В настоящее время в России наблюдается нарастание депопуляционных процессов [1]. Низкая рождаемость и высокий уровень репродуктивных потерь реализовались демографическим кризисом в стране [2]. В 13 российских городах, в том числе в Новокузнецке, низкая рождаемость и высокая смертность населения сопряжены с большим миграционным оттоком и ухудшением экологической обстановки [3]. С позиции демографии, определяющей судьбу любой страны, потеря каждой беременности имеет не только медицинское, но и большое социальное значение [4, 5].
Известно, что в 30% случаев беременность у здоровых женщин прерывается в результате «генетического сброса» еще на доклиническом этапе, каждая пятая из диагностированных и желанных беременностей заканчивается неблагополучно – гибелью эмбриона на ранних сроках, из них до 10% – неразвивающиеся беременности (НБ). При этом за последнее десятилетие отмечается рост как абсолютных, так и относительных показателей частоты НБ [6, 7]. В Новокузнецке, согласно отчетной документации отделения патологии беременных ГАУЗ «Первая городская клиническая больница им. Г.П. Курбатова», количество НБ с 1997 г. увеличилось в 15–20 раз.
Основные группы причинных факторов репродуктивных потерь в настоящее время хорошо изучены; при этом генетический фактор считается ведущим, однако в трети случаев причины НБ остаются неизвестными [8–10].
На сегодняшний день многими эколого-эпидемиологическими исследованиями доказано повреждающее влияние различных химических загрязнителей окружающей среды на процессы гестации, течение беременности и развитие врожденных пороков [11, 12]. Поступающие в организм извне ксенобиотики подвергаются метаболизму и выведению с участием системы биотрансформации ксенобиотиков. В I фазе метаболизма происходит окисление, восстановление или гидролиз молекул ксенобиотиков с участием ферментов семейства цитохрома P450 (CYP); в результате образуются как химически инертные метаболиты, так и реактивные электрофильные, токсичные, обладающие мутагенным и канцерогенным действием соединения. Во II фазе происходит конъюгирование и повышение гидрофильности этих соединений посредствам ферментов класса трансфераз (GSTM1, GSTT1 и GSTР1), затем детоксикация и выведение их из организма [13]. Дисбаланс между активностью ферментов I и II стадий приводит к накоплению в организме токсичных метаболитов ксенобиотиков, способных повреждать ДНК и белки, запуская процессы терато- и канцерогенеза [14].
В норме эмбрион надежно защищен детоксикационной ферментной системой матери от воздействия токсигенных соединений и тератогенов. Считается, что гены системы биотрансформации ксенобиотиков в условиях современной техногенной цивилизации могут вносить вклад в нарушение нормального течения беременности, особенно при наличии «функционально ослабленных» вариантов (аллелей) некоторых генов [15, 16]. Значение полиморфизма генов ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков в генезе ранних репродуктивных потерь как возможных повреждающих механизмов на стадиях гаметогенеза, оплодотворения, имплантации, плацентации и эмбриогенеза активно изучается и оценивается неоднозначно [10, 17, 18].
Научно-практический интерес к изучению различных генетических аспектов НБ имеет важный причинно-проспективный вектор, а именно формирование персонифицированного подхода к прогнозированию ранних репродуктивных потерь. Комплексная оценка вовлеченности полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков в развитии первой НБ на примере крупного промышленного региона до настоящего времени не проводилась.
Цель исследования: молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов системы метаболизма ксенобиотиков CYP1A1 (rs4646903), CYP1A2 (rs762551), GSTM1 (del) и GSTT1 (del) как возможных генетических факторов риска ранней потери первой беременности в крупном промышленном регионе.
Материалы и методы
Исследование проводилось в два этапа: на первом этапе осуществлялся анализ клинико-анамнестических данных, на втором – молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов системы метаболизма ксенобиотиков; оба этапа соответствовали типу исследования случай-контроль. Выборка для первого этапа включала 358 первобеременных женщин, проживающих в крупном промышленном регионе. Формирование выборки проводилось в период 2021–2023 гг. Всего за этот период в г. Новокузнецке и Новокузнецком районе было зарегистрировано 228 случаев НБ у первобеременных женщин до 23 лет, из них дали информационное согласие на участие в исследовании 214, из них были исключены в соответствии с критериями 42 пациентки. Группа случаев включала 172 пациентки с НБ до 12 недель: до 7+6 недель – 15/8 (7%) пациенток, до 8–10+6 недель – 116/67 (4%), до 11–12+6 недель – 41/23 (8%). Группа контроля была сформирована из 186 женщин с физиологическими родами (ФР), которые были сопоставимы с группой случаев по возрасту, месту проживания, гинекологическому анамнезу.
