Перспективы исследования маркеров клеток кумулюса для оценки качества ооцитов и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий

Сафронова Н.А., Калинина Е.А., Донников А.Е., Бурменская О.В., Макарова Н.П., Кулакова Е.В., Алиева К.У.

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва
Цель исследования. Провести систематический анализ данных, имеющихся в современной литературе, о роли кумулюсных клеток в физиологии женской репродуктивной системы, влиянии экспрессии генов кумулюсных клеток на эмбриологические характеристики и результаты программ экстракорпорального оплодотворения с целью идентификации биомаркеров для оценки качества ооцитов и развивающихся эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материал и методы. В обзор включены данные зарубежных и отечественных статей, найденных в Pubmed по данной теме, опубликованных за последние 10 лет.
Результаты. Исследования последних лет доказывают, что уровень экспрессии потенциально значимых генов в кумулюсных клетках коррелирует с показателями качества ооцитов, развитием эмбрионов, частотой наступления беременности и рождения живых детей. В статье приводятся данные об исследовании генов кумулюсных клеток, продемонстрировавших корреляцию с вероятностью наличия хромосомных аномалий эмбриона при проведении предимплантационной генетической диагностики.
Заключение. Результаты проводимых исследований подтверждают перспективность изучения профиля экспрессии генов в кумулюсных клетках, что позволит более точно осуществлять выбор эмбрионов для переноса и, тем самым, повысить результативность программ ЭКО в целом. Оценка транскриптома кумулюсных клеток может стать новым альтернативным неинвазивным методом диагностики хромосомных аномалий у плода.

Ключевые слова

бесплодие
кумулюсные клетки
экспрессия генов
экстракорпоральное оплодотворение

В современном мире бесплодие является довольно распространенной проблемой и затрагивает примерно 15% всех пар репродуктивного возраста. Среди всех доступных методов лечения бесплодия вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) имеют самые высокие показатели наступления беременности и рождения живых детей. Стимуляция овуляции при проведении программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) проводится с целью получения большого количества ооцитов, для того чтобы снизить риск неудачи ЭКО путем выбора наиболее приемлемого эмбриона для переноса [1]. Выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом является одним из ведущих факторов успешного лечения бесплодия при использовании ВРТ [2]. В настоящее время оценка эмбрионов в основном основывается на морфологических критериях и скорости дробления клеток. Однако точность такого метода отбора эмбрионов остается недостаточно высокой, хотя его использование и привело к значительному повышению результативности программ ЭКО [3]. Именно поэтому во многих центрах репродукции осуществляется перенос 2 эмбрионов для повышения шансов наступления беременности в данном цикле. Но это существенно повышает риск развития многоплодной беременности, что, в свою очередь, приводит к повышению риска преждевременных родов и развитию сопутствующих осложнений [3]. Таким образом, развитие точных и неинвазивных объективных методов оценки качественных ооцитов и жизнеспособных эмбрионов является одной из наиболее важных целей репродуктивной медицины.

Современные представления о роли кумулюсных клеток в фолликулогенезе и оогенезе

В течение своего развития фолликулы подвергаются различным изменениям, включающим созревание, овуляцию, образование желтого тела и атрезию. Все эти процессы контролируются вырабатываемыми гипофизом гонадотропинами, которые оказывают непосредственное влияние на развитие ооцита и окружающие его соматические клетки [4]. В фолликуле выделяют два типа соматических клеток: муральная гранулеза, выстилающая полость фолликула и ответственная за стероидогенез, и кумулюсные клетки, непосредственно окружающие ооцит. Эти клетки имеют общее происхождение на ранних стадиях фолликулярного развития, однако на более поздних этапах, при формировании полости внутри фолликула, происходит дифференцировка клеток на 2 различных анатомических и функциональных слоя [5, 6]. В конечном итоге формируется зрелый ооцит-кумулюсный комплекс, в котором кумулюсные клетки остаются тесно связаны с ооцитом посредством специальных щелевых контактов, позволяющих осуществлять метаболический обмен и транспорт сигнальных молекул [7, 8]. Ооцит, в свою очередь, продуцирует растворимые факторы роста (ооцит-секретируемые факторы (OSF)), необходимые для роста окружающих фолликулярных клеток на разных этапах развития. Эти факторы роста регулируют широкий спектр функций гранулезных и кумулюсных клеток, включающий дифференцировку, пролиферацию, апоптоз и лютеинизацию [5].

