Проблема бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) является одной из наиболее актуальных проблем акушерства и гинекологии. Бесплодие при НГЭ обусловлено многими факторами, в том числе спаечным процессом в малом тазу, дисфункцией овуляции, нарушением последовательных этапов фолликуло- и оогенеза, негативным влиянием на процессы оплодотворения и имплантацию эмбриона [1–8].
Одним из основных факторов успешного лечения бесплодия методом ЭКО является выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом [9].
Критерии морфологической оценки эмбрионов, применяемые в настоящее время, недостаточно эффективны для отбора эмбрионов, что является одной из основных причин низкой частоты наступления беременности. В связи с этим необходимы новые инструменты отбора для увеличения шансов успеха программы ЭКО при переносе одного эмбриона.
Даже несмотря на существование множества современных методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), таких как преимплантационное генетическое тестирование, которое позволяет провести анализ полного хромосомного набора [10], частота наступления беременности не превышает 50%, даже при наличии нормальных ультразвуковых параметров прегравидарного эндометрия и эуплоидного хромосомного набора переносимого эмбриона [11]. Из этого следует, что есть необходимость в совершенствовании современных подходов для обеспечения понимания биологических процессов, лежащих в основе неудач имплантации эуплоидных эмбрионов [12].
В течение последних десятилетий были изучены новые неинвазивные методики селективного отбора эмбрионов, которые основаны на анализе компонентов фолликулярной жидкости (ФЖ) и питательных сред, в которых культивируются эмбрионы [13].
С каждым годом исследования, направленные на изучение состава ФЖ и сред культивирования, становятся все более актуальными, и их количество постепенно увеличивается [14]. При помощи высокочувствительных аналитических методов точного обнаружения специфических молекул в ряде работ было проанализировано содержание различных гормонов, таких как антимюллеров гормон, прогестерон, факторов роста, свободных форм кислорода и других биомаркеров, которые, по мнению исследователей, могут играть роль в выявлении взаимосвязи между морфологией эмбриона, его успешной имплантацией и дальнейшим развитием беременности [15–21].
ФЖ представляет собой микросреду, необходимую для созревания фолликула и развития ооцита, и является доступным в получении материалом для исследования.
Еще в 80-е годы XX в. в ряде исследований была выявлена взаимосвязь между составом ФЖ, качеством ооцита и успешным исходом программ ВРТ. В то же время Lobo R.A. et al. не выявили значимых различий в уровнях андрогенов ФЖ между зрелыми и незрелыми фолликулами [22]. Botero-Ruiz W.С. et al. обнаружили, что более высокие уровни эстрадиола в ФЖ коррелируют с успешным оплодотворением и наступлением беременности [23].
В 2000 г. в работе Garrido N. et al. сообщалось, что состав ФЖ при наличии у пациентки подтвержденного диагноза НГЭ отличается от состава ФЖ женщин без данной патологии, что может приводить к снижению качества ооцитов, полученных во время трансвагинальной пункции яичников в программе ЭКО. Были измерены концентрации интерлейкинов IL-1, IL-6 и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в ФЖ. Концентрации IL-6 в ФЖ были выше в естественных циклах у женщин с эндометриозом, в то время как отмечалось их значительное снижение в стимулированных циклах в программах ЭКО. Концентрации IL-1 не различались в естественных и стимулированных циклах. VEGF накапливался в более низких концентрациях в ФЖ пациенток с НГЭ как в естественных, так и в стимулированных циклах в сравнении с группой контроля без эндометриоза. Эти наблюдения показывают, что фолликулярная среда у пациенток с НГЭ имеет свои особенности, и предполагают, что бесплодие у женщин с данной патологией может быть связано с изменениями в ооците, которые, в свою очередь, приводят к появлению эмбрионов более низкого качества, со сниженной способностью к имплантации [13].
В течение следующего десятилетия многие группы исследователей в своих работах также пытались выявить различия метаболомного профиля ФЖ у пациенток с НГЭ, используя совершенствующиеся методики, включающие в себя различные виды масс-спектрометрии.
Так, изучение протеомного профиля ФЖ у пациенток с НГЭ методом MudPIT (multidimensiol protein identification technology) в работе Edson Guimarães Lo Turco et al. выявило не менее 64 дифференциально отличающихся белков в ФЖ пациенток с эндометриозом и без данной патологии. Эти белки могут иметь отношение к патофизиологии НГЭ и приводить к нарушениям имплантации эмбриона [23, 24].
В большинстве протеомных исследований используется жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для идентификации и количественного определения пептидов, образующихся при протеолизе биологического образца.
Cordeiro F.B. et al. в 2015 г. опубликовали данные исследования, в котором выявили различия в липидных профилях ФЖ у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и с подтвержденным лапароскопически диагнозом НГЭ с помощью тандемной масс-спектрометрии с ионизацией в электроспрее (ESI-MS/MS). Это исследование позволило выдвинуть теорию об участии обнаруженных липидов в механизмах развития эндометриоза в яичнике. Таким образом, метаболомный подход в идентификации липидов может быть полезен для выявления потенциальных биомаркеров успешной имплантации [25].
