Преэклампсия – одно из самых опасных осложнений при беременности, проявляющееся повышением артериального давления (АД), протеинурией, появлением отеков конечностей. Обычно преэклампсия развивается во второй половине беременности, в конце II или в III триместре, хотя может отмечаться и раньше (после 18 нед беременности). В среднем 5–8% беременных женщин подвержены преэклампсии. В последние годы процент материнской смертности при развитии преэклампсии значительно снизился в развитых странах благодаря появлению адекватных методов терапии и постоянному мониторингу состояния женщины, однако артериальная гипертензия (АГ) остается основной причиной смертей среди беременных ежегодно, основной вклад в этот процент вносят развивающиеся страны [1]. При преэклампсии происходит нарушение кровоснабжения плаценты. Кроме того, клиническое ухудшение состояния женщин часто является показанием к преждевременному родоразрешению. Эклампсия – это последняя и самая тяжелая стадия преэклампсии; она возникает при отсутствии адекватного лечения, когда на фоне симптомов преэклампсии резко повышается АД, возникает выраженная головная боли, потеря сознания и судороги. Эклампсия может вызвать кому и даже смерть матери и плода. Появляется все больше доказательств, что у женщин с проявлением преэклампсии впоследствии выше риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [2].
Для предотвращения развития преэклампсии, а затем и эклампсии крайне важно выявить данную патологию на ранней стадии развития, а также научиться отличать ее от других патологических состояний, сходных по клиническим признакам. Необходимость получения надежных тестовых систем для ранней диагностики преэклампсии была отмечена Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ), запустившей для этого в 2004 г. специальную программу [3].
После проведения систематизированного обзора опубликованных по данному синдрому результатов исследований и последующей оценке качества биомаркеров, ВОЗ констатировала, что «на данный момент отсутствует клинически достоверный и воспроизводимый тест для определения преэклампсии как для групп с предрасположенностью к синдрому (high risk – HR), так и для групп без предрасположенности к развитию патологии (low-risk – LR)».
Факторами риска развития преэклампсии являются следующие состояния: хроническая АГ, случаи преэклампсии в предыдущих беременностях, сахарный диабет, диабетическая нефропатия, мочекаменная болезнь, мембранозный гломерулонефрит, аутоиммунные заболевания, тромбофилия и серповидноклеточная анемия. За последние 7 лет было проведено множество исследований и найдено более 20 биомаркеров, проделано несколько метаанализов, но так и не было выявлено подходящего теста, позволяющего с высокой точностью диагностировать развитие преэклампсии до появления ее клинических симптомов [4, 5].
Определение преэклампсии
Впервые патологическая анатомия преэклампсии была описана более 100 лет назад, а исследование ее этиологии и патогенеза началось в 70-х гг. прошло- го века. Однако само определение этого состояния постоянно изменялось, и даже в современных работах встречаются расхождения. Большинство исследователей придерживаются определения, одобренного Международным обществом по изучению гипертонии при беременности. Преэклампсия диагностируется по повышению АД при двух замерах с интервалом более 6 ч у женщин с нормальным до этого момента давлением и наличию протеинурии [6]. В табл. 1 представлены различия между преэклампсией и другими заболеваниями, связанными с повышенным АД.
Таблица 1. Дифференциальный диагноз преэклампсии и других состояний, сопровождающихся повышением АД.
Таблица 2. Различия между умеренной и тяжелой формами преэклампсии.
Преэклампсия определяется как тяжелая в случае наличия у пациентки 2 первых признаков из табл. 2 (повышенное давление и протеинурия) и хотя бы одного из прочих признаков. Для минимизации ошибок при проведении исследования необходимо подробное указание всех клинических и социальных критериев пациентки, а также объединение этой информации в полуколичественную переменную «объективный клинический показатель тяжести преэклампсии» [7].
