Неинвазивная диагностика задержки роста плода (ЗРП) и преэклампсии (ПЭ) с использованием определения метаболитов в моче представляет собой перспективный метод, который может помочь в раннем выявлении и мониторинге этих акушерских состояний.
ЗРП и ПЭ – это два грозных акушерских осложнения, которые могут оказать негативное воздействие на исход беременности и здоровье как матери, так и плода. Предикция и ранняя точная диагностика этих состояний имеют важное значение для предоставления своевременной медицинской помощи. Определение метаболитов в моче может предоставить ценную информацию для диагностики и мониторинга беременности [1].
Перспективными объектами для изучения современными аналитическими методами на сегодняшний день выступают метаболиты аминокислот, липидов, антиоксидантов и их промежуточных продуктов. Аминокислоты и липиды играют важную роль в развитии плода и метаболических процессах в организме. Некоторые исследования показывают, что изменения в профиле аминокислот могут быть связаны с ЗРП и ПЭ [2]. Например, повышенные уровни аминокислоты гомоцистеина и сниженные уровни аргинина могут быть ассоциированы с риском ПЭ [3], а изменения уровней липопротеинов различной плотности могут быть связаны с ЗРП [4]. Антиоксиданты играют важную роль в защите клеток от окислительного стресса. Изменения в антиоксидантных метаболитах могут свидетельствовать о нарушениях в организме и быть связанными с ПЭ [5].
Для разработки диагностики беременных женщин с ЗРП и ПЭ в ряде работ рассматривается метаболомный анализ мочи [6]. Сбор мочи – неинвазивная и относительно простая процедура, которая может проводиться регулярно в ходе беременности. В собранных образцах мочи изучают содержание различных метаболитов с использованием современных аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия. Результаты анализа метаболитов могут быть сопоставлены с нормальными референсными значениями, и выявленные изменения могут служить предупреждающими маркерами ЗРП и ПЭ. Раннее обнаружение и мониторинг ЗРП и ПЭ позволяют осуществить своевременное медицинское вмешательство и улучшить исходы беременности.
Изучение уровня полиаминов в моче также может быть важным аспектом при диагностике и мониторинге различных состояний, включая ЗРП и ПЭ. Полиамины – это небольшие органические молекулы, состоящие из насыщенных углеводородных цепей с несколькими аминогруппами. Такие полиамины, как спермин, спермидин и кадаверин, играют важную роль в клеточном метаболизме и могут быть связаны с различными физиологическими и патологическими процессами [7]. Определяемые уровни полиаминов в моче связаны с нарушением или физиологическим изменением их метаболизма. Исследования показывают, что уровни полиаминов могут быть изменены в условиях реализации системного воспалительного ответа и окислительного стресса [8], клеточного роста и деления и точно отражать нарушения в клеточных процессах, связанных с ЗРП и ПЭ. Поэтому изменения уровней полиаминов в моче могут служить потенциальными биомаркерами для диагностики и мониторинга ЗРП и ПЭ.
Дальнейшие исследования в этой области могут привести к разработке более точных и эффективных методов диагностики и лечения ЗРП и ПЭ, способствуя улучшению здоровья беременных женщин и плода.
Цель исследования: изучение особенностей профиля полиаминов в моче у беременных с ЗРП и ПЭ для выявления биомаркеров с прогностическим и диагностическим потенциалом.
Материалы и методы
В исследование были включены 73 беременные, которые поступили и были родоразрешены в ФБГУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России: группы ПЭ и ЗРП составили 22 и 30 пациенток c подтвержденными соответствующими диагнозами; контрольную группу составила 21 соматически здоровая женщина с беременностью без осложнений.
Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование соответствует требованиям Хельсинкской декларации, Международной конференции по гармонизации (ICF), Стандартов надлежащей клинической практики (GCP), ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» № 323-ФЗ от 21 ноября 2011 г. и было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Критериями включениями в исследование послужили: возраст беременных от 18 до 35 лет, одноплодная беременность на сроке от 24 до 40 недель, ранняя ПЭ и ЗРП. Критериями исключения были: резус- и AB0-изоиммунизации, хромосомные аномалии, генетические мутации и врожденные пороки развития у плода, наличие у матери тяжелой экстрагенитальной патологии, хронических заболеваний почек, миомы матки больших размеров, острых инфекционных заболеваний. Для анализа у женщин была собрана моча на различных сроках беременности.