Критериями включения для групп были первая беременность, возраст до 23 лет, желание участвовать в исследовании; для группы с НБ – признаки неразвивающейся беременности по данным ультразвукового исследования, для группы с ФР – нормальное течение беременности без угрозы прерывания, закончившейся ФР с оценкой ребенка по шкале Апгар 8–10 баллов.
Критериями исключения являлись: острые и хронические инфекционные процессы в стадии обострения, декомпенсированные экстрагенитальные заболевания, отказ от участия в исследовании. Исследование одобрено этическим комитетом НГИУВ – филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Расчет размера выборки не проводился, в исследовании использовали всю доступную в базе данных информацию, чтобы максимизировать мощность и обобщаемость результатов. Пропущенных значений (по анализируемым переменным) в базе данных не было.
На втором этапе исследования из исходных выборок были сформированы подвыборки для проведения генетического анализа. Отбор пациентов осуществлялся методом простой рандомизации, размер групп составил: 49 пациенток с НБ и 53 с ФР. Для анализа аллельных вариантов генов ферментов CYP1A1, CYP1A2, GSTM1 и GSTT1, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, выполнялся забор венозной крови в стерильную одноразовую пробирку объемом 5 мл, содержащую консервант (раствор K3EDTA) в соотношении 1:10. Хранение образцов осуществляли при температуре -20°С вплоть до постановки реакции. Характеристики генов представлены в таблице 1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Геномную ДНК из лейкоцитов периферической крови выделяли с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом [19]. Образцы ДНК хранили при -20°C. Генотипирование однонуклеотидных замен в генах GSTM1, GSTT1, CYP1A2*1F, CYP1A1*2C проводили методом RealTime на приборе DTprime 4 (ООО «НПО ДНК-Технология») с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизмов были разработаны ИХБФМ СО РАН и синтезированы ООО «СибДНК». Каждый образец амплифицировался с использованием пары праймеров и двух зондов, несущих «гаситель» на 3’-конце и разные флюоресцентные красители (FAM либо R6G) на 5’-конце. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40–100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100–200 нМ Taqman-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, амплификационный буфер термостабильную Taq-полимеразу – 0,5 единиц активности на реакцию. Основным параметром, который мы учитывали для каждой из реакций, являлось соотношение значений флюоресценции (relative fluorescence unit, RFU) в диапазонах эмиссии красителей FAM и R6G.
Для генотипа С/С (CYP1A1*2C) интенсивность флюоресценции увеличивалась преимущественно в диапазоне FAM, при генотипе Т/Т (CYP1A1*2C) – преимущественно в диапазоне R6G, при гетерозиготном генотипе интенсивность флюоресценции увеличивалась в обоих диапазонах. При типировании генов GSTM (del), GSTT (del) отсутствие
флюоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции (мутация) генов GSTM1 и GSTT1 – 0/0. Гетерозиготы по мутации (генотип +/0) рассматривались в одной группе с гомозиготными носителями «нормальных» генов (+/+). Исследование полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков выполнено на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний» г. Новокузнецка (директор – профессор Михайлова Н.Н.).
Статистический анализ
Все анализируемые переменные были категориальными. Описательная статистика представлена абсолютными значениями (n) и относительными частотами (%). Сравнения двух групп по качественным номинальным показателям проводили в ходе анализа таблиц сопряженности критерием хи-квадрат. Для слабонасыщенных таблиц (имелись ячейки со значениями ≤5), оценку статистической значимости проводили с помощью точного критерия Фишера.
Анализ второй части исследования (генетический анализ) проводился в соответствии с современными тенденциями статистической обработки в генетико-эпидемиологических исследованиях [20]. Проводилось сравнение групп по пяти возможным моделям наследования (кодоминантной, доминантной, рецессивной, сверхдоминантной и лог-аддитивной). В отсутствие случаев гомозиготного рецессивного генотипа анализировалась только кодоминантная модель. Для каждой модели рассчитывался информационный критерий Акаике. Оценка статистической значимости проводилась с помощью теста отношения правдоподобия. Считалось, что наиболее вероятная для каждого конкретного генного полиморфизма модель наследования имеет наименьшее значение информационного критерия Акаике. Для каждой модели наследования представлены отношения шансов и их 95% доверительный интервал, в качестве референсного выбран гомозиготный доминантный генотип.
