Учитывая высокую материнскую и перинатальную заболеваемость и смертность, а также ближайшие и отдаленные последствия преэклампсии (ПЭ), наиболее актуальной проблемой является прогнозирование и ранняя (доклиническая) диагностика данной патологии [1–5]. В связи с этим особое значение приобретает дифференциальная диагностика гипертензивных расстройств во время беременности, характер которых определяет не только исходы беременности для матери и плода, но и качество последующей жизни женщины. Согласно международным рекомендациям, протеинурия не является критерием ПЭ, поскольку не исключается предшествующая патология мочевыводящих путей [2–6]. Вместе с тем имеются данные, что протеинурия может предшествовать развитию ПЭ [7]. Нередко встречаются ситуации сочетания незначимой протеинурии с повышенным АД. Поэтому протеомный/пептидомный анализ является одним из наиболее перспективных направлений в разработке более точных методов достоверной диагностики ПЭ.
В настоящее время различают хроническую артериальную гипертензию (ХАГ), существовавшую до наступления беременности, а также возникшие de novo после 20-й недели гестационную артериальную гипертензию (ГАГ), преэклампсию (ПЭ) и ПЭ на фоне ХАГ [1–5].
В одной из первых работ, посвященных пептидому мочи с участием 284 женщин с ПЭ [8], были получены протеомные фингер-принты 59 образцов мочи (исследовательская фаза эксперимента), характерных для тяжелой ПЭ, требующей экстренного родоразрешения. В проверочной фазе диагностический алгоритм был испытан на 225 женщинах, относящихся к различным группам риска (высокого и низкого) развития ПЭ. В трансляционной фазе идентификация и валидация биомаркеров проводилась тандемной масс-спектрометрией в образцах мочи, сыворотки крови и плаценты. В результате было показано наличие пяти пептидов SERPINA-1 и альбумина, являющихся биомаркерами ПЭ.
В дальнейшем был проведен анализ пептидома сыворотки крови в группе из 62 беременных женщин (31 пациентка с ПЭ, 31 – контроль) [9]. При выбранной ошибке прогнозирования патологии, равной 10%, были выделены 19 маркерных пептидов, из них 13 принадлежали фибриногену (FGA), 1 – α1-антитрипсину (A1AT), 1 – апо-липопротеину L1 (APO-L1), 1 – тяжелой цепи H4 интер-αтрипсина ингибитора (ITIH4), 2 – кининогену-1 (KNG1), 1 – тимозину β4 (TMSB4).
Проведенное исследование «случай-контроль» [10] позволило выявить линейку из 50 пептидов, принадлежащих α-цепи коллагена, α-цепи фибриногена, уромодулину, ретинол-связывающему белку и некоторым другим белкам. Составленный по этой панели классификатор показал хорошее разделение пептидов на 28-й неделе, а также (на тех же пациентках) их динамику на ранних сроках: 12 и 16 недель. Стоит также отметить, что другие авторы отмечают, что аналогичные пептиды могут наблюдаться в моче пациентов с хронической болезнью почек [11] и коронарной недостаточностью [12–13], нередко являющихся следствием ХАГ. При этих заболеваниях, как и при ПЭ, отмечаются эндотелиальная дисфункция и системный воспалительный ответ [14], что доказывает необходимость более точной дифференциальной диагностики ПЭ и других гипертензивных состояний, в частности ХАГ.
Целью настоящего исследования стал поиск панели пептидов, позволяющей дифференцировать гипертензивные состояния беременных: ПЭ, ПЭ на фоне ХАГ и ХАГ.
Материал и методы исследования
В исследование были вовлечены 64 пациентки (поздняя тяжелая ПЭ – 5, поздняя умеренная ПЭ – 11, ранняя тяжелая ПЭ – 9, ранняя умеренная ПЭ – 3, ПЭ на фоне ХАГ – 8, ХАГ – 8, здоровые беременные – 20). Ввиду немногочисленности групп на данном этапе исследования группа ПЭ (n=28) была включена в анализ без стратификации по срокам клинической манифестации и тяжести состояния пациенток.
