum. Reprod. 2014; 20(7): 591-8.
  12. Valentijn A.J., Palial K., Al-Lamee H., Tempest N., Drury J., Von Zglinicki T. et al. SSEA-1 isolates human endometrial basal glandular epithelial cells: phenotypic and func onal characterization and implications in the pathogenesis of endometriosis. Hum. Reprod. 2013; 28(10): 2695-708.
  13. Хачатрян А.М., Коган Е.А., Чупрынин В.Д., Парамонова Н.Б., Адамян Л.В., Хилькевич Е.Г., Языкова О.И. Инфильтративный эндометриоз мочевыводящих путей: механизмы роста и прогрессирования. Клинико-морфологическое и иммуногистохимическое исследование. Акушерство и гинекология. 2016; 6: 78-86.
  14. Дубровина С.О., Берлим Ю.Д., Гимбут В.С., Красильникова Л.В., Арешян К.А. Современные представления об эндометриоидных кистах яичников. Проблемы репродукции. 2015; 21(3): 98-104.
  15. Kondo W., Bourdel N., Zomer M.T., Slim K., Rabischong B., Pouly J.L. et al. Laparoscopic cystectomy for ovarian endometrioma — a simple stripping technique should not be used. J. Endometr. 2011; 3(3): 125-34. https://dx.doi.org/10.5301/je.2011.8909.

Поступила 06.08.2018

Принята в печать 21.09.2018

Об авторах / Для корреспонденции

Дубровина Светлана Олеговна, д.м.н., профессор, главный научный сотрудник научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России.
Адрес: 344022, Россия, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский 29. Телефон: 8 (918) 558-51-13. E-mail: s.dubrovina@gmail.com
https://orcid.org/0000-0003-2424-2672 
Берлим Юлия Дмитриевна, к.м.н., заведующий консультативно-поликлиническим отделением ФГБОУ ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России. Адрес: 344022, Россия, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский 29. Телефон: 8 (918) 500-23-56. E-mail: juliaberlim@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0003-4582-0988
Чирский Вадим Семенович, д.м.н, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, главный патологоанатом МО РФ. Адрес: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6. телефон: 8 911 929-75-80. E-mail: v_chirsky@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3215-3901
Мажугин Владимир Юрьевич, заведующий патоморфологической лабораторией научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России.
Адрес: 344022, Россия, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский 29. Телефон: 8 (960) 462-36-23. E-mail: 79604623623@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0002-4559-6413
Арешян Кнарик Арутюновна, очный аспирант научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России.
Адрес: 344012, Россия, Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, д. 43/38/2. Телефон: 8 (989) 629-53-08. E-mail: arieshian@bk.ru https://orcid.org/0000-0002-3042-6649

Для цитирования: Дубровина С.О., Берлим Ю.Д., Чирский В.С., Мажугин В.Ю., Арешян К.А. Оценка экспрессии маркеров стволовых клеток в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриоидными кистами яичников.
Акушерство и гинекология. 2019; 3: 78-83.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.3.78-83

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.