Пупочный канатик человека – орган с уникальным строением: строму его составляет слизистая соединительная ткань (вартонов студень), не встречающаяся в организме взрослого человека. В основном веществе вартонова студня содержится значительное количество гликозаминогликанов, обеспечивающих его упругость, благодаря чему пупочные сосуды (две пупочные артерии и одна вена) защищены от пережатия. В вартоновом студне отсутствуют капилляры, клеточный компонент его представлен производными мезенхимы (фибробластами, миофибробластами, гладкими миоцитами, мультипотентными стромальными клетками (МСК)), сама пуповина покрыта однослойным эпителием [1].
Долгое время пуповина считалась биологическим отходом, не представляющим особой ценности для исследователей или клиницистов, однако с развитием клеточных технологий и тканевой инженерии интерес к тканям пуповинно-плацентарного комплекса в целом, и к пуповине в частности, значительно вырос. В последнее десятилетие активно идет разработка биомедицинских продуктов на основе матрикса пуповины или выделенных из нее МСК, которые по совокупности свойств могут претендовать на звание нового «золотого стандарта» [1]. Основным недостатком пупочного канатика, как источника биоматериала является его транзиентность: доступ к нему строго ограничен небольшим временным промежутком сразу после рождения ребенка. Решением данной проблемы может стать внедрение доступных и эффективных протоколов криоконсервации ткани пуповины, обеспечивающих отсроченное во времени ее применение. В основе корректного и полноценного осуществления криоконсервации образцов пуповины для последующего выделений клеточных культур лежит комплексное морфологическое (макроскопическое и микроскопическое) изучение всех элементов последа, позволяющее выявить их поражения и патологические изменения [2, 3].
Криоконсервация матрикса кровеносных сосудов пуповины
При необходимости реконструкции сосудов малого диаметра «золотым стандартом» считается аутогенная трансплантация, однако она не всегда возможна. Перспективным материалом для создания протеза сосуда могут стать децеллюляризированные пупочные вена и артерии, к преимуществам которых можно отнести походящий диаметр и длительную протяженность без ответвлений [4–6]. Исследования показали, что криоконсервация сосудов пуповины уменьшает эффективность последующей децеллюляризации (предположительно из-за конденсации внеклеточного матрикса), но не оказывает значимого влияния на их механические свойства (жесткость, разрывное давление, прочность удержания шва), по сравнению с сосудами, выделенными из свежей пуповины [4].
Протоколы криоконсервации сосудов пуповины, предназначенных для аллогенной трансплантации, не предполагают сохранности клеточного компонента, поэтому в качестве среды для замораживания используют физиологический раствор без добавления криопротекторов, а материал хранят при -20°С [4]. Для аутогенной трансплантации более предпочтительным является вариант с сохранением живых клеток в составе стенки сосуда, однако таких работ до сих пор не опубликовано. Возможности применения полученных из пупочных артерий и вены скэффолдов не ограничиваются сердечно-сосудистой хирургией; тканеинженерные конструкции на их основе предлагают применять для восстановления поврежденных нервов [7], связок и сухожилий [8].
Криконсервация матрикса пуповины (вартонова студня)
В клинической практике широко применяется аллографт на основе амниотической мембраны, который получают путем дегидратации, либо замораживания амниона/хориона, причем замораживание является более предпочтительным методом с точки зрения сохранности архитектоники ткани и биологически активных молекул внеклеточного матрикса [9]. В 2014 году было предложено использовать в клинике аналог амниотической мембраны – аллографт на основе вартонова студня криоконсервированной пуповины. Исследования показали, что по сравнению с амниотической мембраной после размораживания в вартоновом студне выше относительное содержание стабилизированной гиалуроновой кислоты, а сам матрикс эффективнее стимулирует экспрессию противовоспалительного интерлейкина-10 и сильнее подавляет экспрессию провоспалительного интерлейкина-12 в культуре макрофагов, что позволяет предположить лучшую переносимость данного аллографта [9].