Различия считали статистически значимыми при p≤0,05. Расчеты производились с использованием статистической среды R (v.3.6, лицензия GNU GPL2).
Результаты
Группы исследования были сопоставимы по возрасту, месту жительства, гинекологическому анамнезу (табл. 2).
Установлено, что пациентки с НБ имели хороший уровень соматического здоровья и значимо реже страдали: ожирением (p<0,001), заболеваниями эндокринной системы (p<0,001), органов дыхания (p<0,001), сердечно-сосудистой системы (p<0,001), желудочно-кишечного тракта (p=0,007), нервной системы (p<0,001), органов зрения (p<0,001) и мочевыделительной системы (p<0,001) (табл. 3).
При исследовании влагалищной микробиоты у них преобладала условно-патогенная флора (р<0,001), и значимо чаще выявлялся кандидозный вульвовагинит (p<0,001) (табл. 4). В свою очередь, при морфологическом исследовании абортивного материала в группе пациенток с НБ в 14,0% (24/172) случаев был выявлен воспалительный процесс; в то время как при ФР в 2 раза реже наблюдались воспалительные изменения в плаценте – 6,5% (12/186) (р<0,001), что подтверждает многофакторность генеза НБ и позволяет рассматривать воспаление одним из факторов риска ранних репродуктивных потерь.
Кроме того, в нашем исследовании установлены различные частоты полиморфных вариантов генов, кодирующих ферменты I и II фаз системы биотрансформации ксенобиотиков (табл. 5, 6).
При анализе гена CYP1A2 было выявлено, что наиболее вероятной моделью наследования является доминантная модель (критерий Акаике равен 138,4, наименьший среди других моделей), что свидетельствует об ассоциации гомозиготного генотипа А/А гена CYP1A2 с ЗБ: А/С – С/С относительно А/А являются протективными (ОШ=0,38, 95% ДИ: 0,17–0,86, p=0,018). Генотип АА гена CYP1A2 связан с высокой индуцибельностью и активностью кодируемого фермента. Это приводит к повышению риска развития различных форм отягощенного акушерского анамнеза, в том числе и НБ, в связи с увеличением скорости мутационного процесса за счет повреждения молекул ДНК ПАУ-ДНК-аддуктами. Активность работы данного фермента в норме регулируется организмом женщины, что приводит к снижению его выработки в течение всей беременности; в связи с этим гомозиготный генотип АА матери увеличивает мутационную нагрузку на плод, особенно в условиях экологического неблагополучия и является фактором риска осложнений течения беременности [21].
Особый интерес представляет гетерозиготный генотип AG гена CYP1A1, ассоциированный с гибелью плодного яйца у первобеременных женщин, так как аллель G крайне редко встречается в популяции и в нашей выборке был обнаружен только в составе гетерозиготной формы AG гена CYP1A1 [22]. Распространенный в популяции генотип А/А гена CYP1A1 в нашем исследовании наблюдался статистически значимо чаще у женщин с ФР (ОШ=4,98, 95% ДИ: 1,0–24,72, p=0,005), что ассоциировано с резистентностью к ранним репродуктивным потерям.
При анализе частот встречаемости полиморфизма генов GSTM1 «0» (ОШ=3,67, 95% ДИ: 1,47–9,14, p=0,005) и GSTT1 «0» (ОШ=16,86, 95% ДИ: 2,1–135,41, p<0,001) выявлена статистически значимая ассоциация делеционных форм этих генов с гибелью плодного яйца. У носителей данных аллелей наблюдается протяженная делеция в структурной части обоих генов, что приводит к отсутствию ферментативной активности, снижению конъюгирования токсичных продуктов I фазы, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами и их накоплению в организме беременной женщины.
Таким образом, у женщин с НБ мы наблюдаем увеличение частот встречаемости форм генов, обеспечивающих активность работы ферментов I фазы системы биотрансформации ксенобиотиков, что очевидно выгодно в условиях повышенной антропогенной нагрузки. Одновременно с этим повышенная частота делеционных полиморфизмов генов II фазы системы биотрансформации ксенобиотиков свидетельствует о снижении активности глутатион-S-трансфераз и нарушении выведения токсичных продуктов.