Метод анализа полиаминов
Оптимизированная процедура приготовления образцов мочи для анализа содержания полиаминов включает следующие этапы: 400 мкл мочи поместить в микроцентрифужную пробирку вместимостью 2 мл; добавить 1000 мкл метанола; перемешивать 5 минут; центрифугировать 10 минут при 13000 g; отобрать 1200 мкл надосадочной жидкости в чистую микроцентрифужную пробирку вместимостью 2 мл; высушить в токе азота при температуре 50°C; добавить 600 мкл раствора дансил хлорида (10 мг/мл) в ацетонитрил-карбонатном буферном растворе pH=9,7 (50/50 об/об); перемешивать 1 минуту; центрифугировать 1 минуту при 13 000 g; термостатировать при 60°C в течение 90 минут; центрифугировать 1 минуту при 13 000 g; добавить 1000 мкл этилацетата; перемешивать 10 минут; центрифугировать 10 минут при 13 000 g; отобрать 1000 мкл верхнего слоя в чистую микроцентрифужную пробирку вместимостью 2 мл; добавить 1000 мкл этилацетата; перемешивать с помощью вортекса 10 минут; центрифугировать 10 минут при скорости 13,4 g; отобрать 1000 мкл верхнего слоя и соединить с предыдущим отбором; высушить в токе азота при температуре 50°C; добавить 200 мкл ацетонитрила; перемешивать 5 минут; центрифугировать 10 минут при 13 000 g; перенести 170 мкл в виалу со вставкой для дальнейшего анализа.
Анализ полиаминов проводили с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ЖХ-МС) на системе, состоящей из тройного квадрупольного масс-спектрометрического детектора ABSciex QTrap 5500 (ABSciex, Канада), оснащенного источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity (Agilent, США). Для разделения образца использовали колонку Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (50×3 мм, 1,8 мкм, Agilent, США). Для анализа органических кислот вводили 20 мкл образца и использовали в качестве элюента А 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде; элюент В – 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Скорость потока 650 мкл/мин с поддерживаемой температурой колонки 30°С. Состав подвижной фазы в ходе анализа изменялся следующим образом: 0–0,3 минуты – 20% В, до 5,3 минуты объемная доля элюента B повышалась до 95%, сохраняла значение до 8,3 минут и за 0,1 минуты возвращалось к значению 20%. Настройки масс-спектрометра были следующими: давление периферийного газа – 1,4 бар, давление газа-распылителя – 3,4 бар, температура источника – 500°C, напряжение на капилляре – 4500 В.
В данной работе проводили анализ следующих 9 полиаминов: путресцин, этилендиамин, 1,3-диаминопропан, кадаверин, 1,7-диаминогептан, 1,6-диаминогексан, N-ацетилпутресцин, N1-ацетилспермин, спермидин.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R [R Core Team (2018). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/] в RStudio [RStudio Team (2016). RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc., Boston, MA URL http://www.rstudio.com/].
Для описания количественных данных использовали медианы (Me) и квартили Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3). Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Для попарного сравнения значений в группах использовался тест Манна–Уитни, различия значений в группах принимались статистически значимыми при p<0,05. Если значение p было меньше 0,001, то p указывали в формате p<0,001. Корректировка значений статистической значимости при множественных сравнениях выполнялась посредством поправки Бонферрони.
Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ROC-кривой (AUC). Качество разработанных моделей определяли путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.
Результаты
В данное ретроспективное исследование по типу случай-контроль беременные включались по обращаемости, в зависимости от установленного диагноза ЗРП или ПЭ. Особенно следует подчеркнуть, что на момент сбора мочи все пациентки имели умеренную ПЭ со стабильными значениями артериального давления, незначительную протеинурию при нормальных показателях суточного диуреза и отсутствии нарушения фето-плацентарного кровотока и дистресса плода; ЗРП по данным фетометрии (3-й процентиль и менее) без допплерометрических признаков дистресса плода. У всех пациенток отсутствовала регулярная родовая деятельность или угроза преждевременных родов. На момент родоразрешения, которое в среднем происходило через 3 недели после забора мочи, треть пациенток имели диагноз тяжелой ПЭ, и более половины от всех имели критические нарушения плодово-плацентарного кровотока, что и послужило показанием к проведению экстренного оперативного родоразрешения путем операции кесарева сечения. У пациенток контрольной группы забор мочи проводился в сроки беременности, сопоставимые со сроками у пациенток с ПЭ и ЗРП. В последующем течение их беременности и родоразрешение были отслежены и не отягощены.
