Уровень экспрессии длинных некодирующих РНК ROR и MALAT1 при эндометриозе

Леваков С.А., Мамедова А.Э., Азадова Г.Я., Пауков С.В., Маслякова М.И., Павлюков М.С., Шахпаронов М.И., Антипова Н.В.

1) Кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Минздрава России, Москва, Россия; 2) ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Москва, Россия; 3) Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», Москва, Россия
Цель. Оценить уровень экспрессии длинных некодирующих РНК ROR и MALAT1 в биоптатах ткани яичников, пораженной эндометриозом, относительно группы контроля.
Материалы и методы. Были исследованы образцы эндометриоидных кист яичников и тканей яичников, не пораженных эндометриозом, от 20 женщин репродуктивного возраста. Проведен анализ экспрессии длинных некодирующих РНК ROR и MALAT1 с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров, специфичных для данных генов.
Результаты. Выявлено значимое понижение уровня экспрессии длинной некодирующей РНК ROR и повышение экспрессии MALAT1 в образцах тканей, пораженных эндометриозом, относительно группы контроля.
Заключение. В ходе работы была выявлена взаимосвязь между понижением уровня экспрессии lncROR, повышением уровня MALAT1 и наличием эндометриоза яичников. Полученные результаты свидетельствуют о возможной роли длинных некодирующих РНК в развитии пролиферативных процессов при эндометриозе яичников и коррелируют с данными, полученными нами при анализе образцов миомы матки. Дальнейшие исследования могут определить клинический потенциал длинных некодирующих РНК в диагностике и лечении пролиферативных заболеваний женской репродуктивной системы, в частности, предраковых патологий яичников.

Ключевые слова

эндометриоз
длинные некодирующие РНК
lncROR
MALAT1

Эндометриоз является хроническим, эстроген-зависимым, прогрессирующим заболеванием и характеризуется наличием эндометриоидной ткани, желез и стромы вне полости матки [1]. Чаще всего поражаются яичники, маточные трубы и тазовая брюшина. Это заболевание связано с имплантацией эндометриоидно-подобных клеток, сопровождающейся их повышенной пролиферацией и миграцией. Эндометриоз – одна из ведущих причин заболеваемости женщин в фертильном возрасте и во время пременопаузы [2]; оно может привести к самопроизвольному прерыванию беременности и бесплодию в 50% случаев [3]. Золотым стандартом диагностики эндометриоза являются лапароскопия и гистологическое исследование хирургического образца [4]. Наиболее распространенными причинами эндометриоза являются ретроградная менструация, генетическая предрасположенность, лимфогенное распространение, иммунная дисфункция, метаплазия, а также экологические причины. Помимо значительных отрицательных эффектов, касающихся здоровья и благополучия женщин, нельзя игнорировать риск развития эндометриоз-ассоциированного рака яичников [5, 6].

Длинные некодирующие РНК (днРНК) являются большой группой некодирующих РНК длиной более 200 нуклеотидов [7]. ДнРНК, как факторы регуляции, играют важную роль в сложных клеточных процессах: апоптозе, росте, дифференцировке, пролиферации и т.д. Циркулирующие днРНК представляют собой перспективные биомаркеры при различных заболеваниях, включая эндомет­риоз [8]. Накапливающиеся данные показывают, что днРНК связаны с инициацией и развитием многих типов рака и могут функционировать как онкогены или супрессоры опухолей [9, 10]. По этой причине количество некоторых днРНК сильно изменено в клетках опухолей по сравнению с нормальными тканями.

Ранее было показано, что при эндометриозе яичников наблюдается повышенный уровень аутофагии; этот процесс регулируется днРНК MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1) и может способствовать выживанию эндометриоидных клеток в эктопических участках и поддержанию поражения эндометрия [11]. Изучение роли днРНК при эндометриозе открывает путь для создания новых диагностических тестов и определения новых терапевтических мишеней [12].

Длинная некодирующая РНК ROR (regulator of reprogramming), по литературным данным, влияет на возникновение и развитие опухолей человека, включая рак груди, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному и другие [9, 13]. Нарушение регуляции lncROR тесно связано с клинико-патологическими факторами, указывающими на неблагоприятный прогноз.

Важно отметить, что основным патологическим механизмом возникновения таких заболеваний, как эндометриоз, является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), для которого показана связь с изменением экспрессии днРНК MALAT1 и ROR [9, 14]. Таким образом, выяснение роли днРНК в нормальных и патологических клетках крайне важно.

Цель исследования: оценить уровень экспрессии длинных некодирующих РНК ROR и MALAT1 в биоптатах ткани яичников, пораженной эндометриозом, относительно группы контроля.