Обсуждение
Гены подсемейства цитохрома человека P450 CYP1A1 (хромосома 15q24.1) и CYP1A2 (хромосома 15q22), кодирующие монооксигеназы, полиморфны и критически вовлечены в биотрансформацию ключевых эндогенных субстратов (эстрадиол, арахидоновая кислота, холестерин) и экзогенных соединений (компоненты дыма, полициклические ароматические углеводороды, гетероциклические амины, диоксины, проканцерогенные ариламины, кофеин, терапевтические препараты) [14, 23]. Значимое увеличение частоты определенных форм генов CYP1A1 и CYP1A2 у пациенток с НБ, показанное в нашем исследовании, подтверждает вовлечение полиморфизмов генов ферментов I фазы биотрансформации ксенобиотиков в формирование ранних репродуктивных потерь, что согласуется с данными других авторов [24].
Известно, что адекватная работа ферментов детоксикации ксенобиотиков обеспечивает устойчивость организма к вредным факторам внешней среды. Промежуточные электрофильные метаболиты I стадии чрезвычайно токсичны и в случае повышенной активности ферментов I фазы при одновременном снижении каталитической активности ферментов II фазы детоксикации, накапливаются в организме, повреждая его [25].
В нашем исследовании выявлена связь определенных форм генов I и II фаз системы биотрансформации ксенобиотиков с высоким риском гибели плодного яйца у первобеременных молодых женщин. Была показана значимо высокая частота делеций в генах GSTM1 и GSTТ1 у пациенток с НБ в сравнении с таковой у женщин с ФР. Семейство глутатион-S-трансфераз (GST) объединяет полифункциональные антиоксидантные ферменты II стадии детоксикации GSTM1, GSTT1 и GSTР1, которые начинают экспрессироваться еще в эмбриональном периоде развития. При делециях в генах GSTМ1 (хромосома 1p13.3) и GSTТ1 (хромосома 22q11.2) утрачивается функциональная активность ферментов GSTM1 и GSTT1 [26, 27]. Результатом снижения активности и дисбаланса ферментов является накопление в организме матери и плода различных токсинов, что и способствует как невынашиванию беременности, так и возникновению осложнений во время беременности [28]. Впервые ассоциация функционально ослабленных аллелей генов GSTM1 с невынашиванием беременности была установлена в 1996 г. Hirvonen A. et al. [29]. Позднее сотрудниками НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта (Санкт-Петербург), а также другими учеными было подтверждено наличие такой связи с репродуктивными потерями [10, 30].
Гены системы биотрансформации ксенобиотиков часто включаются в исследования, посвященные изучению репродуктивных потерь. В результате этого накоплены противоречивые данные, скорее связанные с различиями популяционного фона, степенью антропогенной нагрузки и критериями отбора. Новокузнецк располагается в районе с критически высоким уровнем антропогенной нагрузки [31], что влияет на направление и скорость естественного отбора. Кроме того, юг Кемеровской области – место исконного проживания шорского этноса, и это может обуславливать популяционную частоту встречаемости делеционных полиморфизмов генов II фазы системы биотрансформации ксенобиотиков [32].
Пациентки с первой НБ в нашем исследовании представлены соматически здоровыми и без отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза, но при этом с такими формами генов I и II фаз системы биотрансформации ксенобиотиков, которые, скорее всего, могут нарушать баланс в работе ферментов детоксикации, что делает женский организм уязвимым и неустойчивым во время беременности в условиях высокой антропогенной нагрузки. Это позволяет думать о приоритетности вредного воздействия экзофакторов (внешняя среда), перед эндофакторами (состояние внутреннего гомеостаза) как одного из механизмов репродуктивных потерь.
Заключение
Наличие гетерозиготного варианта А/G гена CYP1A1 и гомозиготного А/А гена CYP1A2 в сочетании с делециями в генах GSTM1 и GSTТ1, возможно, формирует генетическую основу для нарушения баланса между процессами токсификации и детоксикации, что и способствует усилению образования высокотоксичных метаболитов ксенобиотиков и гибели плодного яйца на ранних этапах по причине возникновения мутаций, несовместимых с жизнью. В свою очередь, гомозиготный генотип А/А гена CYP1A1, наряду с нормальными генотипами GSTM1 и GSTТ1, ассоциируются с благополучным исходом беременности и маркируют отсутствие риска НБ. Проведенное исследование определяет необходимость разработки методов генетического мониторинга, учитывающего молекулярно-генетические особенности женщин, планирующих беременность. Выявленные маркеры риска репродуктивных потерь позволят использовать их при оценке индивидуальной предрасположенности к НБ при планировании беременности и профориентации молодых женщин. Авторы считают очевидной необходимость дальнейшего изучения механизмов генетического контроля НБ.