Возраст и вес пациенток с ПЭ были сопоставимы с группой контроля, так как старший репродуктивный возраст и ожирение могли стать серьезными конфаундерными факторами при оценке уровня полиаминов в моче в данной группе. Индекс массы тела (ИМТ) у беременных женщин из группы ЗРП был значимо ниже, чем у женщин контрольной группы и группы ПЭ (р=0,005 и р=0,0045 соответственно).
Результаты анализа клинических параметров исследуемых групп представлены в таблице 1.
Учитывая необходимость ускоренного родоразрешения по акушерским показаниям, в связи с реализацией декомпенсации ПЭ и ЗРП, срок родоразрешения для данных групп статистически значимо отличался от контрольной группы (р<0,001). Для случаев ПЭ и ЗРП средний вес новорожденных составил 2041,0 г и 1828,7 г.
Следует отметить, что оценка новорожденного по шкале Апгар в группе с ПЭ была значимо ниже на 1-й минуте жизни (р=0,04), тогда как в группе ЗРП – на 5-й минуте (р=0,05) по сравнению с группой контроля. Вероятно, это можно объяснить нарушением адаптации в раннем неонатальном периоде у новорожденных, пребывающих длительный период в условиях хронической гипоксии и отставания роста.
Анализ полиаминов мочи осуществляли с помощью ЖХ-МС.
На первом этапе работы была выполнена оценка концентрации полиаминов в моче в трех анализируемых группах и их межгрупповое сравнение. В моче беременных было выявлено 7 полиаминов: спермин, путресцин, этилендиамин, кадаверин, 1,7-диаминогептан, N-ацетилпутресцин, N1-ацетилспермин. При межгрупповом сравнении значимые отличия обнаружили для трех полиаминов: путресцина, 1,7-диаминогептана и N-ацетилпутресцина (рис. 1).
В зависимости от характера плацента-ассоциированного осложнения (ЗРП или ПЭ) концентрации полиаминов в моче носили разнонаправленные изменения относительно группы контроля. Путресцин и его кетоновая производная N-ацетилпутресцин в группах, представленных беременными с плацента-ассоциированными осложнениями, характеризуются значимыми отличиями от группы контроля. Уровень путресцина повышен при ПЭ и ЗРП с наибольшей концентрацией при ПЭ, тогда как уровень аN-ацетилпутресцина понижен в группах с патологией по сравнению с нормой, но при ПЭ его концентрация выше, чем при ЗРП. В случае 1,7-диаминогептана была получена другая закономерность: его концентрация ниже, чем в группе контроля, при ПЭ и выше – при ЗРП (р=0,04) (рис. 1, табл. 2).
На втором этапе анализа полученных данных на основании концентраций полиаминов в моче были разработаны модели логистической регрессии для классификации пациенток, принадлежащих к группам ПЭ и ЗРП, относительно контрольной группы, а также выполнены ROC-кривые этих моделей.
Для классификации пациенток по их принадлежности к контрольной группе или группе ПЭ было разработано 4 модели, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. Лучшие показатели получены для модели, построенной на концентрациях спермина, этилендиамина, 1,7-диаминогептана, N-ацетилпутресцина, с чувствительностью 1 (1; 1), специфичностью 0,9 (0,7; 1), площадь под кривой AUC=0,94 (рис. 2, табл. 3).
Для классификации пациенток между контрольной группой и группой ЗРП также было разработано 4 модели, которые обладали максимально высокой чувствительностью и специфичностью 1 (1; 1).
где c, k1, k2, k3, k4 – коэффициенты логистической регрессии; PA1, PA2, PA3, PA4 – уровни полиаминов; p – зависимая переменная.
В качестве независимых переменных в этих моделях выступали следующие полиамины: этилендиамин, 1,7-диаминогептан, N-ацетилпутресцин; спермин, этилендиамин, 1,7-диаминогептан, N-ацетилпутресцин; путресцин, этилендиамин, 1,7-диаминогептан, N-ацетилпутресцин; этилендиамин, кадаверин, 1,7-диаминогептан, N-ацетилпутресцин. Эти модели характеризуются чувствительностью и специфичностью 1 (1; 1), площадь под кривой AUC=1 при пороговом значении 0,5 (рис. 3, табл. 3).
