Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2009 от 29.09.2011.
Проблема бесплодного брака была и остается весьма актуальной в наше время, вместе с тем изменилась структура бесплодия. Если 20 лет назад мужской фактор составлял примерно 30%, то в настоящее время на его долю приходится уже 50% случаев [1–3]. На долю генетических факторов мужского бесплодия приходится в среднем около 10% случаев [3]. Частота встречаемости генетических аномалий среди пациентов с нарушением репродуктивной функции (НРФ) коррелирует с тяжестью репродуктивной патологии. Так, этот показатель увеличивается до 20% и более при тяжелых формах бесплодия у мужчин [4]. D. Li и соавт. при обследовании 4659 мужчин с бесплодием выявили хромосомные нарушения в 8,8% случаев [5]; при обследовании 10 202 фенотипически нормальных фертильных мужчин хромосомные нарушения выявлены в 0,4% случаев [6].
Кроме хромосомных нарушений одной из главных генетических причин мужского бесплодия, сопряженного с тяжелыми формами патозооспермии, является делеция AZF локуса хромосомы Y [7–9]. Известно, что хромосома Y необходима для детерминации пола и развития половых клеток [10]. В 1976 г. L. Tiepolo и O. Zuffardi при обследовании 6 мужчин с азооспермией выявили делецию дистальной части длинного плеча хромосомы Y. Авторы впервые предположили связь между делециями хромосомы Y и мужским бесплодием. На основании этого было постулировано, что существует, по крайней мере, один генетический фактор (AZF – Azoospermia Factor – фактор азооспермии), расположенный в длинном плече хромосомы Y (Yq11), – AZF локус, который контролирует сперматогенез [11].
В настоящее время в AZF локусе хромосомы Y различают три неперекрывающиеся области – AZFa субрегион, расположенный в проксимальной части длинного плеча хромосомы Y, AZFb субрегион, расположенный в промежуточной части, и AZFс субрегион, расположенный в дистальной части длинного плеча хромосомы Y [12]. Кроме того, некоторые исследователи предложили выделить четвертый субрегион – AZFd, расположенный в проксимальной части AZFc субрегиона [13]. Все субрегионы содержат гены или семейства генов, участвующие в сперматогенезе [3, 14]. Для AZF локуса хромосомы Y было картировано 300 STS-маркеров – последовательностей геномной ДНК, – которые могут быть амплифицированы при полимеразной цепной реакции (ПЦР) [14].
При делеции AZF локуса хромосомы Y может происходить потеря целого субрегиона, так называемая полная делеция, либо какого-либо участка субрегиона – частичная делеция [7]. В основе происхождения делеций AZF локуса хромосомы Y лежит механизм рекомбинации. Большинство микроделеций AZFа субрегиона возникают в следствие несбалансированной не аллель гомологичной рекомбинации между последовательностями эндогенного ретровируса HERV15 [15]. Делеции AZFb субрегиона возникают вследствие рекомбинации между палиндромом Р5 и проксимальным плечом палиндрома Р1 [16]. Делеции AZFb+с субрегионов возникают вследствие рекомбинации между палиндромом Р5 или Р4 и дистальным плечом палиндрома Р1 [16]. T. Kuroda-Kawaguchi и соавт. выявили, что рекомбинация между прямыми повторами b2 и b4 является причиной полной делеции AZFc субрегиона [17].
Многочисленные исследования показали, что наиболее часто микроделеции возникают в AZFc субрегионе, их доля составляет 65–70% от всех полных делеций AZF локуса хромосомы Y [9, 18–20]. Общая распространенность мутаций AZF локуса хромосомы Y среди мужчин с выраженны-ми отклонениями в показателях спермограммы широко варьируется в различных популяциях от 3,2 до 43,5% [4, 18–24]. В среднем этот показатель составляет 7,6% [25], при этом микроделеции значительно чаще выявляются при необструктивной азооспермии [4, 18, 19, 23].
