Миома матки (ММ), или лейомиома, является доброкачественной моноклональной опухолью отдела гладкой мускулатуры матки (миометрия). По некоторым данным, у 77% всех женщин в течение жизни диагностируется ММ, которая приводит к болям в области таза, дисменорее, меноррагии, анемии, недержанию мочи, преждевременным родам и спонтанным выкидышам, вызывающим иногда бесплодие [1, 2]. В развитии опухолевого роста при ММ основную роль играют процессы утраты контроля над клеточной миграцией, пролиферацией, дифференцировкой, дезорганизацией экстрацеллюлярного матрикса и тесно ассоциированные с ними воспалительные процессы. Заметное участие в этих взаимосвязанных процессах принимают и нарушения локального ангиогенеза. В их регуляции основную роль играют цитокины, ростовые факторы и хемокины. Среди них основное значение придается трансформирующему ростовому фактору (TGF-β), эпидермальному фактору роста (EGF), тромбоцитарному фактору роста (PDGF), фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и инсулиноподобному фактору роста (IGF). Уровни EGF, PDGF и VEGF-A были обнаружены на значительно более высоких уровнях в ткани ММ по сравнению с тканями миометрия, хотя рецептор EGF (EGFR) экспрессируется на одинаковых уровнях в обеих тканях [3].
Многие цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), эритропоэтин, интерлейкин (IL)-1 и IL-6, участвуют в развитии лейомиомы матки. Выявлены изменения содержания мРНК эотаксина, воспалительных белков макрофагов (MIP-lα, MIP-Iβ) и рецепторов бета-хемокинов класса интегральных мембранных белков (CCR3) в тканях лейомиомы по сравнению с миометрием. При простой форме лейомиомы содержание мРНК MIP-1, CCR5 и эотаксина статистически значимо понижено, по сравнению с миометрием. Уровень экспрессии мРНК эотаксина в тканях миометрия значимо выше при малоузловой форме, чем при многоузловой, и при простой, чем при пролиферирующей. [4]. Показано, что хемокины и их рецепторы (MIP-1α, MIP-1β, RANTES, эотаксин, эотаксин-2, IL-8, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1 и CXCR2) могут являться медиаторами опухолевого процесса при ММ [5, 6]. Уровни мРНК MCP-1 выше в миометрии по сравнению с лейомиомой, а эстрогены и прогестины уменьшают продукцию белка этого хемокина, что указывает на то, что MCP-1 может обладать противоопухолевой активностью при ММ [7]. Повышенное содержание тучных клеток при ММ положительно коррелирует с концентрацией RANTES и эотаксина [8].
Хемокины относятся к цитокинам со специфической функцией хемоаттракции (хемотаксические цитокины) и молекулярной массой от 7 до 12 кДа. Хемокины характеризуются несколькими особенностями, включая присутствие четырех консервативных остатков цистеина. Их рецепторы часто способствуют быстрым и обратимым изменениям клеточного метаболизма или миграции, в отличие от рецепторов других цитокинов, которые обычно вызывают более медленные и необратимые процессы пролиферации и апоптоза.
Члены семейства хемокинов включают CC-хемокины, которые имеют два соседних цистеина, хемокины CXC с двумя цистеинами, разделенными одной аминокислотой, C-хемокины, характеризующиеся присутствием двух цистеинов, и хемокины CX3C с тремя аминокислотами, разделяющими начальную пару цистеинов [9]. Наиболее значимыми представителями этой группы белков, привлекающими клетки воспалительного ряда в патологический очаг, являются продуцируемые макрофагами и другими активированными клетками белки: MCP-1 – CCL2 (macrophage chemotactic protein-1), MIP-1α – CCL3 и MIP-1β – CCL4 (macrophage inflammatory protein α и β), RANTES – CCL5 (Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted) и Eotaxin (CCL11) [10, 11]. Анализ их концентраций в сыворотке крови женщин с ММ явился основной целью настоящего исследования. Его отличительной особенностью является одновременный анализ концентраций хемокинов в сыворотке крови с использованием стандартизованных современных методов мультиплексного иммуноанализа на основе технологии xMAP, лицензированной Luminex, созданной с использованием проточной флуориметрии, микросфер из полистирола, двух флуоресцентных красителей при различных соотношениях, лазерной детекции, цифровой обработки сигнала для обеспечения исследования до 100 различных анализов в рамках одного образца.