Образцы мочи беременных собирались в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова с информированного согласия пациенток. Тяжесть ПЭ оценивалась согласно Федеральным рекомендациям, утвержденным Минздравом России [1]. К ранней форме ПЭ относили пациенток с манифестацией патологии до 33-й недели включительно. Контрольная группа состояла из женщин с физиологически протекающей беременностью и общим содержанием белка в моче ниже 100 мкг/мл.
Выбор мочи в качестве объекта исследования обусловлен неинвазивным способом получения образца, а также высокой специфичностью пептидома мочи при различных патологиях, особенно ассоциированных с нарушением функции почек [8–19], что в совокупности делает данный подход перспективным для создания в будущем малоинвазивного метода диагностики.
Через 20 минут после сбора образцы центрифугировали в течение 10 минут с ускорением 2000g, при 4°C. Супернатант хранился при -80°C. Пептиды выделялись методом гель-фильтрации и анализировались ВЭЖХ-МС/МС в полном соответствии с протоколами разработанными авторами ранее [16–18]. Кратко: 1,5 мл мочи смешивались с 1,5 мл денатурирующего буфера (4М мочевина, 20 мМ NH4OH, 0,2% SDS), проходили стадии ультрафильтрации и гель-фильтрации с целью отделения белков, очистки от низкомолекулярных контаминантов и смены буфера. Анализ пептидной фракции проводился на нанопоточном хроматографе Agilent 1100 (США) с гибридным масс-спектрометром LTQ-FT (Thermo, Германия) с колонкой 75 мкм × 12 см с фазой Reprosil-PurBasic C18, 3 мкм (Dr.Maisch HPLC GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия). Градиентная хроматография осуществлялась с изменением относительного содержания растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) в потоке А (0,1% муравьиной кислоты в воде). Основное время элюции 15–45 мин: линейный градиент от 3 до 50% буфера В, элюция наиболее гидрофобных пептидов 45–50 мин: линейный градиент от 50 до 90% буфера В. Поиск идентификаций пептидов осуществлялся с помощью программы MaxQuant (version 1.5.3.30) по искусственно сгенерированной базе из 145 белков, найденных на пилотном этапе [17, 18], либо упоминавшихся в литературе в контексте обсуждения ПЭ [8–10, 19]. Создание базы продиктовано необходимостью снизить затраты времени и ресурсов. Для идентификации пептидов использовались следующие параметры поиска: неспецифическое расщепление, вариабельные модификации – окисление метионина, лизина и пролина, допускалось до 5 вариабельных модификаций на пептид, точность масс для иона-предшественника – 20 м.д., точность масс для MS/MS фрагментов – 0,50 Да, минимальная длинна пептида 5 а.к.о., максимальная масса пептида 10кДа, FDR≤0.01, минимальный score для немодифицированных пептидов 20, для модифицированных 40. Полуколичественные результаты для каждого идентифицированного в образце белка были получены методом label-free c выравниванием хроматограмм по времени выхода пептидов и нормировкой на суммарную интенсивность. Для визуализации полученных данных был использован метод проекции на латентные структуры. Статистические различия протеомных результатов между группами были выделены с помощью критерия Краскела–Уоллиса. Для выбранных пептидов была сделана оценка критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони.