Возможно, различия в распространенности данной мутации связаны с различными критериями отбора пациентов для проведения анализа на делеции AZF локуса хромосомы Y, размером исследуемой выборки, генетическими и эпигенетическими факторами, включая различные гаплогруппы хромосомы Y, этническую принадлежность, факторы окружающей среды и др. Также, по мнению многих авторов, на выявляемость мутаций в хромосоме Y влияет количество исследуемых STS точек в AZF локусе. Согласно рекомендациям European Academy of Andrology (EAA) и European Molecular Genetics Quality Network (EMQN), более 95% микроделеций AZF локуса хромосомы Y могут быть достоверно определены при использовании 6 базовых STS-маркеров – sY84 и sY86 для AZFa, sY127 и sY134 для AZFb, sY254 и sY255 для AZFc, а также исследовании генов SRY и ZFY/ZFX в качестве контролей [26]. Тем не менее некоторые исследователи считают, что использование бóльшего числа STS-маркеров для каждого субрегиона может быть более информативным для выявления мутаций в хромосоме Y [27]. Так, спектр используемых STS-маркеров для определения границ микроделеций в AZF локусе может быть расширен за счет sY1192, sY1291, sY615, sY 242, sY1125, sY1197, sY1206, sY142 и др.
В литературе описаны единичные случаи выявления микроделеций AZF локуса хромосомы Y у мужчин с нормозооспермией. По некоторым данным, примерно 2% фертильных мужчин могут быть носителями данной мутации с вовлечением некодирующих регионов [16]. Интересные данные были представлены в исследовании, проведенном G.G. Ceylan и соавт. Анализ на наличие мутаций в AZF локусе был проведен у 90 пациентов с первичным бесплодием – 60 пациентов с тяжелой патозооспермией и 30 пациентов с нормозооспермией, а также в группе фертильных доноров – 75 мужчин. Микроделеции в AZF локусе были выявлены в 15% случаев при тяжелой патозооспермии. В группе фертильных доноров не было выявлено ни одной делеции. Однако у 2 (6,7%) пациентов с нормозооспермией и первичным бесплодием были определены микроделеции AZFb субрегиона [18].
Гены каждого субрегиона AZF локуса хромосомы Y контролируют различные этапы сперматогенеза и могут нарушать процесс дифференцировки половых клеток на различных стадиях. Несмотря на то что существуют определенные корреляции между делециями определенного субрегиона хромосомы Y и степенью нарушения сперматогенеза, до сих пор четкая взаимосвязь генотипа и фенотипических проявлений не может быть определена, то есть проявления микроделеций субрегионов AZF локуса хромосомы Y вариабельны [19].
По данным различных исследователей, микроделеции AZFa субрегиона могут приводить к тяжелым количественным нарушениям сперматогенеза, вплоть до азооспермии и синдрома «только клетки Сертоли». Микроделеции AZFb субрегиона могут приводить к азооспермии или нарушению сперматогенеза на стадии пахитены на этапе созревания сперматоцитов. Микроделеции AZFc субрегиона хромосомы Y характеризуются нарушением сперматогенеза на стадии сперматид и имеют различный фенотип – от олигозооспермии до азооспермии. При данной мутации сперматозоиды могут быть обнаружены либо в эякуляте, либо получены при проведении аспирационной биопсии ткани яичка (TESE – testicular sperm extraction) [19]. Некоторые авторы отмечают, что микроделеции AZFd могут выявляться при легкой степени олигозооспермии или тератозооспермии [13]. Кроме того, описаны случаи выявления микроделеций AZFd при выраженной олигозооспермии и азооспермии с наличием или отсутствием сперматозоидов в ткани яичка [27]. При наличии полной делеции AZF локуса (a+b+c) чаще отмечается азооспермия с развитием синдрома «только клетки Сертоли» [19].
В настоящее время большое внимание уделяется изучению не только полных, но и частичных делеций AZF локуса хромосомы Y. Так же как и полные, частичные делеции длинного плеча хромосомы Y характеризуются различной степенью влияния на сперматогенез и фертильность – от азооспермии до нормозооспермии. Среди частичных микроделеций AZFс субрегиона выделяют gr/gr, b1/b3, b2/b3 делеции и другие [3].
Несмотря на вариабельность фенотипических проявлений нарушений сперматогенеза, частичные b2/b3 делеции выявляются только у пациентов с выраженной патозооспермией [28, 29]. В исследовании A. Eloualid и соавт. была выявлена связь между этими делециями и нарушением сперматогенеза (р<0,0318). В связи с этим авторы рекомендуют проводить скрининг на эти делеции у пациентов с патозооспермией [29]. Что касается частичных gr/gr делеций, то они встречаются практически с одинаковой частотой как при выраженной патозооспермии, так и при нормозооспермии. Вследствие этого ряд исследователей считают, что эти микроделеции не оказывают негативного влияния на сперматогенез [28, 29].