Материалы и методы
Описание группы пациентов. Под наблюдением находились 36 пациенток европеоидного происхождения с верифицированным диагнозом миомы тела матки, которым проводилось оперативное лечение в объеме лапароскопической миомэктомии. Возраст пациенток составил от 23 до 54 лет. Медиана возраста больных составила 42,0 (38,5;45,8) года. Среди них пациенток с избыточной массой тела и ожирением (индекс массы тела (ИМТ) >24,9) оказалось 35,9%. Нарушение менструального цикла по типу полименореи выявлено у 20 (55,6%) пациенток. Предшествующие роды отмечены у 28 пациенток, искусственное прерывание беременности – у 25, спонтанные выкидыши – у 8, в анамнезе не наступало беременностей – у 5. Жалобы на тянущие боли внизу живота предъявили 28 пациенток, на кровотечение – 23 пациентки. Размеры миоматозных узлов, выявленных по данным ультразвукового исследования (УЗИ) малого таза, составили от 5 до 180 мм. Медиана размера узлов составила 97,5 (80,5;110,0) мм. По передней стенке матки располагались узлы у 19 пациенток, по задней – у 7, атипическое расположение (забрюшинные, перешеечные узлы) – у 2, сочетанное расположение – у 10. При выполнении предоперационной гистероскопии (гистологическое исследование) у 7 пациенток диагностирован полип эндометрия, у 6 – простая гиперплазия эндометрия.
Методы определения цитокинов. Однократно замороженная при -80 ˚С и хранимая во фризере сыворотка крови размораживалась перед исследованием до комнатной температуры. Для удаления осадка проводили центрифугирование сыворотки при 4 °C 10 000 обю/мин 10 минут. Концентрацию 27 цитокинов определяли с использованием набора фирмы Bio-Rad (США) – Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assay методом проточной флюориметрии на двухлучевом лазерном анализаторе Bio-Plex 200 производства Bio-Rad (США). В сыворотке одномоментно определялись концентрации ряда цитокинов и хемокинов, включая CCL-хемокины MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES и Eotaxin, после построения калибровочной кривой по соответствующим стандартам. Для обработки данных применялось программное обеспечение Bio-Plex Manager Software version 4.1. Концентрация цитокинов выражалась в пг/мл.
Методы статистического анализа. Статистическая обработка проводилась с помощью специализированных пакетов прикладных программ StatSoft Statistica 10.0 и IBM SPSS Statistics 23 (США). Проверку гипотезы о нормальном распределении количественных параметров проводили с использованием критерия Шапиро–Уилка и критерия Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Для анализа данных использовали параметрические (сравнение средних одновыборочным методом Стьюдента (приблизительный метод) и расчет t-критерия Стьюдента при сравнении средних величин с помощью on-line калькулятора: http://medstatistic.ru/calculators/averagestudent.html) и непараметрические (ранговая корреляция Спирмена) методы статистики. При нормальном распределении (RANTES и Eotaxin) данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения в формате M(SD). При распределении признаков, отличающихся от нормального (MCP-1, MIP-1α, MIP-1β), данные представлены в виде медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3 в формате Me (Q1;Q3). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Одномоментное исследование концентраций 5 хемокинов в одних образцах сыворотки крови женщин выявило разнонаправленный характер их изменений. Необходимо отметить, что при сравнении количественных характеристик исследованных хемокинов обращает на себя внимание значительная дисперсия этих регуляторных факторов в сыворотке крови обследованных женщин. Это заключение подтверждается как значениями минимальных и максимальных показателей, представленных в табл. 1, так и значительными различиями в показателях средних величин и медианных критериев для всех исследованных цитокинов.
Кроме того, привлекают внимание значительные различия в абсолютных значениях содержания хемокинов с провоспалительной активностью, концентрация которых выражена в пикограммах на 1 мл, в сыворотке крови больных ММ женщин. Так, если содержание MIP-1α характеризуется величиной медианы 2,81 (2,29;5,83) пг/мл, то концентрация RANTES в тех же сыворотках достигает уже величины 15479 (6063) пг/мл, то есть в 5000 раз выше. Речь здесь, конечно, идет об абсолютных значениях концентраций белков, а не сравнительной активности этих регуляторных факторов, которую можно сопоставить лишь в соответствующих клеточных тест-системах.