Патогенез преэклампсии
Симптомы преэклампсии не проявляются до 18-й нед беременности, но причины патологии связаны с реорганизацией спиралевидных артерий на 12-й нед беременности. Преэклампсия рассматривается как двухстадийное заболевание: стадия I относится к нарушениям при плацентации в начале беременности, а стадия II непосредственно связана с проявлением начальной стадии системной активации эндотелия и другими клиническими признаками во II–III триместрах [8]. Выделяют раннюю форму преэклампсии (проявляется во II триместре – после 18-й до 27-й нед) и позднюю форму. Было достоверно показано, что необходимым фактором проявления патологии является наличие плаценты (удаление плода без плаценты не приводит к исчезновению симптомов, только выскабливание матки ведет к быстрому и полному выздоровлению).
Основной структурной единицей плаценты являются ворсины хориона. Каждая ворсинка представлена сосудами плода, немногочисленными макрофагами и мезенхимальной соединительной тканью, окружена трофобластом. Трофобласт состоит из внутреннего слоя делящихся клеток цитотрофобласта (ЦТ) и непрерывного слоя многоядерных клеток синцитиотрофобласта (СТ), который покрывает всю поверхность ворсинок плаценты, образуя фетоплацентарный барьер. Клетки трофобласта синтезируют некоторые стероиды и гормоны (например, хорионический гонадотропин и плацентарный лактоген). Клетки цитотрофобласта дифференцируются в клетки синцитиотрофобласта, а начиная с 14-го дня имплантации, клетки CT проходят через барьер синцитиотрофобласта и дают начало новому типу клеток – вневорсинчатому трофобласту (ВВТ). Эти клетки внедряются в строму матки, образуя колонии. Двигаясь латерально от концов колоний, субпопуляции этих мобильных и инвазивных клеток достигают децидуальной оболочки и миометрия и активируют ремоделирование спиральных артерий. Субпопуляция клеток ВВТ мигрирует по артериям, заменяя эндотелиальные клетки. Это достигается за счет экспрессии молекул адгезии эндотелиальных клеток [9] и индукции трофобластом апоптоза эндотелия. Присутствующие в большом количестве в децидуальной оболочке клетки – естественные киллеры, также вызывают апоптоз клеток гладких мышц сосудов [10]. К концу I триместра спиральные артерии становятся широкими, неэластичными и рефрактерными к вазотропным влияниям. Нарушения в процессе ремоделирования спиральных артерий приводят к повреждению плаценты вследствие гипоксии и постоянного механического воздействия, связанного с сохранением высокой скорости движения крови и турбулентным характером ее течения, что приводит к некрозу тканей синтиоцитобласта и выделению продуктов некроза в материнскую кровь. Развивается системный воспалительный ответ, который, наряду с постоянной местной активацией материнского эндотелия, ведет к развитию симптомов преэклампсии [11].
Дифференцирование клеток CT в линии ST или EVT четко контролируется различными факторами, а именно гормонами, факторами транскрипции, цитокинами, факторами роста и уровнем кислорода. Транскрипционные факторы АР-1 семейства (Jun и Fos) и Hash-2 и Id-2 определяют дифференцирование трофобласта в инвазивный вневорсинчатый фенотип [12]. Было обнаружено, что экспрессия некоторых из этих факторов зависит от уровня O2 и cAMP. Низкий уровень кислорода (до 10-й нед гестации) стимулирует пролиферацию CT и подавляет дифференцировку клеток посредством модулирования экспрессии генов и стабильности mRNA [13]. Изменения в дифференцировке трофобласта приводят к нарушениям нормальноготечения беременности и проявлению различных патологических состояний, в частности преэклампсии. Показано, что постоянная гипоксия, совместно с повышением уровней фактора, индуцируемого гипоксией-1 (HIF-1) и фактора некроза опухоли а (TNF-α) [14] снижает образование ST-клеток, и, как следствие, ускоряет апоптоз трофобласта – одну из причин развития преэклампсии.
Поиск воспроизводимых биомаркеров
В наиболее ранних попытках поиска маркера преэклампсии была предложена оценка уровня мочевой кислоты в моче, однако этот тест не обладал достаточной чувствительностью и специфичностью. Следует отметить, что высокий уровень мочевины в крови при хронической АГ отмечается у женщин с повышенной вероятностью развития преэклампсии [15].