В 2016 г. Da Broi M.G. et al., анализируя состав ФЖ, показали, что оксидативный стресс может быть причиной бесплодия у женщин с НГЭ. Результаты показали более высокие концентрации антиоксидантов глутатиона и супероксиддисмутазы в сыворотке, более низкие концентрации суммарного содержания антиоксидантов в сыворотке, более высокие концентрации фолликулярного 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина (8OHdG; показатель окислительного повреждения ДНК) и более высокие уровни фолликулярного витамина Е у бесплодных женщин с эндометриозом по сравнению с пациентками без него. По мнению авторов, данные изменения в ФЖ, связанные с оксидативным стрессом, оказывают влияние на оогенез, при этом отмечаются удлинение фолликулярной фазы, уменьшение размеров доминантных фолликулов, активация апоптоза клеток кумулюса [28].
Тем не менее при существующих методах остается сложной задачей быстро, последовательно, точно и с высокой чувствительностью обнаруживать и количественно определять большие фракции протеомов в нескольких образцах. Поэтому был разработан метод SWATH-МS (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra) для полного качественного и количественного анализа проб на одной системе [26].
В мае 2018 г. группа ученых, в состав которой входил Zhengao Sun, ретроспективно проанализировала 44 образца ФЖ, полученных в циклах ЭКО для выявления влияния уровня прогестерона на качество ооцитов. Образцы ФЖ в день трансвагинальной пункции яичников были отобраны у 22 женщин с уровнем прогестерона >1,5 нг/мл – группа I и у 22 пациенток с уровнем прогестерона <1,5 нг/мл – группа II (контрольная). При изучении ФЖ был использован новый метод масс-спектрометрического анализа SWATH-МS. В ходе исследования было выявлено, что более высокий уровень прогестерона отражается на уровнях 5 ключевых метаболитов: 8-гидроксигуанозина, 4-гидроксиноненала, аденозинтрифосфата, эстрадиола и L-карнитина, что приводит к ухудшению качества ооцитов [27]. В июне 2018 г. эта же группа ученых представила результаты исследования метаболитов ФЖ пациенток с НГЭ методом SWATH-МS. Анализ выявил, что содержание некоторых метаболитов, включая фитосфингозин и лизофосфатидилхолин, было различным у пациенток с эндометриозом и в группе контроля женщин с бесплодием, обусловленным мужским фактором [28].
Среды культивирования эмбрионов различных стадий развития также являются уникальным объектом исследования, так как они несут в себе информацию о метаболической активности, энергетическом обмене и состоянии сигнальных систем эмбриона. Так, во многих исследованиях было показано, что оценка изменения углеводного состава отработанных культуральных сред может быть использована как дополнительный маркер для определения качества эмбриона и его потенциала к имплантации при морфологически высоком качестве эмбрионов [29–31].
В работе D’Souza F. et al. в 2016 г. был проведен анализ метаболитов в отработанной среде методом ЯМР-спектроскопии у эмбрионов мышей 3-х и 5-х суток развития и выявлена значительная связь между уровнями пирувата, лактата, глюкозы, пролина, лизина, аланина, валина, изолейцина и тимина и наличием генетических нарушений, вызванных индуцированным повреждением ДНК за счет воздействия на эмбрионы цисплатина. При этом обе группы эмбрионов были морфологически хорошего качества. Эмбрионы, несущие индуцированные повреждения ДНК, развивались нормально в течение первых 2 дней, после чего отмечалась задержка эмбрионального развития, что было определено по уровню потребления исследуемых показателей, которые были значительно выше, чем у эмбрионов контрольной группы, так как эмбрионы с задержкой развития перестали поглощать достаточное количество продуктов среды культивирования [30].
В 2017 г. турецкие ученые во главе с Еrcan Baştu проанализировали 31 образец культуральных сред эмбрионов, полученных после переноса эмбрионов в полость матки. У 15 пациентов наступила клиническая беременность, у 16 – не наступила. Клиническая беременность была предсказана с помощью рамановской спектроскопии у 93% (14 из 15) беременных пациенток и у 62,5% (10 из 16) небеременных женщин. Чувствительность комбинационного спектрального анализа сред культивирования составила 93%, а специфичность – 62,5% [32].
Iles R.K. et al. изучили 401 образец отработанных сред культивирования эмбрионов человека 5-х суток методом МАЛДИ-масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), полученных после переноса эмбриона в полость матки. Анализ дал уникальные спектры секретома для каждого эмбриона. В итоге в исследование были отобраны 136 образцов, использованных для построения прогностической модели на основании оценки выбранных областей массовых чисел (бинов) с целью прогнозирования исхода беременности. С помощью простого алгоритма, основанного на девяти массовых бинах в пределах области 2000–10 000 m/z, стало возможным идентифицировать образцы с наибольшей вероятностью наступления беременности (положительное прогностическое значение 82,9%, р=0,0018) [33].
В 2019 г. были опубликованы данные научного исследования Зориной И.М. и коллег, в ходе которого было выявлено, что изменение профилей метаболитов сред культивирования, а именно содержания L-фенилаланина, L-валина, L-пролина, аланилглутамина и фенилпирувата позволяет идентифицировать эмбрионы с высоким потенциалом к имплантации. Также критерием удачной имплантации служит уровень потребления глюкозы эуплоидными эмбрионами из питательной среды [34].
Исследования отработанных сред культивирования при наличии НГЭ пока не опубликованы в научных изданиях, что подтверждает необходимость работ в данном направлении.
Таким образом, можно сделать вывод, что дальнейшее изучение и оценка молекулярных составляющих ФЖ и отработанных сред культивирования у пациенток с НГЭ являются перспективным направлением в поиске маркеров успешной имплантации эмбриона с последующим развитием клинической беременности и рождением здорового ребенка для повышения эффективности лечения при использовании методов ВРТ.
