В настоящее время деторождение у женщин позднего репродуктивного возраста является не только актуальной клинической проблемой, но и имеет большую социальную значимость. Возрастание общественных детерминант в современном обществе приводит к изменению репродуктивного поведения женщин и откладыванию материнства. Данные тенденции создают сложные условия для специалистов в области репродуктивного здоровья, что связано с наличием различных факторов, в том числе отягощенного соматического и гинекологического анамнеза у женщин данной возрастной группы. Пропорционально возрасту у женщин возрастает риск бесплодия, привычного невынашивания, осложнений беременности, рождения детей с пороками развития, хромосомными аномалиями и генетическими мутациями. Существуют два механизма старения яичников – физиологическое и патологическое. Первый является естественным процессом угасания функции яичником с возрастанием хронологического возраста. Ко второму относят сниженный овариальный резерв, преждевременную недостаточность яичников и бедный ответ яичников в программах применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при лечении бесплодия [1]. У женщин позднего репродуктивного возраста может наблюдаться сочетание данных механизмов, что осложняет задачу для профильных специалистов. В генезе бесплодия у женщин старше 35 лет большое значение имеют патологический фолликулогенез, снижение овариального резерва и функциональной компетентности ооцитов [2]. Помимо этого, после 40 лет наблюдается резкое увеличение частоты хромосомных аномалий эмбрионов, что связано с воздействием множества экзогенных и эндогенных факторов [3]. Известная тенденция увеличения частоты анеуплоидии и возрастного снижения овариального резерва создает сложную задачу в клинической практике. У женщин позднего репродуктивного возраста, для которых характерен менее эффективный ответ на овариальную стимуляцию, требуется большее количество ооцитов для получения эуплоидного эмбриона, по сравнению с молодыми пациентками. В исследовании Vaiarelli A. et al. было посчитано, что у женщин возрастных групп 35–37, 38–40, 41–42 и >42 лет требуется забор 5, 7, 10 и 20 ооцитов, соответственно, с целью получения хотя бы одного эуплоидного эмбриона [4].
Роль генетических факторов и оксидативного стресса в старении яичников и ооцитов
К наиболее изученным причинам формирования хромосомных нарушений относят нарушения различных процессов созревания ооцитов. Нарушение гомологичной рекомбинации является одной из распространенных причин отклонений мейотической сегрегации хромосом и формирования трисомий аутосомных и половых хромосом материнского происхождения [5]. Важнейшее значение в процессе деления клеток имеют белки когезины, которые регулируют процесс разделения сестринских хроматид [6]. В недавних исследованиях показано, что у женщин позднего репродуктивного возраста имеется взаимосвязь между снижением уровня когезинов, потерей сцепления и увеличением частоты ошибок расхождения хромосом, что также приводит к хромосомным аберрациям [7–9]. Контрольная точка сборки веретена выполняет функцию остановки клеточного цикла при ошибках сегрегации хромосом [10]. В экспериментальных исследованиях было показано, что под действием окислительного стресса с возрастом отмечается нарушение целостности контрольных точек формирования веретена, которое обусловливает увеличение частоты хромосомных нарушений [11, 12]. Нестабильность веретена деления приводит к нарушению взаимодействия между кинетохорами и микротрубочками, что также вносит вклад в возникновение анеуплоидий половых хромосом материнского происхождения [13]. Кроме того, основу для формирования хромосомных нарушений могут составить такие механизмы, как чрезмерное ацетилирование белков, эпигенетические изменения хроматина и повреждение ДНК [3].