При исследовании качественных и количественных изменений белков крови в группе с преэклампсией по сравнению с группой пациенток с нормальным течением беременности было идентифицировано множество циркулирующих в крови факторов. Эти растворимые факторы связаны с нарушениями в реорганизации спиралевидных артерий на раннем этапе развития патологии и последующей эндотелиальной дисфункцией. Среди них – TNF-α, интерлейкин-1α (IL-1α), IL-1β, IL-6, факторы апоптоза (Fas-лиганд), продукты окисления липидов, нейрокинин В и ассиметричный диметиларгинин и антиангиогенные факторы: растворимая fms-подобная тирозин киназа-1 (sFlt-1) и эндоглин [16–19]. Следует отметить, что концентрации практически всех этих биомаркеров были измерены с помощью метода ELISA, причем данные различных исследований отличаются не только количественно, но и характеризуются различной динамикой – уменьшение/увеличение по сравнению с нормой. Это может быть связано с различием в специфичности применяемых антител, многокомпонентностью исследуемой биологической жидкости (в крови концентрации некоторых веществ могут различаться на 6 порядков), различием в методах подавления мажорных белков, а также недостаточностью самой выборки пациентов как в количественном аспекте, так и в отношении ее однородности.
В процессе ангиогенеза важная роль отводится фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF) и плацентарному фактору роста (PlGF), которые экспрессируются клетками децидуального слоя. Данные факторы участвуют в реорганизации спиралевидных артерий и являются ключевыми компонентами регуляции пролиферации, дифференцировки и функционирования трофобласта. VEGF и PIGF оказывают свое действие благодаря наличию соответствующих рецепторов VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2. Экспрессия sFlt-1, антагониста VEGFR-1 и VEGFR-2 регулируется уровнем кислорода и повышается при моделируемой гипоксии плаценты (in vitro и in vivo) [20].
Увеличение концентрации sFlt-1 в материнской крови во II триместре коррелирует с риском развития преэклампсии [21, 22]. Отмечается более выраженное изменение уровней Flt-1 и PlGF в I триместре при развитии ранней преэклампсии, чем ее поздней формы [23]. Несмотря на высокую чувствительность (ЧВ=96%), отдельное определение sFlt-1 нельзя использовать при диагностике преэклампсии в связи с низкой специфичностью [24]. Достоверные изменения уровня PlGF при преэклампсии отмечаются уже в I [22, 25] или начале II триместра [26, 27]. Этот дисбаланс ангиогенных факторов после 25-й нед беременности у женщин с преэклампсией в анамнезе позволяет использовать соотношение sFlt-1/PlGF как новый биомаркер риска развития преэклампсии. В данный момент скрининговый тест европейской компании Roche (sFlt-1/PlGF) для диагностики преэклампсии во II триместре проходит процедуру регистрации в FDA. Коммерческий автоматизированный электрохемилюминесцентный иммунологический анализ (Elecsys sFlt-1 и PlGF) обладает высокой диагностической эффективностью (особенно при взятии пробы в I триместре беременности), а его отношение sFlt-1/PlGF позволяет диагностировать как раннюю, так и позднюю формы преэклампсии. При пороговом значении Flt-1/PlGF больше 45, ЧВ, СП при диагностике ранней/поздней преэклампсии равны 100%, 95 и 97, 95% соответственно [28]. Отмечено, что дополнительное определение уровня белка теплового шока Hsp70 позволяет повысить чувствительность диагностики преэклампсии [29].
Определение уровней sFlt-1, VEGF, PlGF и оценка их соотношения sFlt-1/PlGF были проведены также в моче беременных женщин. Обнаружено снижение уровня PlGF у пациенток с риском развития преэклампсии до появления симптомов [30]. По сообщению I. Buhimschi определение sFlt-1/PlGF в моче позволяет с 88% чувствительностью и 100% специфичностью дифференцировать женщин с тяжелой формой преэклампсии (требующей впоследствии искусственного прерывания беременности) [30].