В настоящее время благодаря разработке и широкому внедрению в клиническую практику таких микроманипуляционных методик, как TESE и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит (ИКСИ), мужчины с тяжелой патозооспермией и генетическими нарушениями могут иметь собственных детей. Однако не стоит забывать, что мутации, имеющиеся в генотипе родителей, могут передаваться будущему потомству через гаметы [19].
Данные многочисленных исследований указывают на возможность вертикальной передачи мутации AZF локуса хромосомы Y от отца сыну, что впоследствии может привести к НРФ у потомства. Исследования сыновей от отцов с делециями AZF локуса показали, что размер наследуемой делеции может быть идентичен отцовскому, либо быть бóльшим. Следовательно, можно предположить, что НРФ в последующем у сыновей будут выражены в бóльшей степени, чем у отцов [19, 30, 31].
В литературе представлены противоречивые данные относительно влияния самой процедуры ИКСИ на возникновение мутаций de novo хромосомы Y. Ряд авторов отмечают, что у мальчиков, рожденных от отцов с нарушениями сперматогенеза, обнаруживаются мутации de novo в AZF локусе хромосомы Y. Эти делеции могут быть следствием ошибки мейоза [19, 31]. Некоторые авторы связывают возникновение у потомства de novo делеций в AZF локусе с мозаицизмом этой мутации у отцов [31].
Ряд исследователей считают, что ИКСИ не является фактором риска для возникновения de novo делеций AZF локуса хромосомы Y [32]. Однако данные других исследователей демонстрируют, что частота de novo делеций хромосомы Y выше у потомства мужского пола, полученного при применении ИКСИ, даже при отсутствии нарушений сперматогенеза и генотипа у отцов [33].
FISH-анализ ядер сперматозоидов мужчин с микроделецией AZFc выявил увеличение уровня сперматозоидов с нуллисомией и дисомией гоносом. С этой точки зрения некоторые авторы рассматривают микроделецию хромосомы Y как премутацию с возможностью последующей полной потери хромосомы Y, что повышает риск рождения ребенка с кариотипом 45, Х0 (синдром Шерешевского-Тернера). Повышенный уровень сперматозоидов с дисомией гоносом свидетельствует о том, что наличие микроделеций хромосомы Y может влиять на процесс мейоза, в результате чего происходит нерасхождение бивалентов XY, что повышает риск рождения ребенка с кариотипом 47, XXY (синдром Клайнфелтера) [34]. Это подтверждают данные C. Ceylan и соавт., выявившими высокую частоту мутаций AZF локу-са хромосомы Y (35%) у пациентов с синдромом Клайнфелтера [35].
Крометого,P.C.PatsalisиF.Alvarez-Navaисоавт. при обследовании пациентов-мозаиков с кариотипом 45,Х0/46,ХY выявили высокий уровень делеций хромосомы Y, достигающий 47%. При анализе ДНК отцов этих мужчин делеции не были выявлены, что свидетельствует о том, что либо эти делеции возникли de novo, либо у отцов отмечается мозаицизм данной мутации. Выявленная корреляция между мозаицизмом половых хромосом и делециями хромосомы Y свидетельствует в пользу гипотезы об общей нестабильности хромосомы Y с мутацией в AZF локусе. То есть начальная спонтанная потеря последовательностей хромосомы Y в AZF локусе является критической и приводит к общей ее нестабильности, а затем – к потере всей хромосомы Y во время мейоза [36, 37].
Кроме того, ряд исследователей считают, что микроделеции хромосомы Y вызывают повреждение нормальных синапсисов не только половых хромосом, но и аутосом в мейозе, что проявляется в последующем анеуплоидией аутосом и может привести к рождению больного ребенка [38–40]. Таким образом, при проведении программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у данной группы пациентов нельзя не учитывать особенности их генотипов.