Экспансия – важный процесс финальной стадии фолликулогенеза, характеризующийся ростом кумулюсных клеток с одновременной потерей тесных контактов между клетками. В процессе экспансии кумулюсные клетки продуцируют гиалуроновую кислоту, которая откладывается на экстрацеллюлярном матриксе, связывающем вместе ооцит и кумулюсные клетки. Эта уникальная способность клеток кумулюса подвергаться экспансии необходима для нормального развития ооцита и овуляции [9].

Таким образом, для нормального созревания фолликула необходима тесная взаимосвязь между ооцитом и окружающими его соматическими клетками. Именно важная роль кумулюсных клеток заставила ученых сосредоточиться на их исследовании. Клетки кумулюса, отделенные от ооцита для дальнейшего исследования, однородны, не содержат примесей других клеток, в то время как отделенные для анализа гранулезные клетки, как правило, содержат клетки крови и текальные клетки, что связано с методами, которые используются для их получения [10].

Исследование клеток кумулюса поможет идентифицировать потенциальные биомаркеры для оценки качества и репродуктивного потенциала ооцитов, дальнейшего развития эмбрионов и результатов программ ВРТ.

Анализ транскриптома кумулюсных клеток

Поиск новых подходов для оценки качества эмбрионов привел к развитию современных методов анализа транскриптомных профилей, позволяющих быстро и точно оценивать уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках. Исследования последних лет доказывают, что уровень экспрессии потенциально значимых генов в кумулюсных клетках коррелирует с показателями качества ооцитов [11–15], развитием эмбрионов [11, 13, 15–18], частотой наступления беременности [13, 16, 18–22] и рождения живых детей [21, 23, 24].

Влияние экспрессии генов на качество ооцитов и развитие эмбрионов

В своем первом исследовании McKenzie и соавт. показали наличие корреляции между уровнем экспрессии генов гиалуронан синтетазы 2 (HAS2), простагландин синтетазы 2 (PTGS2) и гена гремлин (GREM1) и показателями зрелости ооцитов, качеством эмбрионов и показателями оплодотворения [15]. Используя метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), они оценивали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках 108 ооцитов и доказали, что уровень экспрессии генов PTGS2 и HAS2 был в 6 раз выше, а уровень экспрессии GREM1 в 15 раз выше в кумулюсных клетках ооцитов, развившихся до эмбрионов высокого качества на 3-и сутки по сравнению эмбрионами низкого качества. Последующие исследования подтвердили взаимосвязь экспрессии гена GREM1 и показателей качества эмбрионов на 3-и сутки развития [11,16].

Feuerstein и соавт. сфокусировали свое внимание на оценке генов, экспрессирующихся кумулюсными клетками в ответ на выброс ЛГ: белка острого стероидогенного ответа (STAR), простагландин синтетазы 2 (PTGS2), амфирегулина (AREG), двух генов ацетил-CoA-десатуразы (SCD1 и SCD5) и коннексина 43 (Cx43) [12]. Экспрессия всех этих генов, за исключением Cx43, повышалась после возобновления мейоза. Таким образом, была выявлена взаимосвязь между повышением уровня экспрессии генов STAR, PTGS2, AREG,SCD1 и SCD5 и созреванием ооцита.

Zhang и соавт. сравнивали кумулюсные клетки ооцитов, из которых развились 8-клеточные эмбрионы на 3-й день развития, с ооцитами, у которых оплодотворения вообще не наступило. С помощью анализа на микроматрицах или микрочипах авторы выявили 160 генов с различным уровнем экспрессии в данных группах [14]. Последующая проверка с помощью метода ПЦР-РВ подтвердила наличие взаимосвязи между уровнем экспрессии гена PTX3 и развитием ооцитов. Однако, эти результаты противоречили данным исследования Cillo и соавт., продемонстрировавшим отсутствие корреляции между уровнем экспрессии генов в кумулюсных клетках ооцитов, развившихся до эмбрионов высокого качества на 3-й день развития, по сравнению с ооцитами низкого качества или отсутствием оплодотворения вовсе [11]. Подобным образом, используя метод ПЦР-РВ, Anderson и соавт. [16] также не выявили корреляции между уровнем экспрессии гена PTX3 в кумулюсных клетках, развитием эмбрионов и частотой наступления беременности.