Материалы и методы

В исследовании принимали участие 20 пациенток, которые были разделены на 4 группы: 1-я группа – пациентки с эндометриоидными кистами яичников и гиперплазией эндометрия (n=5); 2-я группа – пациентки с изолированными эндометриоидными кистами яичников (n=5); 3-я группа – пациентки с сочетанием эндометриоидных кист яичников и аденомиоза/миомы матки (n=5); 4-я группа – конт­рольная (n=5). Критерии включения в исследование для 1-й группы: общие требования – женщины репродуктивного возраста (от 18 до 45 лет); для 2-й группы – пациентки с установленным диагнозом эндометриоза яичников; для 3-й группы – пациентки с установленным диагнозом эндометриоза яичников в сочетании с аденомиозом и/или миомой матки.

К критериям невключения относили: ювенильный, перименопаузальный и постменопаузальный возрастные периоды (младше 18 лет и старше 45 лет), острые воспалительные заболевания, тяжелая экстрагенитальная патология, аутоиммунные заболевания, онкологические заболевания.

В ходе исследования все пациентки предоставляли данные возраста, роста, массы тела. На основании последних двух рассчитывался индекс массы тела (ИМТ) (табл. 1). Исследование было одобрено этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, выписка из протокола №33-20, от 25.11.2020.

На первом этапе молекулярно-генетического исследования проводили оперативное лечение лапароскопическим доступом и удаляли эндометриоидную кисту/кисты яичников. При заборе материала от основного препарата отделяли небольшой участок кисты (0,3–0,5 см) и погружали в стерильную пробирку. В каждый образец добавляли 1 мл тризола с целью ингибирования работы РНКаз, затем гомогенизировали и быстро замораживали при температуре -80˚С. Выделение тотальной мРНК проводилось реагентом ExtractRNA BC032 фирмы «Евроген» по методике производителя, синтез первой цепи кДНК – по протоколу набор MMLV RT SK021 фирмы «Евроген». Уровень экспрессии lncROR и MALAT1 определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией в реальном времени с помощью амплификатора LightCycler 96 Real-Time PCR System (Roche) с использованием праймеров, специфичных для 18S, lncROR и MALAT1 (табл. 2). ПЦР проводили при следующих условиях: предварительная инкубация – 150 с при 95°C; трехшаговая амплификация – 20 с при 95°C, 20 с при 60°C, 20 с при 72°C – 45 циклов; детекция температуры плавления продуктов реакции.

Нормирование образцов кДНК проводилось по контрольному гену рибосомальной 18S РНК. Относительные уровни экспрессии генов lncROR и MALAT1 рассчитывали методом 2-ΔΔCT [15]. Отсутствие побочных продуктов ПЦР определяли по кривой плавления. Для каждой пары праймеров во всех образцах наблюдали одинаковые пики плавления. ПЦР каждого образца в 3 повторах. Полученные значения Ct (cycle threshold) для каждого образца не превышали 35.

Результаты и обсуждение

При анализе транскриптома человека в базе данных TCGA (The Cancer Genome Atlas) для эндометриоза был выявлен увеличенный уровень экспрессии днРНК MALAT1 [11]. В ходе нашей работы методом ПЦР в реальном времени мы также показали повышение уровня экспрессии MALAT1 в группах патологий с эндометриоидными кистами яичников (рис. 1).

143-1.jpg (209 KB)

Важно отметить, что, по нашим результатам, уровень экспрессии MALAT1 различается в паталогических подгруппах, и самый высокий уровень экспрессии наблюдается в группе с сочетанными патологиями эндометриоидной кисты яичника и аденомиоза/миомы матки, возникновение которых тесно связано с ЭМП.

Следующим шагом мы определили уровень экспрессии lncROR (regulator of reprogramming). В отличие от MALAT1, lncROR не полиаденилирована, в связи с чем эта днРНК не детектируется при наиболее частом методе пробоподготовки для РНК секвенирования и, таким образом, отсутствует в базах данных, таких как TCGA. Полученные нами результаты показывают, что экспрессия lncROR более чем в 10 раз понижена во всех исследованных патологиях по сравнению с контрольными образцами. Самый низкий уровень экспрессии lncROR наблюдается в изолированных кистах яичников без сочетанных патологий. В группе с гиперплазией эндометрия уровень экспрессии lncROR выше, а наиболее высокий уровень характерен для группы с сочетанием эндометриоидной кисты яичников и аденомиоза или миомы матки (рис. 2). Таким образом, выбранные нами группы значительно отличаются по представленности данной днРНК.