В настоящее время в литературе данные относительно исходов программ ВРТ у супружеских пар с микроделециями AZF локуса хромосомы Y представлены на малых выборках, освещены недостаточно полно и противоречивы. В исследовании R.T.J. Van Gold и соавт. проводился сравнительный анализ исходов 19 циклов ЭКО/ИКСИ с использованием сперматозоидов, полученных из эякулята 8 пациентов с выраженной олигозооспермией и делецией AZFc субрегиона. Уровни оплодотворения были статистически достоверно ниже в этой группе пациентов по сравнению с контролем – пациенты с патозооспермией, но без делеций (239 циклов ЭКО/ИКСИ у 107 супружеских пар), и составили 55 и 71% соответственно. Также в группе пациентов с делециями AZF локуса отмечалось худшее качество эмбрионов (более 10% фрагментации) (p<0,001). Хотя уровни имплантации, наступления клинической беременности на перенос эмбрионов и живорождения при этом тоже были снижены, они не достигли статистической значимости вследствие наличия малой выборки. Так как среди родившихся детей были только девочки, авторы предположили, что сперматозоиды, несущие хромосому Y с мутацией AZF локуса, имеют более низкий шанс оплодотворения и последующего нормального эмбрионального развития [41].
В других исследованиях отмечалось снижение уровня оплодотворения, процента выживаемости эмбрионов до стадии бластоцисты, уровней имплантации, клинической беременности у супружеских пар с делецией хромосомы Y, но эти различия не были статистически достоверны. Авторы пришли к выводу, что наличие делеции хромосомы Y не оказывает неблагоприятного воздействия на оплодотворение и наступление беременности при условии наличия сперматозоидов, полученных из эякулята или с помощью TESA и пригодных для ИКСИ [22, 42].
В исследовании P.E. Kihaile и соавт. проводился анализ исходов 8 циклов ЭКО/ИКСИ у пациентов с тяжелой патозооспермией и делецией AZFc субрегиона. Выявлено, что показатели оплодотворения (59,3%), дробления (87,5%), выживаемости эмбрионов до стадии бластоцисты (45,3%), качество эмбрионов и процент наступления клинической беременности (37,5%) у данной группы пациентов сопоставимы с таковыми при обычном ЭКО [43]. Аналогичные данные были получены и другими исследователями [44].
K. Stouffs и соавт. исследовали исходы 40 циклов ЭКО/ИКСИ у 16 супружеских пар с делециями AZFс. Средний уровень оплодотворения составил 55%, что соответствовало данным ранее проведенных исследований. Однако у пациентов, у которых для ИКСИ были использованы сперматозоиды, полученные из эякулята, уровень оплодотворения был статистически достоверно выше, чем у пациентов, у которых сперматозоиды были получены с применением TESE – 69 и 47% соответственно (p<0,0001). Уровни клинической беременности на перенос эмбрионов и на цикл составили 21,9 и 17,5% соответственно. Таким образом, наиболее вероятно, что непосредственное влияние на исходы программы ЭКО/ИКСИ у пациентов с делецией AZF локуса хромосомы Y оказывает не сама мутация, а способ получения сперматозоидов для ИКСИ – TESE или из эякулята [25].
В 2010 г. L. Gambera и соавт. впервые сообщили об успешной беременности тройней после переноса женщине в полость матки 3 криоконсервированных эмбрионов от мужчины с азооспермией и полной делецией AZFc субрегиона. Важно подчеркнуть, что сперматозоиды для оплодотворения были получены с помощью TESE. Все 3 полученных эмбриона были «хорошего» качества. В результате родились 3 соматически здоровых ребенка – 1 девочка и 2 мальчика, которые унаследовали от отца делецию AZFc субрегиона. Таким образом, авторы отмечают, что даже полная делеция AZFс не оказывает прямого негативного воздействия на исходы программы ЭКО/ИКСИ. У таких супружеских пар возможно получить здоровое потомство даже в программе переноса криоконсервированных эмбрионов [45]. Ряд исследований посвящены изучению влияния мутации AZF локуса хромосомы Y на соматическое здоровье мальчиков, зачатых с помощью программы ЭКО/ИКСИ. Результаты свидетельствуют о том, что микроделеции хромосомы Y не оказывают влияния на психологическое или физиологическое развитие детей-носителей данных мутаций [34, 46, 47].
На сегодняшний день медико-генетическое консультирование и преимплантационная диагностика (ПД) эмбрионов в рамках программы ВРТ позволяет супружеским парам с генными нарушениями проводить профилактику наследования мутаций потомством. При наличии делеций AZF локуса хромосомы Y у мужчин при проведении ПД эмбрионов в рамках программы ЭКО/ИКСИ отбираются эмбрионы женского пола для переноса их в полость матки супруги. Такая профилактическая мера способствует предупреждению рождения генетически больного ребенка, снижает риск выкидышей и тем самым повышает эффективность программы ЭКО/ИКСИ [34, 25].