Чрезмерная продукция активных форм кислорода (АФК) может приводить к нарушению баланса между рядом сигнальных путей и белковых факторов. Внимание исследователей обращено на изучение сигнальных путей, связанных с воздействием оксидативного стресса на овариальную функцию. Оптимальное функционирование митохондрий имеет решающее значение для сохранения овариального резерва и ооцитов высокого качества. Возрастные изменения митохондриального биогенеза негативно влияют на продукцию клеточной энергии, вызывают усиление апоптоза клеток яичников, снижение количества и качества ооцитов, и, соответственно, нарушение эмбрионального развития [14, 15]. Помимо снижения продукции АТФ с увеличением хронологического возраста в ооцитах происходят существенные молекулярные и биохимические изменения [16]. Чрезмерное накопление АФК является одним из таких патологических процессов. Несмотря на то, что патогенетические механизмы старения ооцитов крайне сложны, в настоящее время большой интерес исследователей медико‑биологических специальностей вызывает изучение вклада окислительного стресса в их формирование [17]. Как известно, в физиологических условиях окислительная и антиоксидантная системы пребывают в состоянии динамического равновесия. Являясь побочными продуктами митохондриального окислительного фосфорилирования, АФК играют роль плейотропных сигнальных молекул и участвуют в поддержании важных функций в организме. В случае избыточного накопления АФК возникает оксидативный стресс, который, как было показано в многочисленных исследованиях, через экзогенные и эндогенные пути, стресс эндоплазматического ретикулума вызывает апоптоз клеток яичника и, как следствие, нарушение фолликулогенеза [18–21]. Апоптоз гранулезных клеток приводит к дефициту питательных веществ и метаболическим нарушениям, что лишь усиливает снижение овариальной функции [22]. Кроме того, большой вклад в снижение овариального резерва вносит гибель зародышевых клеток, которая возникает вследствие запуска апоптоза. Образующийся клеточный дебрис влияет на микроокружение яичников, а повышение количества внеклеточной ДНК в фолликулярной жидкости приводит к увеличению продукции АФК, что замыкает порочный круг патологических процессов [23].
Дисбаланс оксидантно‑антиоксидантной системы приводит к нарушению сложной системы взаимодействий между рядом сигнальных путей и белковых факторов. Часть из них непосредственно связана с влиянием окислительного стресса на функционирование яичников. Одним из наиболее изученных сигнальных путей является редокс‑чувствительная сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE. Nrf2 (nuclear factor erythroid 2–related factor 2) – редокс‑чувствительный транскрипционный фактор участвует в защитных реакциях, направленных на защиту клеточных функций [24]. В нормальных условиях связывание Nrf2 с Kelch‑подобным ECHассоциированным белком 1 (Keap1) приводит к убиквитинированию и деградации первого. При изменении внутриклеточного гомеостаза, развитии оксидативного стресса комплекс Nrf2‑Keap1 разделяется, что приводит к накоплению ядерного Nrf2. Nrf2 связывается с геномными антиоксидант‑респонсивными элементами (antioxidant response element, ARE), и таким образом происходит стимуляция экспрессии ряда генов‑мишеней — антиоксидантных ферментов и факторов детоксикации [25]. Экспериментальные исследования на животных показали, что воздействие агрессивных факторов ингибирует сигнальный путь Keap1/Nrf2/ ARE, усугубляет оксидативный стресс, приводит к нарушению оогенеза [26], преждевременной активации фолликулов и снижению функции яичников [27]. Большое значение в регуляции клеточного метаболизма и оксидативного стресса имеет Sirt‑сигнальный путь. Потеря сиртуина‑1 (Sirt1) приводит к снижению качества и ингибированию деления ооцитов, а также повышению восприимчивости эмбриона к оксидативному стрессу на ранних этапах своего развития [28]. Было обнаружено, что потеря сиртуина‑1 клетками гранулезы нарушает синтез эстрадиола и экспрессию связанных с ним рецепторов [29]. В более ранних исследованиях было показано, что сигнальный путь Sirt1/FoxO1 является одним из ключевых при активации апоптоза клеток гранулезы, а, следовательно, снижении качества ооцитов и уменьшении количества примордиальных фолликулов [30]. Помимо сиртуина‑1, роль в функционировании яичников – регуляции мейоза, стабилизации теломер ооцитов, экспрессии ароматазы и 17‑гидроксистероиддегидрогеназы – играют и другие представители данного семейства белков [31]. Семейство транскрипционных факторов FOXO (forkhead box protein O) представлено факторами FoxO1, FoxO3, FoxO4 и FoxO6. Оксидативный стресс путем фосфорилирования, моноубиквитинирования и гликозилирования способен активировать FoxO сигнальный путь [32], что, в свою очередь приводит к экспрессии генов, регулирующих процессы апоптоза, аутофагии и остановку клеточного цикла [33]. Еще в 2003 г. в исследовании Shi F. et al было обнаружено, что экспрессия FoxO1 наиболее выражена в клетках гранулезы атретичных фолликулов [34]. В экспериментальных исследованиях in vitro было показано, что АФК активируют FoxO1 сигнальный путь и, таким образом, способствуют апоптозу в гранулезных клетках яичников [35]. Результаты последних исследований указывают на роль FoxO3а в преждевременном истощении примордиальных фолликулов [36]. Так, экспериментальные исследования на животных показали, что цитостатические препараты приводят к подавлению экспрессии p‑FoxO3a и антиоксидантных ферментов, митохондриальной дисфункции и усилению апоптоза [37, 38].
