Рак шейки матки (РШМ) остается одной из самых острых и актуальных проблем в онкогинекологии. РШМ не имеет тенденции к снижению показателей заболеваемости и смертности, несмотря на то, что в настоящее время сформированы четкие понятия об этиологических факторах и патогенезе развития предраковых и раковых процессов, а также внедрен в практику достаточно надежный диагностический контроль. В общей структуре заболеваемости органов репродуктивной системы у женщин России РШМ занимает 3-е место после рака молочной железы (РМЖ) и рака тела матки. По данным ВОЗ [1], ежегодно в мире регистрируется более 500 тыс. новых случаев РШМ, половина из которых заканчивается смертельным исходом (16% приходится на женщин репродуктивного возраста 20–34 лет).
Вирус папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска является главным этиологическим фактором в патогенезе развития неоплазий и РШМ. Развитие РШМ занимает в среднем 10–15 лет. Однако в литературе описаны случаи, свидетельствующие о том, что при персистенции высокоонкогенного ВПЧ больше 3 лет у 27% женщин развиваются цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN) тяжелой степени (HSIL) [2].
Классическая схема выявления предраковых изменений и РШМ включает проведение цитологического исследования, ВПЧ-тестирование, расширенную кольпоскопию, биопсию шейки матки (ШМ) с гистологическим исследованием биопсийного материала. Однако данные методы имеют ряд недостатков: субъективность, невозможность прогноза развития процесса в сторону регресса или прогрессирования при предраковом поражении эпителия ШМ легкой степени, трудности ранней диагностики CIN и РШМ в группах высокого риска, вопросы ведения пациенток группы риска по прогрессированию неопластического процесса, сложность дифференциальной диагностики CIN2. Кроме того, практикующих врачей беспокоит проблема, связанная с возникновением рецидивов после хирургического лечения ШМ.
На сегодняшний день в арсенале практикующего врача имеется ряд хирургических методов лечения ШМ по поводу неопластических процессов. Наиболее распространенным методом лечения CIN 2+ является петлевая электроэксцизия ШМ (LEEP – Loop electrosurgical excision procedure). Данный метод позволяет получить адекватный гистологический образец с минимальной ожоговой поверхностью. Однако установлено, что частота развития рецидивов CIN и РШМ после хирургического лечения варьирует от 1,2 до 30%, согласно данным зарубежных исследований [3].
В современной литературе имеются данные о сравнении частоты возникновения рецидивов при использовании двух методов хирургического лечения: LEEP и ножевой конизации ШМ. По результатам исследования El-Nashar S.A. и соавт. оказалось, что процент рецидивов CIN и РШМ был достоверно ниже у женщин после ножевой конизации ШМ (7,38%), чем в группе женщин, перенесших LEEP (15,6%) [4]. В то же время авторами Jiang Y., Chen C., Li L. показано, что частота возникновения рецидивов одинакова в отношении обоих методов хирургического лечения CIN и РШМ [4, 5].
Отдавая предпочтение тому или иному методу хирургического лечения, клиницисты всегда учитывают его преимущества и недостатки. Установлено, что LEEP вызывает значительно меньшее число акушерских и гинекологических (стеноз наружного зева, рубцовая деформация) осложнений, по сравнению с ножевой конизацией ШМ, в связи с чем LEEP может использоваться в качестве метода выбора в лечении CIN 2+ у пациенток, которые еще не реализовали репродуктивную функцию.
К преимуществам LEEP перед ножевой конизацией относится меньший объем интраоперационных кровотечений (средняя кровопотеря 43 мл); процедура выполняется в амбулаторных условиях (в редких случаях необходимо пребывание в стационаре 1–2 дня), она более комфортна для пациентки, количество времени, необходимое для процедуры, в среднем составляет 10 минут [4, 5].