Учитывая обнадеживающие результаты анализа данных по концентрациям полиаминов в моче для перспективы использования полиаминов в неинвазивном прогнозировании ПЭ и ЗРП, на третьем этапе работы нами был выполнен анализ концентраций полиаминов в изолированных моделях прогноза плацента-ассоциированных осложнений. Было получено модели логистической регрессии, разработанные на основании концентраций полиаминов в моче для классификации пациенток, принадлежащих к группе ПЭ или ЗРП. Все 4 модели обладают максимально высокой чувствительностью 1 (1; 1) и специфичностью 1 (1; 1), при площади под кривой AUC равной 1 и пороговом значении 0,5 (рис. 4, табл. 4).
Обсуждение
Медицинское применение полиаминов в диагностике заболеваний представляет собой область активных исследований, и хотя она все еще находится в стадии развития, уже существует несколько направлений, в которых полиамины могут быть полезными.
Диагностика рака: уровень полиаминов в тканях и биологических жидкостях может быть аномально высоким в раковых опухолях [9]. Поэтому исследования пытаются использовать полиамины как биомаркеры для диагностики рака. Измерение уровней полиаминов в биологических образцах может помочь выявить наличие рака и определить его стадию [10].
Нейродегенеративные заболевания: исследования также обращают внимание на связь между полиаминами и нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Изменения уровней полиаминов в нервной ткани могут быть связаны с патологическими процессами, происходящими при этих заболеваниях [11]. Это открывает новые возможности для разработки диагностических методов и мониторинга прогрессии болезни.
Иммунодиагностика: уровни полиаминов могут быть связаны с конкретными патологическими процессами и использоваться в качестве биомаркеров для диагностики как инфекционных болезней, так и аутоиммунных расстройств [12].
Полиамины представляют собой группу молекул, которые играют важную роль в различных аспектах биологии и медицины. Их биологическое значение охватывает регуляцию роста и развития клеток, участие в синтезе белков и нуклеиновых кислот, антитоксическое действие и регуляцию генной экспрессии [13].
Медицинское применение полиаминов в диагностике заболеваний представляет большой интерес, поскольку они могут служить важными биомаркерами для различных патологических состояний. В контексте акушерства они могут быть связаны с различными аспектами беременности и родов. Изучение влияния полиаминов на развитие плода и плаценты может быть важным для понимания молекулярных процессов во время беременности. Полиамины могут быть связаны с клеточным ростом и дифференциацией [14], которые необходимы для развития органов и систем плода.
Полученные нами данные демонстрируют значимую связь изменения уровня полиаминов в моче и плацента-ассоциированных осложнений беременности. Концентрация полиаминов в моче носила разнонаправленный характер изменений в зависимости от акушерского осложнения (ЗРП или ПЭ). Для таких полиаминов, как спермин, путресцин и кадаверин, наблюдалось повышение концентрации в группах, представленных беременными с плацента-ассоциированными осложнениями, с наибольшей концентрацией при ПЭ для всех трех полиаминов. Для путресцина данное повышение было статистически значимым (р=0,05). Для этилендиамина и N-ацетилпутресцина наблюдалось снижение концентрации в группах патологий с минимальными значениями при ЗРП. Для 1,7-диаминогептана была получена другая закономерность с повышением концентрации при ЗРП, на фоне снижения при ПЭ, что значимо отличало данные концентрации от группы контроля (р=0.04). Особый интерес вызывает то, что данные изменения были зафиксированы при начальных клинических проявлениях акушерских синдромов. Высока вероятность возможного использования полиаминов для прогноза тяжести ранней ПЭ и ЗРП и обоснования сроков родоразрешения. ПЭ и ЗРП являются отдельными заболеваниями, которые, как установлено на сегодняшний день, имеют общий патогенез. В обоих случаях доминирующими симптомами являются нарушения ангиогенеза и генерализованное повреждение эндотелия с сопутствующим воспалением. Исследование Kwiatkowski S. et al. показало, что более высокие значения маркеров нарушения ангиогенеза, повреждения эндотелия и маркеров воспаления как в группах ПЭ, так и ЗРП позволяют предположить наличие общих нарушений в развитии этих патологий. Корреляции между маркерами