Прогнозирование преждевременных родов путем комбинированного определения цитокинов и внеклеточной ДНК

Несмотря на сохраняющуюся высокую частоту преждевременных родов (ПР), до настоящего времени нет единой концепции этиологии данного осложнения беременности. Ряд исследователей уделяет внимание изучению роли провоспалительных цитокинов в активации системного воспалительного ответа, и как следствие, в развитии родовой деятельности. Так, например, показано, что интерлейкин (IL)-8, активирующий миграцию нейтрофилов и высвобождение протеиназ может играть ключевую роль в развитии ПР [1–5]. Известно, что ПР, не ассоциированные с инфекцией, коррелируют с повышением уровня в плазме крови IL-8, а также IL-1, IL-6. Вместе с тем повышенные концентрации фактора некроза опухоли (TNF)α, IL-1, IL-6 были выявлены при ПР, которые были сопряжены с инфекцией [6, 7]. Кроме того, исследование амниотической жидкости также выявило повышение IL-6 при ПР при наличии внутриутробной инфекции [8, 9]. В настоящее время появились новые данные о том, что общая внеклеточная ДНК (овДНК) может индуцировать воспалительный ответ, который ассоциирован с ПР. В работах S. Illanes и соавт. [10] и M.S. Quezada [11] продемонстрировано, что циркулирующая плодовая внеклеточная ДНК (пвДНК) вызывает воспалительную реакцию, которая приводит к развитию спонтанной родовой деятельности. При этом наблюдалась активация Толл-подобных рецепторов-9 (TLR-9) и повышение уровня IL-6. В литературе представлено значительное количество исследований, указывающих на связь между высоким уровнем пвДНК и риском развития ПР [12, 13]. Установлено, что основной мишенью для внеклеточной ДНК являются TLR-9, которые взаимодействуют с неметилированными CpG последовательностями. Известно также, что TLR-9 нейтрофилов способны взаимодействовать с бактериальной ДНК, с последующей секрецией IL-8 и, в меньшей степени, IL-6 и TNFα [14]. Как отмечалось выше, уровень указанных цитокинов повышается у женщин с высоким риском ПР [6]. ПвДНК составляет 0,3 – 40% от овДНК [15], однако способность внеклеточной ДНК не фетального происхождения вызывать ПР изучена недостаточно.

Цель исследования: определение прогностической значимости комбинированного определения уровней общей и плодовой внеклеточной ДНК и цитокинов при ПР.

Материал и методы исследования

В исследование было включено 80 пациенток: из них I (основную) группу составили 47 пациенток с ПР; II группу (сравнения) – 33 пациентки со своевременными родами. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Всеми пациентками было подписано информированное согласие на участие в данном исследовании. Образцы крови у женщин с ПР были получены в начале 1 периода родов и разделены на группы по гестационному сроку согласно рекомендациям ВОЗ: 22–27 недель 6 дней, 28–33 недели 6 дней и 34–36 недель 6 дней гестации. Для сравнения исследована кровь, полученная на тех же сроках от женщин с физиологически протекающей беременностью, родоразрешенных при доношенном сроке.

Определение концентрации цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона (IFN)γ и TNFα в плазме периферической крови проводили мультиплексным методом с использованием стандартной 8-плексной тест-системы «Bio-Plex Pro Human Cytokine 8-plex Assay» («Bio-Rad», США) на проточном лазерном иммуноанализаторе «Bio-Plex 200» («Bio-Rad», США). Результаты обрабатывали при помощи приложения «Bio-Plex Manager 6,0 Properties» («Bio-Rad», США). Содержание IL представлено в пг/мл.

5,0 мл периферической крови беременных женщин были собраны в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА, и обработаны в течение часа после забора. Плазма была выделена центрифугированием в два этапа при 4°С: первый – 10 мин (200 g), второй – 10 мин (4500 g). Образцы плазмы хранили при температуре – 80°С. В работе количество овДНК в плазме крови у женщин было оценено количественной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) путем определения концентрации промотора гена RASSF1A. Оценка уровня пвДНК основана на данных о том, что в геноме плода промотор гена RASSF1A гиперметилирован [16], и, соответственно, концентрация его гиперметилированной части в крови матери будет соответствовать количеству геномных единиц пвДНК. Подробно методика выделения гиперметилированной части RASSF1A была описана в работе А.М. Красного и соавт. [17]. Для проведения ПЦР использовали амплификатор CFX96 («Bio Rad», USA). Температурный профиль реакции: 95°C 5 мин; 40 циклов: 95°C 10 с., 60°C 30 с. Последовательности праймеров и зондов представлены в таблице 1.

Статистическая обработка данных была произведена с помощью программы XLstat (Addinsoft, USA). Анализ значимости различий между группой ПР и группой сравнения проведен с использованием двухстороннего теста Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы (М), 1 и 3 квартилей (25%, 75%). Достоверными различия считались при p<0,05. Для оценки вероятности ПР и родов в срок была построена модель логистической регрессии.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ соматического и акушерского анамнеза, изучение состояния здоровья беременных не выявили статистически значимых различий. Также не установлено разницы в возрасте, индексе массы тела, уровне артериального давления, курении между пациентками обеих групп. Основные характеристики беременных с учетом сроков беременности представлены в таблице 2.