Результаты и обсуждение
Средний возраст женщин в группе с ПЭ составил 32,02±2,09 года, с ХАГ – 35,8±1,77 года, с ПЭ на фоне ХАГ – 34,07±2,44 года, в контрольной группе – 31,07±2,40. Средний индекс массы тела составил соответственно 28,06±5,5 кг/м2, 31,6±3,8 кг/м2, 29,5±2,8 кг/м2 и 28,26±4,5 кг/м2. Таким образом, сравнительный анализ не выявил значимых различий по возрасту и индексу массы тела в указанных группах. При межгрупповом анализе частота артериальной гипертензии в семейном анамнезе при ПЭ, ХАГ и ПЭ на фоне ХАГ статистически не различалась: 13 (46,4%), 4 (50%) и 4 (50%), но встречалась достоверно чаще по сравнению контролем: 4 (20%) (p<0,01). Таким образом, отягощенная наследственность по артериальной гипертензии является фактором риска гипертензивных нарушений во время беременности. В группе с ПЭ женщины достоверно чаще имели отягощенный акушерско-гинекологический анамнез: антенатальная гибель плода имела место у 2 (7,1%), ранняя неонатальная гибель – у 1 (3,6%), ПЭ в анамнезе – у 5 (17,9%) женщин по сравнению с беременными с ПЭ на фоне ХАГ, где соответствующие показатели составили соответственно 0, 0 и 1 (12,5%), а в контрольной группе данные осложнения в анамнезе не встречались (p<0,05). Клинико-анамнестическая характеристика изученных групп представлена в табл. 1.
Длительность пролонгирования беременности с момента манифестации ПЭ и до момента родоразрешения составила 13,9±8,2 суток соответственно (р<0,01). Необходимость экстренного досрочного родоразрешения в группе с ПЭ была достоверно чаще обусловлена выраженными нарушениями состояния плода и имела место в 13 случаях (46,4%). Нарастание тяжести ПЭ, отсутствие эффекта от проводимой антигипертензивной терапии и присоединение неврологической симптоматики служило показанием к родоразрешению у 15 (53,6%) женщин.
Задача идентификации эндогенных пептидов мочи, полученных от 64 пациенток, включала анализ 256 исходных хроматограмм с масс-спектрами (4 повторных анализа каждого образца). Ввиду наличия возможных модификаций пептидов (окисление метионина, пролина, лизина), а также неспецифичности N- и С-концевых групп, поиск по полной базе человеческих белков требует значительных вычислительных ресурсов. Для облегчения процедуры поиска нами была создана малая база, состоящая из 145 белков, что позволило нам использовать вычислительные мощности лаборатории для проведения поиска, идентификации и полуколичественного анализа по полученным ВЭЖХ-МС/МС данным. Схематично дизайн эксперимента показан на рис. 1.
Группа ПЭ была включена в анализ без стратификации по срокам клинической манифестации и тяжести состояния пациенток ввиду малочисленности подгрупп. Таким образом, в исследовании сравнивались 4 группы: ПЭ, ПЭ на фоне ХАГ, ХАГ, здоровые беременные.
Методом проекции на латентные структуры (PLS, projection to latent structures – один из статистических методов линейной регрессии) было построено распределение по первым двум компонентам для всех пептидов мочи у пациентов разных групп (рис. 2, 3). Статистическая модель характеризуется значениями R2=0,87 и Q2=0,65. Второй параметр свидетельствует о хорошей прогнозирующей способности для классификации в случаях наличия ПЭ либо ПЭ на фоне ХАГ. Несмотря на наличие нескольких выбросов в каждой группе, хорошо визуализируются два кластера, между которыми можно провести разделительную линию с большой степенью достоверности.
Анализ полуколичественных данных четырех групп (ПЭ, ПЭ на фоне ХАГ, ХАГ, контрольная группа) непараметрическими тестами Краскела–Уоллиса и Манна–Уитни показал наличие 12 пептидов, дифференцирующих хотя бы одну пару групп (табл. 2).
Более подробно распределение указанных пептидов показано на диаграмме Вена (рис. 4). Пересечению всех четырех групп принадлежат 36 пептидов: 22 из них относятся к α1 цепи коллагена 1, 9 – к α1 цепи коллагена 3, 2 – к α2 цепи коллагена 1, 1 – к α1/2 цепи коллагена 1, 1 – к α1 цепи коллагена 1/18 и 1 – к уромодулину. Второе по численности пересечение, соответствующее группам с гипертензивными нарушениями, содержит 34 пептида: 12 из α1 цепи коллагена 1, 10 из α-фибриногена, 8 из α1 цепи коллагена 3, и по 4 из других типов коллагена. Наличие пептидов фибриногена может свидетельствовать об артериальной гипертензии.