Сигнальный путь МАРК (mitogen‑activated protein kinase – митоген‑активируемая протеинкиназа) относится к внутриклеточным сигнальным путям, которые регулируют передачу внеклеточных сигналов от поверхности клеточной мембраны к ядру, контролируют транскрипцию генов, пролиферацию, дифференцировку клеток и другие процессы путем каскадного фосфорилирования различных протеинкиназ. МАРК протеинкиназы – это сборная группа белков из трех небольших семейств протеинкиназ – p38, JNK/SAPK (Stress‑activated protein kinase/Jun‑amino‑terminal kinase) и ERK (Extracellular‑signal‑regulated kinase) [39]. В экспериментальном исследовании Sun J. et al созданная на животных модель хронического непредсказуемого легкого стресса вызвала повышение уровня АФК, опосредованное через МАРК‑сигнальный путь, ингибирование пролиферации гранулезных клеток и ускорение клеточного старения. В этом исследовании также была показана роль ERK в процессах клеточного старения и ингибировании клеточной пролиферации, а путей JNK и p38 – в остановке клеточного цикла [40].
В регуляции клеточного цикла существенное значение имеют и другие сигнальные пути. В настоящее время много исследований посвящено изучению AKT (Alpha serine/threonine‑protein kinase) сигнального пути, который является одним из путей ингибирования процессов клеточного процесса и стимуляции клеточной пролиферации [41]. Значение данного сигнального пути при оксидативном стрессе изучили в исследовании Yan J. et al., где было показано, что АФК способны ингибировать PI3K/AKT (Phosphoinositide 3‑kinase/ Alpha serine/threonine‑protein kinase) сигнальный путь, индуцировать повышенную экспрессию BAD (BCL2 associated agonist of cell death), BAX (Bcl‑2associated X protein) и CASP9 (Caspase 9) и ускорять апоптоз гранулезных клеток [42]. Активация AKT сигнального пути связана с изменением экспрессии циклинов – семейства белков‑активаторов циклин‑зависимых протеинкиназ, которые являются ключевыми ферментами регуляции клеточного цикла. Интересные результаты были получены в экспериментальном исследовании на животных Li X. et al., в котором было показано, что терапия изорамнетином – О‑метилированным флавонолом из класса флавоноидов – через PI3K/AKT сигнальный путь приводит к снижению оксидативного стресса, усилению экспрессии циклина D, циклина E и циклина A и последующей активации пролиферации клеток гранулезы [43].
В настоящее время активно продолжаются исследования механизмов овариального старения. Изучение особенностей патогенеза на молекулярном уровне может быть перспективным направлением в отношении разработки эффективных методов терапии бесплодия и повышения результативности программ ВРТ.
Оптимизация программ ВРТ при лечении бесплодия у женщин позднего репродуктивного возраста
Экстракорпоральное оплодотворение в настоящее время является методом выбора лечения бесплодия у женщин старше 40 лет. На долю пациенток данной возрастной группы приходится 17,9% всех циклов ВРТ [44]. В настоящее время не существует эффективных мер по борьбе с возрастным снижением фертильности, однако при лечении бесплодия женщин позднего репродуктивного возраста могут быть применены различные подходы. Исследователи медико‑биологических областей проводят активное изучение и внедрение в клиническую практику новых диагностических инструментов и терапевтических стратегий, которые позволят повысить эффективность программ ВРТ, в особенности для женщин позднего репродуктивного возраста. К наиболее современным методам относят криоконсервацию ооцитов в более молодом возрасте (программы отложенного материнства) с целью сохранения фертильности по медицинским показаниям или социальным причинам, персонализированную контролируемую стимуляцию яичников с целью максимального ответа яичников, совершенствование селекции эмбрионов с помощью преимплантационного генетического тестирования на наличие анеуплоидий и других генетических нарушений, донацию ооцитов в случае отсутствия возможности получения собственных ооцитов. В настоящее время проводятся активные исследования и попытки внедрению в клиническую практику новых диагностических инструментов и терапевтических стратегий, которые позволят повысить эффективность программ ВРТ, в особенности для женщин позднего репродуктивного возраста.
