Актуальность расширения возможностей профилактики рака шейки матки продиктована его распространенностью, особенно среди женщин репродуктивного возраста. Безусловно, эффективность вторичной профилактики (скрининга), включающей цитологическое исследование (РАР-тест) и выявление ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР), зависит не только от степени охвата определенной части популяции, но и от чувствительности и специфичности применяемого диагностического теста.
Цитологический тест, принятый во многих странах как стандарт скрининга рака шейки матки, демонстрирует низкую чувствительность (51–60%) для патологии и относительно высокую специфичность для нормы [1]. Согласно одному из последних метаанализов, чувствительность цитологического исследования при цервикальной интраэпителиальной неоплазии 3-й степени и выше (CIN3+) составляет 52,8–75,4%, а специфичность – 78,0–85,6%. При этом известно, что низкая чувствительность данного теста обусловлена степенью «вовлеченности» в его выполнение человеческого фактора: речь идет не только о качестве полученного для исследования материала, включая степень захвата зоны трансформации, но и о субъективизме цитолога, интерпретирующего результаты исследования. В настоящее время ведется поиск новых лабораторных тестов, позволяющих увеличить диагностическую ценность цитологического исследования. К ним относится метод жидкостной цитологии, позволяющий улучшить качество и адекватность полученного материала. В ранее упомянутом метаанализе дополнительно оценивалась диагностическая эффективность ASC-US+ (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения) и LSIL+ (изменения плоского эпителия низкой степени злокачественности) при жидкостной цитологии [1]. Чувствительность и специфичность ASC-US+ составляли 52–94% и 73–97% – для обнаружения CIN2+ и 52–98% и 73–97% – для обнаружения CIN3+ соответственно. Чувствительность и специфичность LSIL+ составляли 42–87% и 90–99% – для обнаружения CIN2+ и 48–93% и 92–98% – для обнаружения CIN3+ соответственно.
Другим способом повышения чувствительности цитологического скрининга считается его сочетание с различными вариантами ВПЧ-теста. Известно, что ВПЧ 45 типа ответственен за примерно 5% случаев рака шейки матки, ВПЧ 18 – около 15%, а на наиболее канцерогенный ВПЧ 16 типа приходится примерно 60% случаев рака шейки матки [2]. В недавнем канадском ретроспективном исследовании в выборке из 1396 ВПЧ-положительных женщин генотипирование ВПЧ сравнивали с цитологическим исследованием (в качестве сортировочного теста). Рассчитана прогностическая ценность положительного результата (PPV) для выявления CIN2+ в первый год наблюдения. Для цитологического заключения ASC-US или более PPV составляла 20,9% по сравнению с 31,8% для случаев с выявленным ВПЧ 16 типа [3]. Изучение степени экспрессии маркеров клеточной пролиферации является еще одной возможностью влияния на диагностические характеристики цитологического теста. В крупном европейском многоцентровом исследовании анализировалась диагностическая эффективность оценки гиперметилирования участков промоторов генов-супрессоров опухоли FAM19A4/mir124-2 у 2384 ВПЧ-положительных женщин для выявления CIN2+ в течение 2 лет наблюдения. Чувствительность обнаружения CIN3 составила 77,2%, а CIN2 – 46,8%. Общая специфичность этого теста составила 78,3% [4]. В последнее время активно изучается диагностическая ценность иммуноцитохимического теста, позволяющего с помощью дополнительного окрашивания цитологических препаратов обнаруживать степень выраженности экспрессии белков-маркеров клеточной пролиферации. Белок p16ink4α замедляет клеточный цикл дифференцировки, блокируя переход от фазы G1 к фазе S. Увеличение содержания этого белка в клетках, инфицированных ВПЧ ВКР, обусловлено необходимостью замедления прогрессирования клеточного цикла. В то же время экспрессия белка p16ink4α может быть идентифицирована не только в атипичных клетках, но и при плоскоклеточной метаплазии цилиндрического эпителия [5]. Антиген Ki-67 представляет собой ядерный белок, связанный с клеточной пролиферацией и транскрипцией рибосомной РНК, то есть является маркером клеточной пролиферации. В нормальной клетке с сохранным физиологическим контролем процессов деления, дифференцировки и запрограммированного апоптоза экспрессия белков p16ink4α и Ki67 взаимно исключаема; по этой причине одновременное обнаружение этих белков в одной клетке (так называемая «двойная метка») является сигналом нарушения клеточного цикла [6]. Еще одним аргументом, определяющим актуальность дополнительных диагностических тестов, является большой выбор тактических вариантов ведения пациенток с аномальными результатами цитологических тестов. Так, например, при получении результата цитологического исследования ASC-US предлагается два варианта ведения: повторный цитологический тест через год или дополнительное тестирование на носительство ВПЧ ВКР, а при положительном результате теста – проведение кольпоскопии и биопсии [7, 8].