Van Montfoort и соавт. исследовали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках 8 ооцитов с последующим ранним дроблением эмбрионов и 8 ооцитов с отсутствием раннего дробления эмбрионов [17]. Результаты данного исследования выявили 7 наиболее значимых генов, связанных с регуляцией клеточного цикла и участвующих в процессах ангиогенеза и апоптоза. В дальнейшем эти результаты были подтверждены методом ПЦР-РВ. Изменение экспрессии данных генов у эмбрионов с отсутствием раннего дробления свидетельствовало о наличии гипоксического состояния и задержке развития.

В 2011 году Wathlet и соавт. [18] провели анализ кумулюсных клеток у пациенток, проходящих программу ЭКО/ИКСИ с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ) и рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (рФСГ), в сравнении с пациентками, проходящими программу ЭКО/ИКСИ с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) и человеческим менопаузальным гонадотропином (ЧМГ). В исследовании оценивалось наличие корреляции между уровнями экспрессии 8 различных генов и показателями качества эмбрионов в различных протоколах стимуляции суперовуляции. Wathlet и соавт. обнаружили, что уровень экспрессии PTGS был выше, а VCAN ниже в зрелых ооцитах, находящихся в блоке метафазы второго мейотического деления (MII). Все гены, за исключением VCAN, положительно коррелировали с морфологическими показателями оценки качества эмбрионов на 3-и и на 5-е сутки развития, и были использованы для создания прогностической модели развития эмбрионов для протоколов стимуляции с антГнРГ и аГнРГ.

В дальнейшем Feuerstein и соавт. [13] в своем исследовании определяли уровень экспрессии 308 различных генов в 197 образцах кумулюсных клеток от 106 пациенток, проходивших программу ЭКО/ИКСИ. Они оценили наличие корреляции между уровнем экспрессии генов в кумулюсных клетках и показателями качества ооцитов и дальнейшего развития бластоцист. В дальнейшем авторами проводился мета-анализ уже имеющихся литературных данных для выявления наиболее значимых генов. В итоге из 308 генов 8 генов, коррелировавших с показателями качества ооцитов и развития эмбрионов по данным анализа на микроматрицах или микрочипах, были отобраны для дальнейшего подтверждения методом ПЦР-РВ. В результате только один ген – регулятор сигнальных путей G-белков (RGS2) подтвердил свою связь с показателями качества ооцитов и частотой наступления беременности.

Влияние экспрессии генов на частоту наступления беременности и показатели рождаемости

Используя показатель наступления беременности как главный измеряемый параметр в исследовании, Assou и соавт. с помощью анализа на микроматрицах или микрочипах оценили уровень экспрессии 630 различных генов в кумулюсных клетках [19]. Большинство этих генов имело высокий уровень экспрессии в группе забеременевших женщин, что доказывает наличие связи этих генов с развитием эмбрионов. Результаты исследования в дальнейшем были подтверждены методом ПЦР-РВ [19].

В дальнейших исследованиях Wathlet и соавт. проводили оценку экспрессии 11 генов у пациенток, проходящих программу ЭКО/ИКСИ с антГнРГ и рФСГ в сравнении с пациентками, проходящими программу ЭКО/ИКСИ с аГнРГ и ЧМГ. Не было обнаружено значительных различий в уровне экспрессии VCAN у женщин с наступившей беременностью по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила, в то время как прослеживалась четкая связь между экспрессией генов эфрина В2 (EFNB2), инозитол-трифосфат 3 киназы А (ITPKA) и кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы 1D (CAMK1D) и показателями наступления беременности [22]. Гены EFNB2, CAMK1D и станниокальцин-2 (STC2) использовались в предложенной модели для прогнозирования эффективности программы ВРТ.