Существует ряд настораживающих факторов, с которыми сталкиваются клиницисты при использовании процедуры LEEP, – возможность и качественная оценка краев резекции, наличие или отсутствие позитивных краев и фрагментация ткани. По результатам исследований зарубежных авторов обнаружено, что фрагментация тканей регистрировалась в 45,2% случаев, а невозможность интерпретации краев резекции – у 10,4%. Оба показателя оказались выше у пациенток, перенесших LEEP, по сравнению с группой после ножевой конизации – 8,5 и 2,7% соответственно [6].
Установлено, что одной из главных причин возникновения рецидива CIN и РШМ после хирургического лечения является обнаружение атипических клеток в краях резекции [7]. Данные научных работ Jiang Y. и соавт. показали, что позитивные края резекции были обнаружены в 44% случаев после проведения LEEP, в то время как после ножевой конизации ШМ этот показатель составил 29% случаев.
Важным звеном в механизме возникновения рецидивов CIN2+ и РШМ является персистенция ВПЧ. Результаты некоторых зарубежных исследований свидетельствуют о том, что частота выявления ВПЧ у пациенток после хирургического лечения CIN и РШМ колебалась от 0 до 47% [8]. Исследования показали, что реже всего ВПЧ персистировал у женщин, перенесших лазерную коагуляцию ШМ, а также у молодых женщин. Кроме того, по результатам регрессионного анализа, проведенного Wu J. и соавт., установлено, что ненормальные результаты жидкостной цитологии через 3 месяца после эксцизии (отношение шансов (ОШ) 16,495; 95% доверительный интервал (ДИ) 3,689–73,764), персистенция ВПЧ высокого риска онкогенности (ОШ 5,231; 95% ДИ 1,141–23,976), позитивные края эксцизии (ОШ 4,811; 95% ДИ 1,154–20,258), а также наличие ВПЧ 16 типа до операции (ОШ 8,208; 95% ДИ 1,514–44,489) являются факторами риска возникновения рецидивов CIN 2+ и РШМ после хирургического лечения [9].
Одним из наиболее распространенных осложнений хирургического лечения являются: стеноз наружного зева, истмико-цервикальная недостаточность и, как следствие, увеличение частоты преждевременных родов. Авторы некоторых зарубежных работ сделали вывод о том, что небольшой промежуток между родами с последующей ножевой конизацией ШМ (12 месяцев и менее), а также возраст старше 46 лет являются факторами риска возникновения стеноза наружного зева. Стеноз наружного зева был выявлен у 4,4 и 5,4% пациенток, перенесших ножевую конизацию ШМ [10].
В настоящее время имеется множество исследований и научных работ, направленных на более детальное изучение взаимосвязи процедуры LEEP и преждевременных родов. В исследовании Kitson S. и соавт. показано, что преждевременные роды случились у 9% пациенток, перенесших LEEP по поводу CIN2+ [11, 12]. Такие данные позволяют авторам сделать вывод о том, что риск преждевременных родов возрастал более чем в три раза у женщин, перенесших LEEP хотя бы один раз, по сравнению с группой женщин, которым никогда не проводилась данная процедура. Важно отметить, что ни глубина конуса шейки матки, ни объем не были связаны с повышенным риском преждевременных родов.
По мнению другой группы авторов, с более ранним гестационным возрастом ребенка на момент рождения связана именно длина конуса, а не его поперечный диаметр или объем. При проведении эксцизии под строгим кольпоскопическим контролем, с адекватной оценкой длины предполагаемого конуса риск преждевременных родов не увеличивается [13]. Также, по данным исследования [14], частота преждевременных родов у пациенток, перенесших ножевую конизацию ШМ, составила 21%. Авторы обращают внимание на то, что у пациенток с ножевой конизацией ШМ в анамнезе риск преждевременных родов повышается с увеличением глубины конуса ШМ.
Современная медицина имеет большие возможности для поиска новых (экспресс) методов ранней диагностики предраковых заболеваний ШМ и определения группы риска развития рецидивирования процесса после хирургического лечения CIN. В настоящее время широко обсуждаются новые и интенсивно развивающиеся направления науки – метаболомика, липидомика, протеомика, геномика, транскриптомика, секретомика.