Важно заметить, что все предлагаемые методы диагностики подразумевают привлечение специальных лабораторий, их особенное оснащение и качество выполнения тестов, а также высокую квалификацию врача, выполняющего кольпоскопическое исследование. При этом время ожидания результатов исследования увеличивает эмоциональную напряженность пациентки, подразумевает многократность визитов к врачу, при ложноположительных результатах увеличивает частоту необоснованных инвазивных процедур с соответствующими осложнениями, а значит, может влиять на результат скрининга. Именно поэтому дополнительные информативные диагностические методы, в том числе с применением технологий искусственного интеллекта, позволили бы «сортировать» (triage-test) пациенток с целью обоснования необходимости применения инвазивных методов диагностики.
В последнее время наиболее актуальными остаются способы диагностики в реальном времени, например, оптикоэлектронные технологии, в основе которых лежит эффект флуоресценции в различных спектрах светового излучения: например, в MediSpectra используется флуоресценция в ультрафиолетовом спектре, в Lifespex – в видимом и ультрафиолетовом спектрах, в TruScreen – в инфракрасном и видимом спектрах света [9].
Ядерно-цитоплазматическая перестройка в отдельных клетках, а также изменение пространственных взаимоотношений клеток при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях (SIL) различной степени выраженности приводят к изменению физико-химических и оптических характеристик ткани. Различия в способности поглощать и отражать оптические сигналы разных длин волн позволяют дифференцировать нормальные и атипично измененные участки исследуемой ткани. Так, оценка способности тканей к поглощению и отражению ультрафиолетового светового сигнала и анализ полученных спектроскопических параметров позволили на 25% повысить диагностическую ценность биопсии шейки матки при традиционной кольпоскопии и лишь в 4% выполнить биопсию на основании ложноположительного результата исследования [10]. Наиболее распространенной оптикоэлектронной системой детекции SIL является технология TruScreen, которая позволяет анализировать способность ткани к поглощению и отражению инфракрасного и видимого светового спектра (комбинация излучений с длинами волн 525 нм, 660 нм и 936 нм). С помощью ручного зонда, оснащенного биодатчиками для измерения оптических свойств ткани, контактным способом фиксируются результаты из множества точек (в зависимости от площади поражения сканируется в среднем 21 точка). Во время исследования индикатор «стоп/продолжайте», расположенный на ручном зонде, сигнализирует оператору о возможности продолжения перемещения наконечника по поверхности шейки матки. При этом выбор зон сканирования зависит от исследователя и определяется эмпирически. Диапазон сканирования по глубине составляет от 200 до 300 мкм. Продолжительность процедуры – 1–2 минуты. После сканирования достаточного количества точек оператор получает сигнал о завершении процедуры. Полученные данные система автоматически сравнивает с включенной в ее программное обеспечение экспертной базой результатов гистологического исследования более 2000 образцов и на бумажном носителе выдает заключение о наличии или отсутствии SIL в одном из вариантов: «Normal» (нормальный сквамозный эпителий, цилиндрический эпителий, физиологическая метаплазия) или «Abnormal» (CIN 1–3, инвазивный рак) [11, 12]. Анализ полученных данных показал, что чувствительность TruScreen в обнаружении SIL составила 81,3% (83,3% – для SIL высокой степени злокачественности (HSIL) и 78,6% – для LSIL), специфичность для нормы – 50,0%. Прогностическая ценность положительного результата теста при обнаружении SIL составила 64,6%, отрицательного – 70,0% (для HSIL – 37,2 и 84,6% соответственно) [13]. Такие технологии могут считаться примером применения искусственного интеллекта в диагностических целях.
Еще одним примером флуоресцентной спектроскопии является диагностическая система LuViva Advanced Cervical Scan – инновационное медицинское устройство, которое использует сканирование белым светом для обнаружения химических и физических клеточных изменений. LuViva выступает в качестве лабораторного и диагностического теста в одном устройстве, обеспечивая тем самым немедленный и объективный результат на момент исследования [14].