Криоконсервация пуповины с целью получения матрикса вартонова студня также не предполагает сохранности клеток, поэтому ткань просто быстро охлаждают до -80°С без использования криопротекторной среды [9]. Полученные из криоконсервированной пуповины графты на основе вартонова студня уже показали свою эффективность в клинике для лечения spina bifida [10] и трофических язв при синдроме диабетической стопы [11].
Криоконсервация пуповины с целью сохранения клеточного компонента
1953 год был ознаменован первой беременностью, наступившей с использованием хранившейся непродолжительное время на сухом льду спермы человека. Уже через 10 лет для долгосрочной консервации спермы стали применять жидкий азот, что позволило существенно повысить эффективность метода [12]. Современный уровень развития криобиотехнологии позволяет длительное время сохранять жизнеспособность, как клеточных суспензий, так и цельных фрагментов ткани (например, жировой ткани [13, 14], ткани зубного фолликула [15], фрагментов кости [16]), из которых клетки можно выделить после размораживания. Хранение ткани, не подвергавшейся процессингу, имеет ряд преимуществ, по сравнению с хранением изолированных клеток:
- минимизация временных, трудовых и материальных затрат,
- хранение всех типов клеток в составе естественных для них ниш,
- возможность выделения и экспансии клеточных культур в соответствии со стандартами, принятыми в будущем.
Эксперименты по криоконсервации пуповины человека с целью сохранения клеточного компонента ткани идут уже около 10 лет. Ценность для регенеративной медицины представляют несколько типов клеток, которые можно получить из пупочного канатика, в том числе эпителиальные [17] и эндотелиальные клетки [18], но все же основное внимание исследователей сконцентрировано на МСК.
Первые работы в данной области не увенчались успехом: культуры МСК не получилось выделить из фрагментов вартонова студня, хранившихся в течение 1 недели, 1 или 6 месяцев в жидком азоте, хотя в качестве криопротектора была использована комбинация 10% диметилсульфоксида (ДМСО), широко применяемого для замораживания клеточных суспензий, и 5% глицерола [19]. Однако уже в 2012 году была показана возможность сохранности живых клеток в вартоновом студне при использовании 1,5М ДМСО и 0,1М сахарозы и режима постепенного охлаждения, но не витрификации [20]. В 2013 году были опубликованы еще более обнадеживающие результаты: из хранившихся в жидком азоте пуповин удалось выделить культуры клеток, не отличающихся по своим фенотипическим и функциональным свойствам от МСК, полученных из свежей ткани [21]. В 2014–2016 годах сразу несколько научных групп сообщили о своем успехе, предлагая разнообразные протоколы криоконсервации ткани. Результаты этих экспериментов представлены в таблице.
Как видно из таблицы, большинство эффективных протоколов предполагают использование ДМСО в качестве основного криопротектора. ДМСО, обладая небольшой молекулярной массой (около 78 г/моль), способен проникать через мембрану внутрь клетки, где препятствует формированию кристаллов льда при охлаждении за счет образования стабильных водородных связей с молекулами воды. ДМСО успешно применяется для криоконсервации клеточных суспензий с 1959 года, однако в последнее время все более активно внедряется “DMSO-free” стандарт сред для замораживания. Связано это, в первую очередь, с достаточно высокой токсичностью ДМСО (как для самих клеток, так и для реципиентов), которая проявляется при температуре выше 4°С даже при малых концентрациях (около 1%). Более того, ДМСО практически невозможно полностью удалить из клеток даже при использовании специализированной системы для отмывания клеточных трансплантатов, а при повышении температуры ДМСО достаточно быстро распадается с образованием токсического вещества с резким неприятным запахом диметилсульфида. В качестве альтернативы ДМСО предлагают использовать среду, содержащую одновременно? как непроникающие в клетку криопротекторы (например, сахарозу, глюкозу), так и внутриклеточные криопротекторы (например, этиленгликоль, α-пропиленгликоль, глицерин и др.) [29–31]. Уже опубликованы данные о лучшей сохранности криоконсервированных тканей при замене ДМСО на такой коктейль криопротекторов [28, 32], а крупнейшие биотехнологические компании активно вводят в линейку продуктов DMSO-free среды для замораживания, например, CryoSOfree™ DMSO-free Cryopreservation Medium, Merck; STEM-CELLBANKER DMSO Free – GMP grade, Amsbio; ReproCryo DMSO Free Cryopreservation Medium, Stemgent, и др.