В данном исследовании мы не находим статистически значимые пептиды, принадлежащие исключительно группе ПЭ. Однако, что более значимо, была обнаружена группа из 16 пептидов, характерная и для ПЭ, и для ПЭ на фоне ХАГ. Из них 1 является фрагментом α1 цепи коллагена 1, 1 – α2-HS-гликопротеина, 1 – аполипопротеина А-I, а оставшиеся 13 – α1-антитрипсина. Если наличие фрагментов фибриногена в моче в целом указывает на воспалительные процессы и заболевания сердечно-сосудистой системы, то пептиды α1-антитрипсина, в нативной форме ингибирующего одну из самых распространенных протеаз – трипсин, указывают на изменения в метаболических путях деградации белка.
На рис. 5 представлена полная последовательность α1-антитрипсина, на котором отмечены полученные нами маркерные пептиды. Примечательно, что 9 пептидов расположены в центральной области белка, а остальные 17 пептидов покрывают С-конец. В области, начинающейся с пролина-393 и заканчивающейся глутаминовой кислотой-400, связи практически между каждой парой аминокислот были разорваны. Исключение составляют валин-395 и фенилаланин-396, причем эти аминокислоты не входят ни в один из отмеченных пептидов. Пока что не определен механизм такой специфичной и интенсивной протеазной активности, однако существует теория, объясняющая отсутствие в числе найденных нами пептидов фрагментов с последовательностью 394-FVFLM-398. Методами молекулярной динамики было показано [20], что данный пентапептид имеет способность к агрегации, значительно превышающую таковую даже у фрагмента 16-KLVFF-20 β-амилоида, что требует несколько другого подхода при биохимическом анализе по сравнению с тем базовым протоколом, по которому было выполнено данное исследование. Теория об участии амилоидов в патогенезе ПЭ еще не получила широкой поддержки научного сообщества, однако она занимает свое место в ряду прочих гипотез [20].
Сравнение нашей группы из 16 пептидов, характерных и для ПЭ, и для ПЭ на фоне ХАГ, с результатами, полученными ранее другими зарубежными авторами [17, 18], показало наличие 12 общих пептидов, которые относятся к фрагментам α1-антитрипсина и α1 (I и III) цепям коллагена (табл. 2). Указанные пептиды подтвердили свою значимость как потенциальные маркеры ПЭ.
Нами было проведено исследование пептидного профиля мочи у пациентки с ГАГ с момента постановки диагноза ГАГ (32–33-я неделя) до родоразрешения (36–37-я неделя) в динамике (рис. 6). На тепловой карте, представленной на рис. 6, наблюдается корреляция между повышением уровня пептидов белка SERPINA1(A1AT) и появлением и нарастанием степени тяжести ПЭ. В результате была показана возможность использования предложенной панели пептидов-маркеров с целью своевременной диагностики и предикции ПЭ.
Заключение
Результаты исследования позволяют утверждать, что эндогенные пептиды мочи беременных женщин специфичны для различных гипертензивных патологий, в частности ПЭ. В результате анализа образцов мочи 64 пациенток была выделена панель 112 пептидов и при дальнейшем изучении были определены пептиды, позволяющие однозначно отличить здоровых пациенток от группы ХАГ, ПЭ или ПЭ на фоне ХАГ. Пептиды, являющиеся фрагментами α1-антитрипсина и α1 (I и III) цепей коллагена, подтвердили свою значимость как маркеры ПЭ, предложенные авторами в более ранних работах. Наличие группы из 16 общих пептидов, характерных как для ПЭ, так и для ПЭ на фоне ХАГ, подтверждает наличие специфичной пептидной сигнатуры для ПЭ. Продемонстрированная динамика изменений пептидного профиля при проявлении клинических признаков ПЭ у пациентки с ГАГ свидетельствует о реальных возможностях применения пептидомного анализа мочи в клинической практике с целью своевременной диагностики и предикции ПЭ. Дальнейшие исследования позволят детализировать полученные данные и приблизиться к проблеме более точного прогнозирования и ранней диагностики ПЭ.