Эндоглин является корецептором трансформирующего фактора роста (TGF-β1, -3) и регулирует тонус сосудов через взаимодействие с эндотелиальной синтетазой оксида азота (eNOS). Внеклеточный домен эндоглина (sEng) препятс- твует связыванию TGFβ1 с рецепторами на поверхности клеток, тем самым снижая действие оксида азота на эндотелий, что ингибирует ангиогенез и приводит к дисфункции сосуда. Уровень sFlt-1 значительно повышен в материнской плазме еще за 5 нед до появления признаков преэклампсии, тогда как повышение уровня sEng наблюдается немного раньше – за 2–3 мес до появления призна- ков патологии [31, 32]. Это позволяет предложить использовать sEng в комбинации с sFlt-1/PlGF, т.е. отношения (sFlt-1+sEng)/PlGF в качестве маркера для ранней диагностики развития преэклампсии (при взятии пробы на 13-й и 20-й нед беременности) [31]. Однако при диагностировании тяжелой формы преэклампсии (в случае, когда показано прерывание беременности) в III триместре отношение sFlt-1/PlGF в моче имеет более высокую специфичность и чувствительность, чем уровень sEng, и добавление sEng к тесту sFlt-1/PlGF не повышает диагностические качества теста [33].
Нейрокинин В (NKB) – плацентарный нейропептид с нейроэндокринной и антиангиогенными функциями. При беременности, осложненной преэлампсией, или при внутриутробной задержке роста плода (ВЗРП) значительное повышение уровня NKB в плазме на 33-й нед коррелирует с повышенным уровнем оксида азота, что может рассматриваться как компенсационный механизм, улучшающий кровоснабжение плаценты [34]. Группа Li и соавт. [35] в результате длительного эксперимента по изучению изменения концентрации NKB и эндотелина-1 в плазме в норме и при развитии преэклампсии в интервале от 12-й до 32-й нед беременности обнаружила значительное повышение концентраций этих факторов еще до развития патологического состояния. Это изменение было специфичным для преэклампсии по сравнению с АГ, связанной с беременностью. Однако специфичность маркера оказалась низкой при сравнении преэклампсии и ВЗРП [35].
Обнаружено, что у пациентов с преэклампсией начинают вырабатываться собственные антитела ко второй внеклеточной петле AT1 рецептора к ангиотензину II. Эти антитела не являются специфичными для преэклампсии и наблюдаются также при ВЗРП [36]. В ходе предварительных исследований получены данные, что антитела к АТ1 являются хорошим биомаркером для преэклампсии на поздней стадии развития беременности, тогда как sFlt-1 – на ранней стадии (I триместр) [37].
Количество возможных маркеров преэклампсии постоянно увеличивается и далее будут рассмотрены лишь те из них, которые упоминаются более чем в одной работе, в частности P-селектин, ADAM12, плацентарный белок 13 (PP13), пен- траксин 3 (Ptx3) и другие [26, 38, 39, 41, 42]. Еще до появления симптомов преэклампсии (11–15-я нед) происходит увеличение концентрации Р-селектина в плазме крови. Предпринятые попытки использования Р-селектина в комбинации с другими биомаркерами (активином А и VEGFR) не выявили высокой диагностической значимости (около 59% чувствительность при 95% специфичности) [38]. У женщин с ранней преэклампсией в анамнезе было отмечено выраженное снижение уровня плацентарного белка 13 (PP-13) в I триместре. При этом чувствительность и специфичность составили 79 и 90% соответственно [39]. Удалось добиться повышения эффективности этого теста (I триместр) при комбинировании его с пульсационным индексом маточных артерий во II триместре (чувствительность – 90%, специфичность – 94%) [40]. Компанией Diagnostic Technologies, разработан иммунологический тест к PP-13 для диагностики преэклампсии в I триместре. Этот тест уже одобрен в Европе и в данный момент проходит регистрацию в США.