При анализе перинатальных исходов было установлено, что на сроке 22–27 недель 6 дней в 60% случаев в основной группе имела место врожденная инфекция у новорожденных (p=0,004), на сроке 28–32 недели 6 дней достоверных отличий не отмечено (p=0,34), а на сроке 33–36 недель 6 дней у 37,5% беременных основной группы диагностировалась внутриутробная инфекция (p=0,01). Приведенные результаты, с одной стороны, подтверждают взаимосвязь ПР с внутриутробной инфекцией, с другой – указывают на высокую значимость инфекции в реализации ПР на ранних сроках. Следует отметить, что корреляционный анализ установил взаимосвязь реализации внутриутробной инфекции у новорожденных с наличием у беременных кольпита, в том числе, кандидозного, герпес-вирусной инфекции, положительными результатами бактериального посева из шейки матки, которые можно рассматривать, как фактор риска развития ПР и внутриутробной инфекции.

Уровни овДНК, пвДНК, а также цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFNγ и TNFα в плазме крови беременных представлены в таблице 3.

При исследовании уровня цитокинов обнаружено, что при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней наблюдается значимое повышение только IL-6 в 1,7 раза относительно группы сравнения (p=0,004). На сроках 28–33 недели 6 дней и 34–36 недель 6 дней повышение IL-6 не выявлено. В то же время, уровень IL-8 не имел значимых отличий на сроке 22–27 недель 6 дней, однако достоверно повышался в 1,5 раза на сроке 28–33 неделе 6 дней (p=0,005) и на сроке 34–36 неделе 6 дней (p=0,008). Определение уровня овДНК установило достоверное его повышение при ПР, в отличие от группы сравнения на сроке 22–27 недель 6 дней в 2,3 раз (p=0,017), на сроке 28–33 недели 6 дней – в 2,8 раз (p=0,01) и на сроке 34–36 недели 6 дней – в 2 раза (p=0,006). Следует отметить, что содержание пвДНК было достоверно выше, в отличие от группы сравнения, только на сроке 28–33 неделе 6 дней (p=0,011).

Для определения прогностической ценности был применен метод логистической регрессии. В исходе проведенного анализа было установлено, что для прогнозирования ПР на сроке 22–27 недель 6 дней наиболее точным было одновременное определение IL-6 и овДНК – AUС: 0,925 (95% CI, 0,83–1); на сроке ПР 28–33 недели 6 дней – IL-8 и пвДНК – AUС: 0,92 (95% CI, 0,85–1); на сроке ПР 34–36 недель 6 дней – IL-8, овДНК и пвДНК –AUС=0,92 (95% CI, 0,85–1).

В проведенном ранее исследовании указывалось на повышение IL-6 при ПР [18]. Нами также установлен повышенный уровень IL-6 при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней, в то же время на более поздних сроках при ПР повышения IL-6 мы не отметили. Принимая во внимание высокую частоту внутриутробной инфекции (60%) при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней можно предположить инфекционный генез ПР в этих сроках, который реализуется посредством повышения IL-6 в плазме крови. Вышеуказанные данные согласуются с данными R. Romero и соавт. [9], указывающих на инфекционный генез ранних ПР. В более поздние сроки такой тенденции не отмечалось. Возможно, поэтому в проведенных нами исследованиях на сроках беременности 28–33 недели 6 дней и 34–36 недели 6 дней выявлялся только повышенный уровень IL-8 в основной группе. При изучении внеклеточной ДНК нами установлено, что при ПР на всех сроках достоверно повышена овДНК, и только на сроке 28–33 недели 6 дней повышена пвДНК. В других исследованиях отмечается роль пвДНК в наступлении ПР [13, 19]. Учитывая, что на сроке беременности 28–33 недели 6 дней основная и контрольная группы достоверно не различались по реализации внутриутробной инфекции, можно предположить, что только в данной группе важную роль в развитии ПР играла пвДНК. В другие сроки беременности отмечался повышенный уровень овДНК и достоверно большая частота внутриутробной инфекции в основной группе.

В литературе представлены диагностические модели для прогнозирования ПР, основанные на определении цитокинов или внеклеточной ДНК в крови матери, которые не обладают достаточной предсказательной способностью [17]. Разработанное комбинированное определение овДНК, пвДНК и цитокинов позволяет создать модель с высокой прогностической ценностью. Вместе с тем, следует отметить, что применение метода логистической регрессии при одновременном определении цитокинов и внеклеточной ДНК позволило получить диагностические модели прогнозирования ПР, различные для каждого срока беременности.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование показывает, что комбинированное определение внеклеточной ДНК и цитокинов является перспективным подходом для прогнозирования ПР.