Методы оценки репродуктивного потенциала у пациенток позднего репродуктивного возраста
Подбор метода лечения бесплодия супружеской пары должен производиться с учетом возраста женщин, основываться на правильной оценке овариального резерва и дополнительных факторах, которые могут ухудшать шансы каждой пары на зачатие. Корректная оценка репродуктивного потенциала имеет важное клиническое значение для определения шанса на зачатие для супружеской пары и определения тактики ведения. Наиболее надежными методами оценки функционального резерва яичников являются оценка уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), антимюллеров гормон (АМГ) и подсчет числа антральных фолликулов [45, 46]. Отсутствие терапевтических методов улучшения качества ооцитов и эмбрионов подчеркивает острую необходимость разработки правильных терапевтических стратегий с целью получения максимально возможного количества ооцитов. Эффективность и безопасность эмбриологического этапа, обеспечение оптимальной среды культивирования in vitro позволяются обеспечить благоприятные исходы. Решающее значение в повышении эффективности программ ВРТ имеют рациональные подходы к эмбриологическому этапу, а также применение стратегии переноса одного эмбриона [47–49].
Контролируемая стимуляция яичников у пациенток старше 40 лет
При проведении циклов ВРТ основным фактором достижения клинической беременности являются результаты контролируемой стимуляции яичников.
«Бедный» ответ яичников является существенной проблемой репродуктивной медицины. Женщины с «бедным» ответом на овариальную стимуляцию составляют значительную когорту среди всех пациенток, проходящих программы ВРТ с целью лечения бесплодия. Частота данного состояния составляет от 5 до 24% [4]. Такая вариабельность данных связана с отсутствием единого мнения относительно определения «бедного» ответа. Болонские критерии были первым международным консенсусом по определению «бедного» ответа. В 2016 г. была принята новая классификация POSEIDON, которая характеризуется более детальной стратификацией пациенток и обеспечивает индивидуализированный подход к их лечению. Несмотря на совершенствование диагностических и терапевтических методов, подходы к ведению пациентов данной когорты остаются дискутабельными. Так, в последнем Кокрейновском мета‑анализе 2010 г. было показано отсутствие убедительных данных в поддержку рутинного применения конкретных методов лечения пациенток с «бедным» ответом [50]. В связи с этим репродуктологи используют в клинической практике различные протоколы контролируемой стимуляции яичников для повышения частоты наступления беременности. Несмотря на это, показатель живорождения за цикл составляет 6% среди пациенток с «бедным» ответом яичников [51]. Кумулятивная частота живорождения — это общее число живорождений за один цикл, которое включает переносы нативных и/или размороженных эмбрионов у пары. Результаты исследований демонстрируют предсказуемую тенденцию — чем больше количество полученных ооцитов, тем выше кумулятивная частота живорождения [52– 54]. Стимуляция овуляции поддерживает рост фолликулов во время каждого цикла, но не может генерировать фолликулы ex-novo. Именно поэтому увеличение доз препаратов в циклах стимуляции сверх максимального порога не представляют клинического интереса ввиду отсутствия эффекта.
В исследовании Zhang X. et al была проведена модификация рутинных протоколов на гибкий короткий с целью повышения эффективности стимуляции овуляции у пациенток с «бедным» ответом старше 40 лет [55]. Преимуществами гибкого протокола могут быть уменьшение случаев преждевременного всплеска лютеинизирующего гормона (ЛГ) и, соответственно, частоты отмены цикла, а также сокращение дозы гонадотропинов и необходимого для стимуляции времени. Сравнительная оценка эффективности проводилась со стандартным коротким протоколом и протоколом умеренной «мягкой» стимуляции. Умеренная «мягкая» стимуляция проводилась по следующей схеме: с 3‑го дня цикла по предшествующий введению триггера (человеческого хорионического гонадотропина (чХГ)) день применялись антиэстрогенные препараты. Препараты человеческого менопаузального гонадотропина или ФСГ вводились в низких дозах от 75 до 150 МЕ в сутки с 5‑го дня цикла. Коррекция дозы гонадотропинов проводилась под контролем фолликулометрии в зависимости от индивидуального ответа каждой пациентки. При достижении одним или несколькими фолликулами диаметра 18 мм вводился чХГ 10 000 МЕ. Забор ооцитов проводился через 36 ч после введения препарата чХГ. В стандартном коротком протоколе введение трипторелина 0,1 мг/сутки) проводилось со 2‑го дня менструального цикла до дня введения препарата чХГ. Препараты гонадотропина вводились с 3‑го дня в начальной дозе 150–225 МЕ в сутки в течение первых 5 дней, дальнейшая коррекция дозы проводилась под контролем развития фолликулов. В гибком коротком протоколе