В исследовании K. Stouffs и соавт. впервые отражено отношение супружеских пар с делецией AZF локуса у мужей к проведению ПД эмбрионов с селекцией эмбрионов женского пола с целью профилактики передачи данной мутации потомству. Из 14 проконсультированных пар 7 выбрали ПД с селекцией эмбрионов женского пола. Двум супружеским парам проводили ПД со скринингом на анеуплоидии хромосом 13, 16, 18, 21, 22, Х, Y; 3 парам – ПД с селекцией пола; у 2 пар не было получено пригодных для проведения ПД эмбрионов. Из 39 доступных для диагностики эмбрионов были определены 10 девочек и 13 мальчиков, пригодных для переноса в матку. Среди оставшихся 16 (41%) эмбрионов часть не имели ядра, у части были выявлены различные анеуплоидии исследуемых хромосом [25].
Учитывая наличие интерхромосомного эффекта, стали исследовать анеуплоидии соматических хромосом в сперматозоидах пациентов с мутацией AZF локуса хромосомы Y.E. Mateu и соавт. проведен сравнительный анализ данных FISH-исследования ядер сперматозоидов по хромосомам 13, 18, 21, Х и Y в группах пациентов с делецией AZFс субрегиона хромосомы Y, с патозооспермией, но без делеции и в группе пациентов с нормозооспермией, но без делеции. Выявлено значительное повышение числа сперматозоидов с диплоидией и дисомией по всем анализируемым хромосомам у пациентов с делецией хромосомы Y по сравнению с пациентами с нормозооспермией, в то время как в группе пациентов с патозооспермией, но без делеции был повышен процент сперматозоидов только с дисомией по гоносомам [44]. В противоположность данным предыдущих исследований [19] у пациентов с микроделециями отмечалось нормальное соотношение между сперматозоидами, несущими хромосомы Х и Y [44].
Результаты ПД эмбрионов супружеских пар с мутацией AZF локуса хромосомы Y и высоким уровнем анеуплоидии в сперматозоидах демонстрируют высокую частоту хромосомной патологии в эмбрионах (83,3%, p<0,05), особенно анеуплоидии гоносом. Среди различных хромосомных нарушений отмечалось значительное увеличение процента эмбрионов с моносомией хромосомы Х (33,3%, p<0,05) [44].
Противоречивы данные относительно связи между наличием мутации AZF локуса хромосомы Y и самопроизвольным прерыванием беременности. Одни авторы выявили высокую распространенность микроделеций хромосомы Y среди пациентов, жены которых имели выкидыши в анамнезе (16%), по сравнению с пациентами, имеющими детей, без отягощенного акушерского анамнеза (p<0,05%) и предположили, что данная мутация может быть возможным этиологическим фактором спонтанного прерывания беременности [48]. В противовес этим данным, другие авторы при исследовании ворсин хориона абортусов мужского пола и образцов крови отцов не выявили взаимосвязи делеций AZF локуса хромосомы Y и самопроизвольного прерывания беременности [49].
T.K. Wettasinghe и соавт. исследовали на популяции Шри-Ланки распространенность микроделеций хромосомы Y среди пациентов с выкидышами у жен в анамнезе. При анализе ДНК крови этих пациентов не было выявлено ни полных, ни частичных делеций в AZF локусе [50]. Схожие данные были получены группой испанских авторов на другой популяции [51].
Подводя итог вышесказанному, необходимо подчеркнуть, что идентификация делеций AZF локуса хромосомы Y имеет важную диагностическую и прогностическую ценность в отношении возможности получения сперматозоидов при биопсии яичка в случае азооспермии, а также в отношении репродуктивного прогноза. В ходе проведения медико-генетического консультирования супружеская пара с выявленной у мужа мутацией AZF локуса должна быть информирована о локализации и характере микроделеции, возможности передачи данной мутации потомству мужского пола, рисках рождения ребенка с различной хромосомной патологией и методах их профилактики. Данной группе пациентов следует рекомендовать проведение ПД эмбрионов в рамках программы ЭКО/ИКСИ, которая позволяет одновременно проводить селекцию пола и хромосомной патологии.
При выявлении мутации AZF локуса у мальчиков, необходимо рекомендовать родителям проведение превентивной криоконсервации эякулята сыновей при достижении ими совершеннолетия.