144-1.jpg (55 KB)Разница между патологическими группами позволяет сделать вывод, что существует механизм регуляции, ответственный за снижение днРНК ROR в клетках доброкачественных новообразований. Известно, что повышенный уровень экспрессии lncROR связан с выживанием в условиях гипоксии и может подавляться miR-145 в опухолевых клетках. Кроме того, было описано участие lncROR в межклеточном взаимодействии благодаря секреции данной днРНК внутри везикул [16, 17].

В работе Chen Yang et al. описана роль днРНК ROR в процессе онкогенеза. LncROR рассматривается как онкоген, влияющий на прогрессирование опухоли, а также как предвестник плохого прогноза для больных раковыми заболеваниями [9]. Таким образом, можно предположить, что заболевания, работа с которыми велась в нашем исследовании, остаются доброкачественными по причине низкого уровня lncROR, а при его повышении возможен переход в злокачественные формы. В соответствии с этим было показано, что уровень экспрессии lncROR повышен при раке яичников [18]. Данное предположение требует дальнейшего изучения и может открыть новые возможности для лечения эндометриоза и предотвращения его развития.

Заключение

В ходе исследования нами было выявлено понижение уровня экспрессии lncROR и повышение уровня экспрессии MALAT1 в образцах ткани с эндометриозом яичников. Полученные результаты свидетельствуют о возможной роли длинных некодирующих РНК в развитии эндометриоза и хорошо совпадают с данными, полученными нами при изучении уровня экспрессии этих днРНК в образцах от пациентов с миомой матки. Таким образом, определение экспрессии длинных некодирующих РНК может играть значимую роль в диагностике эндометриоза яичников. Важно отметить, что, насколько нам известно, уровни lncROR и MALAT1 ранее не сравнивались в группах с сочетанными патологиями, изученными в нашей работе. Требуется проведение дальнейших научных исследований в данном направлении с целью разработки новых прогностических маркеров эндометрий-ассоциированного рака яичников и поиска дополнительных терапевтических мишеней.

Список литературы

  1. de Ziegler D., Borghese B., Chapron C. Endometriosis and infertility: pathophysiology and management. Lancet. 2010; 376(9742): 730-8. https://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60490-4.
  2. Baldi A., Campioni M., Signorile P.G. Endometriosis: pathogenesis, diagnosis, therapy and association with cancer (review). Oncol. Rep. 2008; 19(4): 843-6.
  3. Dunselman G.A., Vermeulen N., Becker C., Calhaz-Jorge C., D’Hooghe T., De Bie B. et al. European Society of Human Reproduction Embryology. ESHRE guideline: management of women with endometriosis. Hum. Reprod. 2014; 29(3): 400-12. https://dx.doi.org/10.1093/humrep/det457.
  4. Guerriero S., Condous G., van den Bosch T., Valentin L., Leone F.P., Van Schoubroeck D. et al. Systematic approach to sonographic evaluation of the pelvis in women with suspected endometriosis, including terms, defnitions and measurements: a consensus opinion from the International Deep Endometriosis Analysis (IDEA) group. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2016; 48(3): 318-32. https://dx.doi.org/10.1002/uog.15955.
  5. Sofo V., Gotte M., Lagana A.S., Salmeri F.M., Triolo O., Sturlese E. et al. Correlation between dioxin and endometriosis: an epigenetic route to unravel the pathogenesis of the disease. Arch. Gynecol. Obstet. 2015; 292(5): 973-86. https://dx.doi.org/10.1007/s00404-015-3739-5.
  6. Vetvicka V., Kralickova M. Current theories on endometriosis pathogenesis. Edorium J. Mol. Pathol. 2015; 1: 1-4.
  7. Wang M., Yu F., Chen X., Li P., Wang K. The underlying mechanisms of noncoding RNAs in the chemoresistance of hepatocellular carcinoma. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2020; 21: 13-27. https://dx.doi.org/10.1016/j.omtn.2020.05.011.
  8. Sun D.E., Ye S.Y. Emerging roles of long noncoding RNA regulator of reprogramming in cancer treatment. Cancer Manag. Res. 2020; 12: 6103-12. https://dx.doi.org/10.2147/CMAR.S253042.
  9. Chen W., Yang J., Fang H., Li L., Sun J. Relevance function of linc-ROR in the pathogenesis of cancer. Front. Cell Dev. Biol. 2020; 8: 696. https://dx.doi.org/10.3389/fcell.2020.00696.
  10. Peng Z., Liu C., Wu M. New insights into long noncoding RNAs and their roles in glioma. Mol. Cancer. 2018; 17: 61. https://dx.doi.org/10.1186/s12943-018-0812-2.
  11. Liu H., Zhang Z., Xiong W., Zhang L., Du Y., Liu Y., Xiong X. Long non-coding RNA MALAT1 mediates hypoxia-induced pro-survival autophagy of endometrial stromal cells in endometriosis. J. Cell. Mol. Med. 2019; 23(1): 439-52. https://dx.doi.org/10.1111/jcmm.13947.
  12. Panir K., Schjenken J.E., Robertson S.A., Hull M.L. Non-coding RNAs in endometriosis: a narrative review. Hum. Reprod. Update. 2018; 24(4): 497-515. https://dx.doi.org/10.1093/humupd/dmy014.
  13. Fei D., Sui G., Lu Y., Tan L., Dongxu Z., Zhang K. The long non-coding RNA-ROR promotes osteosarcoma progression by targeting miR-206. J. Cell. Mol. Med. 2019; 23(3): 1865-72. https://dx.doi.org/10.1111/jcmm.14087.
  14. Du Y., Zhang Z., Xiong W., Li N., Liu H., He H. et al. Estradiol promotes EMT in endometriosis via MALAT1/miR200s sponge function. Reproduction. 2019; 157(2): 179-88. https://dx.doi.org/10.1530/REP-18-0424.
  15. Rao X., Huang X., Zhou Z., Lin X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat. Bioinforma Biomath. 2013; 3(3): 71-85.
  16. Dragomir M., Chen B., Calin G.A. Exosomal lncRNAs as new players in cell-to-cell communication. Transl. Cancer Res. 2018; 7(Suppl. 2): S243-52. https://dx.doi.org/10.21037/tcr.2017.10.46.
  17. Takahashi K., Yan I.K., Haga H., Patel T. Modulation of hypoxia-signaling pathways by extracellular linc-RoR. J. Cell Sci. 2014; 127(Pt 7): 1585-94. https://dx.doi.org/10.1242/jcs.141069.
  18. Chen Y., Peng Y., Xu Z., Ge B., Xiang X., Zhang T. et al. LncROR promotes bladder cancer cell proliferation, migration, and epithelial-mesenchymal transition. Cell. Physiol. Biochem. 2017; 41(6): 2399-410. https://dx.doi.org/10.1159/000475910.