стимуляция начиналась с 3‑го дня цикла введением трипторелина (0,05 мг/сутки) и продолжалась до дня введения чХГ. Препараты гонадотропина (ФСГ) вводились при повышении уровня эстрогена и достижении хотя бы одного фолликула диаметра 5 мм. Время начала введения гонадотропинов было более гибким – с 5‑го по 10‑й день цикла до дня введения чХГ, а минимальное количество дней введения составляло 4. Эмбрионы высокого качества были перенесены или заморожены методом витрификации на 3‑й день после оплодотворения. В случае отсутствия высококачественных эмбрионов на 3‑й день, культивирование продлевалось до 5‑го или 6‑го дня. Сравнительный анализ показал высокую эффективность гибкого короткого протокола в отношении не только улучшения качества ооцитов и эмбрионов, но и имплантационного потенциала по сравнению с протоколом мягкой стимуляции. Применение гибкого протокола позволило уменьшить общую дозу гонадотропина на цикл стимуляции, а также снизить частоту преждевременной овуляции. Таким образом, авторами был сделан вывод о преимуществах применения модифицированной схемы стимуляции для пациенток старше 40 лет. Применение агониста гонадотропин‑рилизинг‑гормона (аГнРГ) трипторелина в гибком коротком протоколе может стимулировать высвобождение межциклического ФСГ и, таким образом, улучшать стимуляцию роста фолликулов [56]. В то же время аГнРГ подавляют пик ЛГ в связи с десенситизирующим эффектом на гипофиз. Введение аГнРГ способствует снижению уровня биоактивного ЛГ, росту множественных фолликулов и предотвращает преждевременную овуляцию, которая свойственна пациенткам позднего репродуктивного возраста и с «бедным» ответом.
Летрозол является ингибитором ароматазы третьего поколения, подавляет превращение андрогенов в эстрогены и повышает уровень андрогенов в яичниках, что приводит к снижению уровня эстрогенов в ранней фолликулярной фазе, ослабляет отрицательную обратную связь эстрогенов с гипофизом, увеличивает эндогенную секрецию ФСГ и ЛГ и способствует росту фолликулов [57]. Кроме того, андрогены способны повышать чувствительность фолликула к ФСГ, что также стимулирует рост фолликулов. В мета‑анализе Qin Y.et al (2021) была проведена оценка эффективности применения летрозола в комбинации с протоколом с аГнРГ у пациенток с «бедным» ответом. Было показано, что частота клинической беременности за один цикл ЭКО при применении летрозола была выше, чем в группах сравнения [58]. Включение летрозола позволяет снижать общую дозу препаратов гонадотропинов и не влияет на количество полученных ооцитов, частоту отмены цикла и концентрацию эстрадиола в день введения чХГ. Кроме того, было показано, что применение летрозола позволяет уменьшить экономическую нагрузку на пациентов. Подтверждение этих данных было найдено в другом мета‑анализе 2022 г. Bülow N.S. et al., в котором показали, что для пациенток с «бедным» ответом яичников при стимуляции овуляции может быть рекомендован летрозол [59].
В настоящее время большой интерес представляет продолжение исследований по подбору эффективного протокола стимуляции овуляции у женщин позднего репродуктивного возраста. Индивидуальный подход к стимуляции овуляции у женщин данной когорты является перспективным ввиду потенциальных возможностей улучшения исходов программа ВРТ.
Экспериментальные подходы к оптимизации программ ВРТ у пациенток позднего репродуктивного возраста
Разработка и внедрение в будущем новых терапевтических подходов может не только повысить эффективность, но и сократить риски при лечении бесплодия методами ВРТ у женщин позднего репродуктивного возраста. В настоящее время перспективным является изучение таких новаторских неинвазивных методов, как метаболическое профилирование культуральных сред для подбора лучших условий культивирования и селекции эмбриона с максимальным имплантационным потенциалом [60–63]. Также большой интерес исследователей представляют такие экспериментальные терапевтические методы улучшения репродуктивного потенциала у женщин, как хромосомная терапия, создание гамет in vitro, пронуклеарный или митохондриальный перенос [2]. Требуется дальнейшее изучение данных методов с целью оценки безопасности и клинической эффективности применения в программах ЭКО.
Заключение
В настоящее время изучение патогенетических механизмов старения яичников является не только одним из ключевых направлений для оптимизации программ лечения бесплодия у женщин позднего репродуктивного возраста методами ВРТ с собствен‑ ными ооцитами, но и представляет научный интерес для разработки в будущем инновационных терапев‑ тических подходов для данной когорты пациенток. В настоящее время внимания клиницистов заслужива‑ ет активное внедрение в практику программ витри‑ фикации ооцитов, как наиболее надежного способа сохранения генетического материала и репродуктив‑ ного здоровья пациенток с социальными и медицин‑ скими факторами риска бесплодия.