По данным исследования Wathlet и соавт. [18], уровень экспрессии GREM1 был выше у женщин с наступившей беременностью при проведении программ ВРТ с антГнРГ по сравнению с аГнРГ. Однако Amderson и соавт. [16] не выявили значимой корреляции между показателями экспрессии GREM1, PTX3, HAS2 и частотой наступления беременности.

Более поздние исследования Gebhardt и соавт. показали, что уровень экспрессии генов версикан (VCAN) и PTGS2 был значительно выше в кумулюсных клетках ооцитов, перенос эмбрионов от которых привел к наступлению беременности и рождению живого ребенка [21].

Однако Papler и соавт., исследуя гены EFNB2, VCAN, CALM1, PTGS2 и ITPKA, не выявили никакой корреляции между уровнем экспрессии генов и показателями оплодотворения, имплантации [25] и наступления клинической беременности [20].

В 2013 году Iager и соавт. [23] в своем ретроспективном исследовании оценивали уровень экспрессии генов в кумулюсных клетках пациенток, проходивших программу ЭКО, в трех различных клиниках Китая и США. Анализ проводился методом ПЦР-РВ и анализа на микроматрицах или микрочипах с целью идентификации биомаркеров для прогнозирования рождения живых здоровых детей. Ученые оценивали уровень экспрессии 12 различных генов, коррелировавших с показателями живорождения и выявили, что данные гены могут использоваться в качестве маркеров для прогнозирования наступления беременности.

Корреляция между экспрессией генов в кумулюсных клетках и наличием анеуплоидий у плода

В 2012 году Fragouli и соавт. показали, что высокий уровень гена SPSB2 (супрессор цитокиновой сигнализации, содержащий SPRY-домен) в ооцитах коррелирует с показателями рождаемости живых здоровых детей [24]. Однако главной целью данного исследования являлось определение генов, уровень экспрессии которых коррелировал с наличием анеуплоидий у плода при проведении предимплантационной генетической диагностики. Ученые анализировали уровень экспрессии 96 генов, используя метод ПЦР-РВ, и обнаружили, что уровень экспрессии SPSB2 и опухолевого протеина (TP53I3) был значительно ниже в кумулюсных клетках ооцитов с хромосомными аномалиями. Эти результаты показывают, что оценка транскриптома кумулюсных клеток может стать новым альтернативным неинвазивным методом диагностики хромосомных аномалий у плода.

Заключение

Доказано, что взаимосвязь между ооцитом и окружающими его фолликулярными клетками является необходимой для нормального функционирования женской репродуктивной системы. Накопленные на сегодня данные подтверждают перспективность изучения профиля экспрессии генов в кумулюсных клетках для оценки качества ооцитов и эмбрионов. Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать улучшению нашего понимания биологических процессов, происходящих в фолликуле в течение его развития, а также помогут выявить новые биомаркеры для оценки качества ооцитов и прогноза дальнейшего развития эмбрионов, что позволит более точно осуществлять выбор эмбрионов для переноса и, тем самым, повысить результативность программ ЭКО в целом.