Липидомный анализ неопластически измененных тканей ШМ с помощью метода масс-спектрометрии рассматривается как высокоинформативный метод поиска биомаркеров ВПЧ-ассоциированных заболеваний ШМ. Липиды – это группа органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества. Основную массу липидов в организме составляют жиры – триацилглицериды, служащие формой депонирования энергии. Фосфолипиды – это большой класс липидов, формирующих бислойную структуру мембран, в которую погружены белки. В связи с малой изученностью фосфолипидов, липидомика представляет интерес как потенциальный «ключ» в поиске биомаркеров различных заболеваний, в частности предрака и РШМ. Функции липидов многогранны: они запасают энергию, являются структурными компонентами клеточных мембран и сигнальными молекулами, которые участвуют в клеточном росте, воспалении и иммунном ответе. Повышение уровня биосинтеза липидов является характерной особенностью малигнизации. Кроме того, увеличенный синтез жирных кислот необходим для быстрой пролиферации опухолевых клеток для того, чтобы постоянно обеспечивать их субстратом (в частности, фосфолипидами) для производства мембран. Кроме того, липидомный анализ тканей ШМ с использованием масс-спектрометрии позволяет изучать молекулярные механизмы неопластической трансформации эпителия ШМ, выявлять патологию на ранних этапах развития, а также с высокой точностью дифференцировать между собой доброкачественные ВПЧ-ассоциированные предраковые и злокачественные заболевания ШМ.
В последние годы, в связи с возросшим интересом к метаболомике и липидомике, возникла потребность в использовании новых методов исследования. К таким методам относятся масс-спектрометрия с ионизацией (электрораспылением), газовая хроматография (с масс-спектрометрией), жидкостная хроматография (с тандемной масс-спектрометрией), а также прямая масс-спектрометрия без пробоподготовки.
Масс-спектрометрия – метод анализа вещества путем определения отношения массы к заряду (m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации и фрагментации исследуемого вещества. Это метод выбора для чувствительного обнаружения и количественного определения молекулярных частиц, в частности липидных.
На сегодняшний день масс-спектрометрию считают практически универсальным методом анализа, позволяющим идентифицировать и определять концентрацию как небольших органических молекул, так и пептидов и белков. Одним из преимуществ масс-спектрометрии, по сравнению с другими методами, является использование малого количества исследуемого вещества. Материалом для исследования могут быть как различные биологические жидкости (кровь, слюна, моча, цервико-вагинальная жидкость и т.д.), так и ткани пораженного органа.
В клинической практике с использованием протеомных методов были сформулированы панели для диагностики неопластической трансформации эпителия шейки матки [15]. Данное исследование выявило статистически значимое изменение уровней липидов, относящихся к фосфатидилхолинам, этаноламинам и сфингомиелинам в тканях, подвергшихся неопластической трансформации вследствие воздействия ВПЧ. Найденные липиды можно использовать при создании панели для прогнозирования течения неоплазий в сторону регресса или малигнизации. Кроме того, группой ученых было проведено исследование протеомного состава цервико-вагинальной жидкости. В результате многофакторного анализа протеомных и транскриптомных данных пациентов выявлены белки цервико-вагинальной жидкости, внесшие важный вклад в дифференциацию групп с нормальным эпителием ШМ от групп с неоплазией различной степени тяжести [16].
Применение метода прямой масс-спектрометрии в диагностике ВПЧ-ассоциированных заболеваний ШМ (CIN 2–3) является новым и перспективным направлением в гинекологии. Важным преимуществом прямой масс-спектрометрии является существенное сокращение времени, затрачиваемого на выполнение анализа пораженной ткани, по сравнению с гистологическим методом. Такой экспресс-метод диагностики актуален как для женщин с рецидивом заболевания после хирургического лечения, так и для пациенток с ВПЧ высокоонкогенного типа и сопутствующими изменениями кольпоскопической картины. Последние исследования показали, что один из подходов прямой масс-спектрометрии – электроспрей с ткани – позволяет проводить быстрое (за минуты) молекулярное профилирование биологических тканей, что имеет большое значение для поиска биомаркеров заболеваний, а также для онлайн-контроля хирургии.