Собрано немало данных о том, что уровни плацентарных гликопротеинов – ингибина А и актиина А – в плазме крови в III триместре повышаются при преэклампсии и АГ, связанной с беременностью [41]. При комбинации активина А, ингибина А и пульсационного индекса маточных артерий были получены высокие значения чувствительности и специфичности теста – 92 и 95% соответственно [41]. Петраксин 3 (Ptx3) – пептид, является воспалительной молекулой, экспрессируемой на амниотическом эпителии, мезодерме хориона, терминальных ворсинках трофобласта. Уровень Ptx3 достоверно повышен в 5–7 раз в течение всей беременности у женщин с преэклампсией в анамнезе [42]. Уровень внеклеточной ДНК плода cffDNA у 240 женщин на 17-й нед беременности до проявления признаков преэклампсии оказался в 2–5 раз выше, чем в контрольной группе [43]. Комбинация мембраносвязанной, цинк-зависимой протеазы ADAM12 в I триместре с пульсационным индексом маточных артерий во II триместре позволила добиться уровня детекции в 66% [44], что впоследствии не было подтверждено [45]. Было показано, что уровень фермента жировой ткани висфатина в плазме в III триместре достоверно снижается в 3–5 раз у женщин с тяжелой формой преэклампсии [46]. Отмечается также повышение уровня как адреномодулина в плазме, так и его мРНК в плаценте пациенток с преэклампсией в III триместре беременности [47]. Поскольку АМ обладает сосудорасширяющим действием, увеличение синтеза этого пептида может быть адапторным механизмом, компенсирующим повышение давления при преэклампсии.
Описанные выше результаты были получены с помощью иммуноферментных диагностических тест-систем (в основном ELISA). В клиническую практику также активно внедряются современные методы протеомного анализа с применением высокочувствительной масс-спектрометрической техники. Использование данного подхода позволило выявить в моче беременных женщин со сроком гестации более 28 нед более 50 кандидатных биомаркеров , среди которых идентифицированы фрагменты a-цепи фибриногена, a-цепи коллагена и уромодулина [48]. В лаборатории I. Buhimschi было проведено сходное исследование протеома мочи 284 женщин [49]. Показано, что панель из 13 пептидных маркеров позволяет со 100% чувствительностью и 73% специфичностью диагностировать тяжелую форму преэклампсии, при этом точность диагностирования с использованием новой панели биомаркеров оказалась выше, чем у отношения sFlt-1/PlGF.
Говоря о поиске биомаркеров для диагностирования преэклампсии нельзя не отметить две недавно опубликованные работы, авторы которых исследовали изменения протеомов сыворотки крови пациенток с преклампсией относительно контрольной группы [50–51]. Обе работы были проведены на сходных по клиническим признакам группах из 10 пациенток с применением одинаковых методов выделения и анализа (жидкостной хроматографии) белков из сыворотки крови. Результаты сопоставили с таковыми для количественного метода ELISA, в итоге обнаружены 62 и 51 маркер соответственно. Однако полное совпадение установлено только для 15 белков, из них концентрация шести белков в одной работе повышена при патологии, а в другой работе – снижена. Повышение концентрации в крови при преэклампсии обнаружено для SERPINA1, α - 2 - HS - гликопротеина (AHSG ) , α - 1 - микроглобулина (AMBP), кластерина β-цепи компонента комплемента C8, фактора комплемента Н, фибронектина; концентрация α-цепи C4b-связывающего белка и ретинол-связывающего белка 4 (RBP4), наоборот, снижена. AHSG и RBP4 вовлечены в метаболизм липидов и изменение их содержания в крови свидетельствует о тесной взаимосвязи нарушений в метаболизме липидов с развитием преэклампсии.