Поступила 29.12.2020

Принята в печать 02.04.2021

Об авторах / Для корреспонденции

Леваков Сергей Александрович, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии Института клинической медицины имени Н.В. Склифосовского, ФГБУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет). Тел.: +7(925)506-31-44. E-mail: levakoff@yandex.ru.
ORCID: 0000-0002-4591-838X. 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
Мамедова Айнур Эльхан кызы, аспирант кафедры акушерства и гинекологии Института клинической медицины имени Н.В. Склифосовского, ФГБУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет). Тел.: +7(968)400-73-02. E-mail: venesuela93@gmail.com. ORCID: 0000-0002-9642-4523.
119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
Азадова Гюллар Ясир кызы, аспирант кафедры акушерства и гинекологии Института клинической медицины имени Н.В. Склифосовского, ФГБУ ВО «Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет). Тел.: +7(985)083-18-08. E-mail: gullyar.azadova@mail.ru.
119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
Пауков Сергей Вячеславович, к.м.н., доцент кафедры акушерства и гинекологии Института клинической медицины имени Н.В. Склифосовского, ФГБУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет). Тел.: +7(985)411-11-66. E-mail: spaukov@mail.ru. 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
Маслякова Марина Игоревна, студент, Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики». E-mail: marimasmari@gmail.com.
101000, Россия, Москва, ул. Мясницкая, д. 20.
Павлюков Марат Самвелович, д.б.н., в.н.с. Лаборатории мембранных и биоэнергетических систем, ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. E-mail: marat.pav@mail.com. 117997, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
Шахпаронов Михаил Иванович, д.х.н., в.н.с. Лаборатории мембранных и биоэнергетических систем, ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. E-mail: shakhparonov@gmail.com. ORCID: 0000-0001-5965-8067. 117997, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
Антипова Надежда Викторовна, к.б.н., с.н.с. Лаборатории мембранных и биоэнергетических систем, ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Тел.: +7(977)773-22-07. E-mail: Nadine.antipova@gmail.com. ORCID: 0000-0002-5799-7767.
117997, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

Для цитирования: Леваков С.А., Мамедова А.Э., Азадова Г.Я., Пауков С.В., Маслякова М.И., Павлюков М.С., Шахпаронов М.И., Антипова Н.В. Уровень экспрессии длинных некодирующих РНК ROR и MALAT1 при эндометриозе.
Акушерство и гинекология. 2021; 5: 141-145
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2021.5.141-145

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.