Еще одной проблемой, ограничивающей клиническое применение выделенных из замороженной ткани пуповины МСК, является наличие ксеногенных белков в криопротекторной среде, основу которой (до 90 % об.) составляет, как правило, эмбриональная телячья сыворотка. Использование xeno-free криопротекторной среды значимо увеличивает эффективность выделения первичной культуры из замороженной пуповины [23, 26], а культивирование МСК в xeno-free условиях позволяет уменьшить долю апоптотических клеток, снизить иммуногенность культуры, улучшить пролиферативные свойства и повысить уровень секреции фактора роста гепатоцитов (HGF) и простагландина Е2 [33, 34]. Можно предположить, что обязательная замена телячьей сыворотки на аутосыворотку или фармпрепараты (например, альбумин) при выделении и экспансии МСК, предназначенных для клинического применения, является вопросом времени, но криоконсервация ткани пупочного канатика с учетом xeno-free стандарта должна начаться, на наш взгляд, уже сейчас.
Перспективы банкирования ткани пуповины
Количество клинических испытаний с использованием МСК пупочного канатика растет с каждым годом. На сегодняшний день в регистре клинических испытаний FDA (http://www.clinicaltrials.gov/) зарегистрировано более сотни клинических исследований безопасности и эффективности трансплантации этих клеток для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, печени, скелетной мускулатуры, аутоиммунных и неврологических заболеваний и т.д. Кроме того, идут клинические испытания аллографтов на основе вартонова студня (NEOX CORD 1K, AMNIOX Medical, Inc.; Cryopreserved Umbilical Cord Allograft (TTAX01), Tissue Tech Inc.), полученных из криоконсервированной пуповины, спонсорами которых являются биотехнологические компании. Неудивительно, что криобанки, ранее специализировавшиеся на хранении пуповинной крови, теперь предлагают услуги криоконсервации ткани пуповины. В первой десятке банков, список которых выдают поисковые системы по запросу «umbilical cord tissue cryo banking», 5 находятся в США (Cryo-Cell, ViaCord, CariCord, AlphaCord и New England Cord Blood Bank), 2 – в Великобритании (Cells4Life и Future Health Biobank), 2 – в Австралии (CellCare и CryoSite) и 1 – в ЮАР (Cryo-Save). Среди преимуществ криохранения именно цельной ткани указывается сохранность всех клеточных типов в составе пуповины, а также невысокая стоимость этой процедуры (примерно в 2,5 раза ниже стоимости хранения пуповинной крови). С нашей точки зрения, оптимальным решением с точки зрения дальнейшего клинического применения является одновременное банкирование пуповинной крови в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток и ткани пуповины, из которой можно получить аутографты или выделить неонатальные МСК для аутотрансплантации.
Заключение
Проведенный анализ литературных данных позволяет предположить активное развитие такого перспективного направления клеточной биотехнологии как криоконсервация пуповины человека. Выбор протокола криоконсервации зависит от поставленной задачи (сохранение матрикса сосудов, вартонова студня или клеточного компонента), при этом на эффективность выделения жизнеспособных клеток из ткани влияют состав криопротектора и режим охлаждения. Данные о выживаемости эндотелиальных, эпителиальных или периваскулярных клеток после размораживания пуповины отсутствуют, однако современные протоколы криоконсервации позволяют получить культуры МСК, не отличающиеся по своим фенотипическим и функциональным свойствам от МСК, выделенных из свежей пуповины.