Группой авторов из России было проведено исследование, основанное на сравнении прямой масс-спектрометрии ткани и липидомного анализа экстракта ткани методом масс-спектрометрии с электрораспылением для дифференциации эутопической и эктопической ткани эндометрия [17–20]. В данной работе выявлены маркерные вещества, которые относятся к трем липидным классам: фосфатидилхолины, фосфоэтаноламиды и сфингомиелины. Идентификация липидов подтверждена методом хромато-масс-спектрометрии липидных экстрактов тканей. Результаты показывают, что информация, предоставляемая экспрессным методом прямой масс-спектрометрии, достаточна для дифференцировки тканей эндометрия по локализации с аналогичной надежностью, но с более высокой скоростью, чем при традиционном подходе, основанном на предварительной экстракции липидов из ткани. Кроме того, проведено исследование, целью которого было изучение метода экспресс-оценки эндометриоидных тканей с помощью прямого метода масс-спектрометрии. Использование дискриминантного анализа PLS-DA на основе данных масс-спектрометрии показало, что липидом эндометриоидных тканей (перитонеальный эндометриоз и эндометриоз яичников) достоверно дифференцировал данные образцы от эутопического эндометрия [17, 18]. Таким образом, прямая масс-спектрометрия может играть важную роль при идентификации эндометриоидных тканей. Такой подход имеет потенциальную значимость для определения и дифференцировки тканей при хирургическом лечении.
Также были предложены панели для диагностики РМЖ [21]. Группой исследователей под руководством профессора S. Kang [22] было зафиксировано изменение уровня синтеза фосфатидилхолинов в тканях яичников, пораженных раком. Кроме того, K. Moro [23] в 2018 г. при проведении исследования обнаружил изменение уровней церамидов при РМЖ. Уровни церамида были повышены в тканях РМЖ, по сравнению с нормальной и околоопухолевой тканями. Высокие уровни церамида при РМЖ были связаны с менее агрессивным видом рака. У пациентов с более высоким уровнем экспрессии генов ферментов по трем основным путям синтеза церамидов прогноз оказался значительно хуже. Это первое исследование, направленное на выявление клинической значимости метаболизма церамидов у больных РМЖ.
Porcari A.M. и соавт. [24] опубликовали передовую работу, демонстрирующую потенциал масс-спектрометрии как новой технологии для клинического использования в скрининге РШМ. Ученые установили, что липидомный профиль стандартного цитологического образца, полученный методом хромато-масс-спектрометрии, специфичен для HSIL по сравнению с нормой. В разработанной статистической модели (PLS-DA) для дифференциации тяжелых поражений ШМ, HSIL от нормы ключевую роль играли церамиды и метаболиты сфингозина.
Учеными из Китая было проведено исследование, целью которого явилось выявление потенциальных белковых биомаркеров плазмы, способствующих прогрессированию предраковых поражений ШМ в РШМ [25]. Функции белков авторы изучали с помощью метода масс-спектрометрии. В результате выявлено 5 новых биомаркеров (F9, CFI, AFM, HPR, ORM2) предраковых поражений ШМ, показана их прогностическая значимость для оценки риска развития РШМ.
Заключение
Обзор работ, посвященных применению масс-спектрометрического анализа тканей, цервико-вагинальной жидкости, соскобов клеток, плазмы крови, отражает значительную роль этого метода в поиске новых биомаркеров предраковых заболеваний. Однако необходимо проведение дополнительных исследований в данной области, способствующих расширению потенциала диагностических скрининговых программ, в частности CIN и РШМ.