В качестве биомаркеров преэклампсии могут выступать не только белки, но и низкомолекулярные соединения. Группа L.C. Kenny определила комбинацию из 14 метаболитов (мочевина, 2-оксиглутарат, глутамат, аланин и др.) плазмы крови, позволяющих с высокой диагностической значимостью определять на ранних этапах (14–16 нед беременности) развитие патологического состояния как в случае ранней, так и поздней формы преэклампсии [52]. Определение метаболитов крови проводилось также и на более ранних сроках беременности (I триместр), и была выделена панель из 4 метаболитов (гидроксигексаноил- карнитин, аланин, фенилаланин и глутамат), позволяющих с довольно высокой степенью достоверности диагностировать преэклампсию [53]. Интересно отметить, что обнаруженные в этом исследовании биомаркеры отличаются от маркеров диагностической панели группы L.C. Kenny. Это подчеркивает необходимость стандартизации процедуры последующего поиска биомаркеров при исследовании метаболома в норме и патологии. Представляет также интерес исследование отношения уровней симметричного и ассимметричного диметиларгинина (ADMA), связанного с активностью NO-синтазы. Обнаружено, что уровень ADMA повышен в крови пациенток с патологией и коррелирует с эндотелиальной дисфункцией у женщин с преэклампсией [54]. Нарушения в экспрессии и активности фермента, деградирующего ADMA, и соответственное повышение уровня ADMA, снижение уровня L-карнитина и уменьшение экспрессии eNOS могут быть компенсационным механизмом для снижения биодоступности оксида азота в плаценте при развивающейся преэклампсии.
Морфологическим отражением поражения клубочков почки при преэклампсии является гломерулярный эндотелиоз, причиной которого является воздействие вазоконстрикторных факторов (эндотелина-1, sFlt-1 и др.) на эндотелиоциты капилляров клубочка. Наличие связи между уровнем экспрессии указанных белков и нарушениями проницаемости гломерулярного барьера предполагает возможность их использования как диагностических маркеров преэклампсии. Подобные исследования проводились для нефрина, подокалицина, синаптоподина, подоцина [55–57]. Результаты исследований выявили снижение экспрессии первых трех из указанных белков подоцитами (при изучении гистологических срезов) и увеличение их выделения с мочой. Взаимосвязь наблюдаемых изменений экспрессии белков подоцитов с патогенетическими механизмами преэклампсии была изучена в масштабном исследовании [55]. Было обнаружено снижение экспрессии нефрина и синаптоподина культурой подоцитов при воздействии на нее сывороткой, инкубированной со взвесью эндотелиальных клеток, полученных от больных преэклампсией. Повышение экспрессии эндотелина-1 отмечалось авторами при добавлении к взвеси эндотелиальных клеток sFlt-1, а также при использовании блокирующих антител к VEGF. Это может служить «связующим звеном» между протеинурией и генерализованным вазоспазмом при преэклампсии. Косвенно эти результаты подтверждены у 34 пациенток [56], у которых с помощью методов ELISA было обнаружено повышение содержания нефрина и подокалицина в моче женщин, страдающих преэклампсией, по сравнению с таковыми показателями у здоровых беременных и беременных с АГ. Вопрос о взаимосвязи нефринурии и повреждения подо- цитов поднят также в работе [54], где авторы методом вестерн-блоттинга определяли содержание нефрина в моче здоровых беременных и женщин с преэклампсией. Нефринурия детектировалась за 5 дней до манифестации протеинурии. Таким образом, выделение с мочой нефрина отражает активную фазу повреждения почечной паренхимы при преэклампсии, предшествуя манифестации повреждения гломерулярного барьера и появлению протеинурии. А сам этот белок может служить маркером повреждения при преэклампсии паренхимы почек.
Заключение
Подводя итог анализу опубликованных данных, представляется, что в настоящее время, несмотря на многочисленные попытки поисков биомаркеров для ранней диагностики угрозы развития преэклампсии, наиболее информативным является определение концентрации sFlt-1, PlGF и их соотношения. Такой подход позволяет с высокой чувствительностью (95–100%) и специфичностью (95–97%) выявлять угрозу развития преэклампсии в I и начале II триместра беременности. Кроме того, данные маркеры адекватно отражают патогенез ранней патологии.
Безусловный интерес представляет развитие методов протеомного анализа с применением высокочувствительной масс-спектрометрической техники. По всей вероятности, совершенствование этих подходов позволит идентифицировать информативные маркеры и внедрить в клиническую практику методы их определения.