Принцип действия системы LuViva Advanced Cervical Scan основан на технологии спектроскопии; сочетает в себе методы флуоресцентной спектроскопии внутриклеточных структур и спектроскопии отражения для выявления в них как химических, так и физических изменений (различия люминесценции здоровых и атипичных клеток, утолщение эпителия, уплотнение и изменение размера ядра, особенности ангиогенеза и др.) [15]. В технологии LuViva применяется низкий уровень ультрафиолетового излучения и видимого света (от 300 до 800 нм ультрафиолетового/видимого света). Глубина сканирования – 4–5 мм. Фактическое время сканирования составляет 1 минуту и 20 с. LuViva состоит из ручного и базового блоков, которые соединены посредством оптико-волоконного кабеля. Ручной блок используется совместно с одноразовым зондом-тубусом, который выступает в роли интерфейса пациента, обеспечивает барьер между пациентом и оборудованием, устанавливает оптическую дистанцию; при его использовании исключается попадание комнатного освещения во время процедуры. Зонд-тубус включает эталонную метку, необходимую для калибровки прибора перед каждым использованием, а также сохранения полученных данных и сравнения их с имеющимися в базе устройства результатами более 2000 образцов цервикальной ткани. После сканирования на дисплей выводится результат исследования в виде уровня риска наличия цервикальных поражений высокой степени (низкий, средний и высокий) [16].
Методика проведения сканирования следующая: вначале необходимо внести информацию о пациентке и откалибровать устройство, затем ввести гинекологическое зеркало, убрать выделения и подготовить шейку матки к исследованию. Ввести зонд-тубус до соприкосновения с шейкой матки, центрировать ее ось до совпадения с фокусной осью и начать сканирование. По завершении исследования получить сохраненный результат в виде изображений шейки матки «до» и «после» сканирования. Сравнение изображений «до» и «после» необходимо для исключения ошибки, возникшей из-за возможного смещения пациентки в результате движения. Таким образом достигается объективизация методики; сканирование осуществляется автоматически, без применения, например, точечного зонда исследователем, как это происходит при использовании метода TruScreen. При совпадении на экране монитора изображений шейки матки «до» и «после» сканирования результат исследования сохраняется, сравнивается с базой данных из памяти устройства, и на экране монитора появляется заключение исследования в виде низкого/среднего/высокого риска обнаружения CIN. Протокол исследования может быть получен как в бумажном виде, так и сохранен на электронном носителе с целью архивирования. В случае получения результата «средний риск» предлагается два варианта дальнейшего ведения пациентки: немедленная кольпоскопия, которая доступна и часто выполняется в Российской Федерации, с возможной биопсией и/или цервикальным кюретажем (при наличии показаний), или наблюдение с повторным скрининговым обследованием через 4–6 месяцев.
Целью нашего исследования явилась оценка диагностических характеристик флуоресцентной спектроскопии с помощью технологии LuViva при диагностике CIN.
Материалы и методы
В исследование были включены 156 пациенток в возрасте от 20 до 65 лет, которые обратились в ФГБНУ «НИИ АГР им. Д.О. Отта» для планового профилактического осмотра в 2020 г. Медиана возраста составила 32 года (Q1–Q3: 27–39 лет). Критериями исключения из исследования явились: беременность, лучевая терапия органов мочеполовой системы в течение последнего года в анамнезе, аномалии развития шейки матки (например, удвоение шейки матки), любые обильные влагалищные выделения во время проведения исследования, контактные кровянистые выделения, повышенная фоточувствительность (порфирия, эритематозная волчанка, фототерапия, недавняя терапия фторхинолонами или ретиноидами).
У всех пациенток было получено информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
Методы исследования
Всем пациенткам (n=156) были выполнены флуоресцентная спектроскопия поверхности шейки матки с помощью технологии LuViva, цитологическое исследование соскоба с поверхности шейки матки и из цервикального канала методом жидкостной цитологии. Побочных эффектов при проведении спектроскопии выявлено не было. Для описания результатов цитологического исследования применялась Бетесдинская классификационная система, согласно которой заключения были разделены на следующие категории: NILM (Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy) – отсутствие в исследуемом мазке внутриэпителиальных злокачественных изменений или признаков злокачественности; ASC-US; ASC-H (Atypical squamous cells cannot exclude HSIL) – клетки плоского эпителия с атипией неясного значения, не исключающие HSIL; LSIL; HSIL. Вместе с цитологическим тестом и флуоресцентной спектроскопией 138/156 пациенткам (88,5%) был выполнен тест на выявление в отделяемом из цервикального канала ВПЧ ВКР методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР Real-time) с определением 14 типов вирусов. Пациенткам с результатами цитологического исследования ASC-US и более и с положительным ВПЧ-тестом (согласно клиническим рекомендациям) были выполнены расширенная кольпоскопия и биопсия по показаниям с последующим гистологическим исследованием (n=52).