нарушения ангиогенеза и маркерами повреждения эндотелия свидетельствуют в пользу взаимной связи этих двух процессов в развитии патологий, развивающихся на фоне ишемии плаценты. Полученные результаты подтверждают, что профили поражения одинаковы у пациентов с тромбоэмболией легочной артерии и ЗРП, что может быть использовано при разработке общих диагностических критериев [15]. Учитывая описанные в литературе изменения уровней полиаминов при ишемических и геморрагических поражениях головного мозга [16], их связи с поражением сердечно-сосудистой системы и почек [17], очень высока вероятность оценки степени поражения нервной ткани плода и беременной при ЗРП и ПЭ путем измерения уровня полиаминов в динамике. В экспериментальной работе 2023 г. Dasdelen D. et al. стремились изучить влияние ишемии-реперфузии (ИР) головного мозга путем оценки ряда ферментов печени, свободных радикалов, цитокинов, окислительно поврежденной ДНК, спермидин/спермин-N-1-ацетилтрансферазы (SSAT). Эксперимент на крысах показал, что ИР головного мозга вызывает воспалительные, окислительные повреждения, увеличение уровней нуклеарного фактора-κB, интерлейкина-6 и повреждение ДНК в образцах печени, а добавление путресцина через зонд уменьшает повреждение печени, проявляя противовоспалительное и антиоксидантное действие [16]. Таким образом, значимое увеличение концентрации путресцина в моче беременных с плацента-ассоциированными осложнениями, с максимальным подъемом при ПЭ, может быть вызвано физиологической компенсацией процессов воспаления и окислительных повреждений. При ЗРП мы отметили значимое повышение уровня 1,7-диаминогептана. Группа китайских исследователей в 2002 г. описала необычную аминокислоту гипузин [непсилон-(4-амино-2-гидроксибутил)лизин], которая образуется посттрансляционно в одном клеточном белке, эукариотическом факторе инициации трансляции 5А (eIF5A), под действием дезоксигипузинсинтазы и дезоксигипузингидроксилазы [18]. Хотя eIF5A и его гипузиновая модификация необходимы для жизнеспособности эукариотических клеток, истинная физиологическая функция eIF5A пока неизвестна. Авторы исследовали влияние N1-гуанил-1,7-диаминогептана (GC7), мощного ингибитора дезоксигипузинсинтазы, на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз эндотелиальных клеток. При обработке эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) GC7 наблюдалось дозозависимое ингибирование образования гипузина и клеточной пролиферации. GC7 в концентрации 10 мкМ вызывал практически полное ингибирование клеточного синтеза гипузина и приводил к цитостазу HUVEC. Предварительная обработка HUVEC GC7 до 50 мкМ в течение 4 дней мало влияла на прикрепление и дифференцировку этих клеток на матри-геле и не вызывала индукции апоптоза. Вместо этого предварительная обработка GC7 (96 ч при 5–50 мкМ) вызывала защитные эффекты против апоптотической гибели HUVEC, вызванной сывороточным голоданием. Эти результаты позволяют предположить, что eIF-5A может участвовать в экспрессии белков, необходимых для апоптоза эндотелиальных клеток, а также белков, необходимых для клеточной пролиферации. Данное наблюдение подтверждает важность нашего наблюдения о связи повышения концентрации 1,7-диаминогептана в моче при ЗРП, что может косвенно указывать на дозозависимое ингибирование клеточной пролиферации, быть биомаркером ЗРП и увеличиваться в зависимости от нарастания тяжести состояния плода.
Большой интерес представляет разработка методов диагностики и мониторинга уровня полиаминов у беременных женщин, которые могут служить инструментами для предсказания риска акушерских синдромов. Продемонстрированный нами анализ роли полиаминов в группах с изолированными патологиями для прогноза плацента-ассоциированных осложнений с разработкой моделей логистической регрессии, обладающих максимально высокой чувствительностью 1 (1; 1) и специфичностью 1 (1; 1), при площади под кривой AUC,, и пороговом значении 0,5, дает обнадеживающие перспективы дальнейшего их применения после проведения углубленной валидации и контроля в нескольких временных точках.
Заключение
Изучение роли полиаминов в акушерстве и их потенциала в диагностике и предикции акушерских синдромов является важной областью исследований, которая может привести к разработке новых методов обследования и лечения беременных женщин, а также улучшить заботу о здоровье матери и ребенка в период беременности.