Переходя к вопросу о сопоставлении полученных результатов со значениями исследованных показателей у здоровых женщин, мы обратились к нормативным значениям, полученным на значительной выборке из 94 здоровых женщин европеоидного происхождения, полученных лабораторией Center for Human Immunology, Autoimmunity and Inflammation, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, сотрудничающей с фирмой-разработчиком используемых нами тест-систем «27-plex kit from Bio-Rad» [12]. В этих исследованиях проведен тщательный анализ результатов исследования цитокинов в сыворотке крови в зависимости от пола, возраста, этнической принадлежности обследованных лиц, от времени исследования и даже от использования различных пластиковых планшетов при исследовании полученного образца сыворотки крови. Кроме того, авторы данного исследования показали, что зависимость сывороточных концентраций хемокинов от возраста обследованных женщин выражена незначительно и в группе женщин в возрасте 40 лет, аналогичной по возрасту группе наших пациенток. Границы референсных значений для анализируемых концентраций 5 хемокинов были представлены следующими значениями (в формате M (SD)): MCP-1 – 55,40 (45,43), MIP-1α – 15,10 (21,52), MIP-1β – 173,50 (105,23), RANTES – 11848,90 (7298,92) и Eotaxin – 257,40 (209,01).
Результаты этих исследований, статистический анализ которых проведен с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager software version 6.2., признаны пригодными в качестве нормативных значений для здоровых женщин европеоидного происхождения. В статье под термином «показатели здоровых женщин» будут подразумеваться значения концентраций 5 хемокинов, заимствованные из указанного выше источника литературы, представленные в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (SD).
Как видно из данных, представленных в табл. 1, наиболее стабильным оказались результаты исследования концентраций MIP-1β в сыворотке крови здоровых и больных ММ женщин. Их уровень практически идентичен (р=0,24).
Показатели содержания в сыворотках крови женщин с ММ таких хемокинов, как Eotaxin, MCP-1 и MIP-1α, оказались статистически значимо более низкими в сравнении с данными, полученными при исследовании сывороток здоровых женщин (р<0,001, р=0,04 и р<0,001 соответственно). Как следует из представленных данных, наибольшие снижения выявлены для MIP-1α и эотаксина, концентрации которых при ММ снижены практически в 3 раза. Эти данные свидетельствуют, вероятно, о низком уровне активности воспалительных или эозинофильных аллергических процессов, протекающих в миометрии при развитии ММ, поскольку хемокин CCL11 и члены его подсемейства CC24 и CCL26 являются хемоаттрактантами для клеток эозинофильного ряда [13]. Можно также предположить, что снижение уровня MIP-1α приводит к недостаточной активации Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, может служит одним из факторов недостаточного контроля над пролиферацией миоцитов, а недостаточный уровень такого сильного хемотаксического фактора, как MCP-1, приводит к сниженной интенсивности миграции клеток с антиген-презентирующей функцией в очаги слабоконтролируемого очага роста пролиферативной активности миоцитов. Сочетанное снижение активности этих важнейших регуляторных процессов может служить дополнительным фактором нарушения нормального течения процессов ремоделирования миометрия при ММ.
Данные противоположного характера получены нами при исследовании сывороточной концентрации RANTES, концентрация которого оказалась значимо повышена (р=0,01) в сыворотках крови женщин с ММ. Учитывая важную роль этого белка в рекрутировании и дифференцировке моноцитов в артериальной стенке, можно предположить, что повышение уровня RANTES в сыворотке крови может служить отражением процессов активации неоангиогенеза в разрастающихся очагах доброкачественной опухоли лейомиомы [14]. Кроме того, комплекс CCL5 и его рецептора CCR5 участвует в рекрутировании регуляторных иммунных клеток в опухоли, индуцируя местную иммуносупрессию и благоприятствуя прогрессированию опухоли [15].
Разнонаправленный характер изменений исследуемых цитокинов при ММ подтверждается и результатами корреляционного анализа, представленных в табл. 2.
Из этих результатов следует, что повышение уровня концентрации RANTES сопровождается снижением содержания в сыворотке крови пациенток с ММ таких хемокинов, как Eotaxin, MIP-1α и MIP-1β (значения коэффициентов корреляции с отрицательными знаками). При этом снижение концентраций хемокинов CCL2, CCL3, CCL4 и CCL11 прямо скоррелировано между собой.
Заключение
Таким образом, общим заключением, вытекающим из анализа результатов нашего исследования, может служить вывод о наличии нарушений в функционировании хемокиновой сети при развитии лейомиомы, что проявляется разнонаправленными и скоррелированными изменениями концентрации CCL-хемокинов в сыворотке крови.