Статистический анализ
Анализ полученных данных и их визуализация проводились с помощью программной платформы статистического анализа IBM SPSS Statistics 26. При описании количественных показателей использовались медиана (Me) и значения нижнего и верхнего квартилей (Q1; Q3). При описании категориальных данных указывались абсолютные значения и процентные доли. Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью точного критерия Фишера (если минимальное предполагаемое число менее 10) и критерия хи-квадрат Пирсона (если минимальное предполагаемое число больше или равно 10). Размер эффекта (сила связи между признаками) оценивался с помощью V Крамера.
В качестве количественной меры эффекта при сравнении относительных показателей нами использовался показатель отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.
Исходной матрицей для расчета информативности диагностического теста являются четыре значения четырехпольной таблицы сопряженности (табл. 1).
Основными диагностическими показателями являются чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результата исследуемого теста. Чувствительность (Sensitivity, Se) – вероятность того, что результат теста будет положительным при наличии болезни: Se=TPR/(TPR+FNR). Специфичность (Specificity, Sp) – вероятность того, что результат теста будет отрицательным при отсутствии заболевания: Sp=TNR/(TNR+FPR). Прогностическая ценность положительного результата (Positive predictive value, PPV) – вероятность того, что заболевание присутствует, когда тест положительный: PPV=TPR/(TPR+FPR). Прогностическая ценность отрицательного результата (Negative predictive value, NPV) – вероятность того, что болезнь отсутствует, когда тест отрицательный: NPV=TNR/(TNR+FNR). Дополнительно рассчитывались биномиальные 95% ДИ для диагностических характеристик теста.
Границей разделения между цитологической нормой и патологией для оценки диагностических характеристик теста было заключение ASC-US, согласно терминологической системе Bethesda, а выявление ASС-H было приравнено к HSIL. Положительным результатом считался результат ≥ASC-US.
Графическая обработка данных проводилась при помощи программ Microsoft Office Excel 2019 и GraphPad Prism 9.1.0.
Результаты
Тест на ВПЧ ВКР методом ПЦР Real-time был выполнен у 138 пациенток; при этом он оказался положительным у 59/138 (43%) женщин, что позволило судить о распространенности папилломавирусной инфекции в исследуемой группе. Одновременно несколько типов вирусов ВКР было обнаружено у 10/59 (17%) пациенток; преобладающим типом в нашей выборке оказался 16 тип ВПЧ – у 41% (24/59). Распределение выявленных типов ВПЧ представлено на рисунке 1.
При анализе взаимосвязи положительного ВПЧ-теста и HSIL по результатам гистологического исследования биоптатов шейки матки выявлены статистически значимые различия (р=0,01). Так, при наличии ВПЧ шанс обнаружения HSIL оказался выше практически в 20 раз (ОШ=19,96; 95% ДИ 1,04–384,61) (рис. 2). Между сопоставляемыми признаками наблюдалась относительно сильная взаимосвязь (V=0,478).
Широкие 95% ДИ ОШ связаны с недостаточной мощностью выборки, что требует проведения дальнейших исследований.
Как уже было отмечено, цитологическое исследование соскоба с поверхности шейки матки и из цервикального канала методом жидкостной цитологии и флуоресцентная спектроскопия с помощью технологии LuViva были выполнены всем пациенткам.
На основании результатов флуоресцентной спектроскопии LuViva у 69/156 (44%) пациенток был выявлен «низкий риск» обнаружения интраэпителиальных поражений (мы считали этот результат отрицательным). Для стандартизации результатов флуоресцентной спектроскопии мы объединили в одну группу пациенток с заключениями «высокий» и «средний риск» и считали этот результат положительным; он был получен у 87/156 женщин (56%).
Согласно результатам цитологического исследования, к NILM были отнесены образцы, полученные у большинства пациенток (124/156); у 8/156 (5,13%) были обнаружены ASC-US; у 15/156 пациенток (9,6%) получено заключение LSIL, у 6/156 пациенток – ASC-H, у 3/156 пациенток – HSIL (то есть у 9/156 (5,8%) пациенток – интраэпителиальные поражения высокой степени).
Гистологическое исследование цервикальных образцов было выполнено у 52/156 пациенток (33%), включенных в исследование. Согласно полученным заключениям, преобладали пациентки без интраэпителиальных поражений в биоптатах шейки матки (n=26). LSIL была обнаружена у 18 женщин, HSIL – у 8. Таким образом, среди пациенток, включенных в исследование, у 26 (50% из всего числа выполненных биопсий) обнаружены SIL различной степени.
Нами определены диагностические характеристики цитологического теста при сравнении с гистологическим исследованием биоптатов шейки матки. Положительным результатом цитологического исследования считались заключения ASC-US и более. Согласно полученным нами результатам, чувствительность в отношении LSIL и HSIL составила 35,3 и 50% соответственно, специфичность была в пределах 91,4 и 93,2% соответственно. Положительная прогностическая ценность цитологического теста для LSIL и HSIL составила 66,7 и 57,1%, отрицательная прогностическая ценность – 74,4 и 91,1% соответственно (табл. 2).
Далее мы сравнили диагностические характеристики флуоресцентной спектроскопии LuViva с результатами гистологического исследования биоптатов шейки матки. Чувствительность флуоресцентной спектроскопии в обнаружении LSIL и HSIL составила 100 и 75% соответственно, специфичность – 34,3 и 22,7% соответственно. Положительная прогностическая ценность (как уже было отмечено, мы объединили заключения сканирования «высокий» и «средний» риск в положительный результат) для LSIL и HSIL составила 42,5 и 15%, отрицательная прогностическая ценность флуоресцентной спектроскопии (заключение – «низкий» риск) для LSIL и HSIL составила 100 и 83,3% соответственно (табл. 3).
Таким образом, флуоресцентная спектроскопия по методике LuViva по отношению к гистологическому исследованию в нашем исследовании обладала достаточной чувствительностью и высокой отрицательной прогностической ценностью, однако показала невысокую специфичность.
Мы проанализировали диагностическую ценность флуоресцентной спектроскопии LuViva по сравнению с цитологическим тестом в отношении SIL различной степени (ASC-US, LSIL, HSIL) в отдельности, а затем объединив их. Это позволило нам заключить, что положительная прогностическая ценность флуоресцентной спектроскопии для обнаружения цитологического заключения степени ≥ASC-US составляет 28,7%, отрицательная прогностическая ценность – 88,4% (табл. 4).
Таким образом, флуоресцентная спектроскопия LuViva обладает высокой отрицательной прогностической ценностью и чувствительностью в отношении SIL различной степени, что повышает ее диагностическую значимость в связи с таким преимуществом по сравнению с цитологическим исследованием, как возможность получения результата в момент исследования (в реальном времени) и безотлагательное выполнение более углубленного обследования, например, расширенной кольпоскопии и, по показаниям, биопсии шейки матки. По отношению к гистологическому методу у флуоресцентной спектроскопии достоверно выше чувствительность и отрицательная прогностическая ценность в сравнении с цитологическим методом, однако специфичность метода LuViva ниже.
В настоящее время с целью увеличения эффективности цервикального скрининга продолжается поиск новых неинвазивных методов диагностики. За последние годы появилось множество различных исследований, которые направлены на выявление предраковых изменений, повышение чувствительности цитологического исследования, обнаружения ВПЧ ВКР, но клиническое значение и алгоритмы применения всех этих методов, несомненно, требуют дальнейшего изучения и усовершенствования.
Безусловно, важное значение в скрининговых технологиях имеют диагностические характеристики применяемых тестов (чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная прогностическая ценность). Полученные нами данные показали, что диагностическая система LuViva обладает более высокой чувствительностью по сравнению с традиционным методом цервикального скрининга – жидкостной цитологией. Несомненно, требуются дальнейшие исследования с привлечением большего числа пациенток. Однако уже благодаря полученным нами результатам можно заключить, что неинвазивная методика флуоресцентной спектроскопии может выступать в роли сортировочного (triage) теста для пациенток с противоречивыми результатами цитологического исследования и ВПЧ-теста для безотлагательного выбора тактики ведения между немедленной кольпоскопией и наблюдением. Результаты проведенного исследования позволили нам получить патент на изобретение [17].
Заключение
Флуоресцентная спектроскопия обладает более высокой чувствительностью по сравнению с жидкостной цитологией. Неинвазивная методика флуоресцентной спектроскопии может выступать в роли сортировочного (triage) теста для пациенток с противоречивыми результатами цитологического исследования и ВПЧ-теста и определять выбор между немедленной кольпоскопией и динамическим наблюдением.