Список литературы

  1. Эбзеева М.В., Калинина Е.А., Кузьмичев Л.Н. Современные подходы к стимуляции суперовуляции в программах ВРТ. Проблемы репродукции. 2009; 4: 47-9.
  2. Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Краснощока О.Е., Донников А.Е., Бурменская О.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Возможности неинвазивной оценки состояния ооцита и эмбриона при проведении программ ВРТ по профилю экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости. Акушерство и гинекология. 2014; 9: 36-43.
  3. Bromer J.G., Seli E. Assessment of embryo viability in assisted reproductive technology: shortcomings of current approaches and the emerging role of metabolomics. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2008; 20(3): 234-41.
  4. Chronowska E. High-throughput analysis of ovarian granulosa cell transcriptome. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 213570.
  5. Gilchrist R.B., Lane M., Thompson J.G. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality. Hum. Reprod. Update. 2008; 14(2): 159-77.
  6. Kurilo L.F. Oogenesis in antenatal development in man. Hum. Genet. 1981; 57(1): 86-92.
  7. Albertini D.F., Combelles C.M., Benecchi E., Carabatsos M.J. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development. Reproduction. 2001; 121(5): 647-53.
  8. Tanghe S. et al. Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization. Mol. Reprod. Dev. 2002; 61(3): 414-24.
  9. Vanderhyden B.C., Macdonald E.A., Nagyova E., Dhawan A. Evaluation of members of the TGFbeta superfamily as candidates for the oocyte factors that control mouse cumulus expansion and steroidogenesis. Reprod. 2003; 61(Suppl.): 55-70.
  10. Блашкив Т.В., Шепель А.А., Вознесенская Т.Ю. Экспрессия генов клетками кумулюсного окружения ооцита в период овуляции и оплодотворения (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2014; 1: 55-8.
  11. Cillo F., Brevini T.A., Antonini S., Paffoni A., Ragni G., Gandolfi F. Association between human oocyte developmental competence and expression levels of some cumulus genes. Reproduction. 2007; 134(5): 645-50.
  12. Feuerstein P., Cadoret V., Dalbies-Tran R., Guerif F., Bidault R., Royere D. Gene expression in human cumulus cells: one approach to oocyte competence. Hum. Reprod. 2007; 22(12): 3069-77.
  13. Feuerstein P., Puard V., Chevalier C., Teusan R., Cadoret V., Guerif F. et al. Genomic assessment of human cumulus cell marker genes as predictors of oocyte developmental competence: impact of various experimental factors. PLoS One. 2012; 7(7): e40449.
  14. Zhang X., Jafari N., Barnes R.B., Confino E., Milad M., Kazer R.R. Studies of gene expression in human cumulus cells indicate pentraxin 3 as a possible marker for oocyte quality. Fertil. Steril. 2005; 83 (Suppl. 1): 1169-79.
  15. McKenzie L.J., Pangas S.A., Carson S.A., Kovanci E., Cisneros P., Buster J.E. et al. Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Hum. Reprod. 2004; 19(12): 2869-74.
  16. Anderson R.A., Sciorio R., Kinnell H., Bayne R.A., Thong K.J., de Sousa P.A., Pickering S. Cumulus gene expression as a predictor of human oocyte fertilisation, embryo development and competence to establish a pregnancy. Reproduction. 2009; 138(4): 629-37.
  17. van Montfoort A.P., Geraedts J.P., Dumoulin J.C., Stassen A.P., Evers J.L., Ayoubi T.A. Differential gene expression in cumulus cells as a prognostic indicator of embryo viability: a microarray analysis. Mol. Hum. Reprod. 2008; 14(3): 157-68.
  18. Wathlet S., Adriaenssens T., Segers I., Verheyen G., Van de Velde H., Coucke W. et al. Cumulus cell gene expression predicts better cleavage-stage embryo or blastocyst development and pregnancy for ICSI patients. Hum. Reprod. 2011; 26(5): 1035-51.
  19. Assou S., Haouzi D., Mahmoud K., Aouacheria A., Guillemin Y., Pantesco V. et al. A non-invasive test for assessing embryo potential by gene expression profiles of human cumulus cells: a proof of concept study. Mol. Hum. Reprod. 2008; 14(12): 711-9.
  20. Burnik Papler T., Vrtačnik Bokal E., Maver A., Lovrečić L. Specific gene expression differences in cumulus cells as potential biomarkers of pregnancy. Reprod. Biomed. Online. 2015; 30(4): 426-33.
  21. Gebhardt K.M., Feil D.K., Dunning K.R., Lane M., Russell D.L. Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer. Fertil. Steril. 2011; 96(1): 47-52. e2.
  22. Wathlet S., Adriaenssens T., Segers I., Verheyen G., Janssens R., Coucke W. et al. New candidate genes to predict pregnancy outcome in single embryo transfer cycles when using cumulus cell gene expression. Fertil. Steril. 2012; 98(2): 432-9. e4.
  23. Iager A.E., Kocabas A.M., Otu H.H., Ruppel P., Langerveld A., Schnarr P. et al. Identification of a novel gene set in human cumulus cells predictive of an oocyte’s pregnancy potential. Fertil. Steril. 2013; 99(3): 745-52. e6.
  24. Fragouli E., Wells D., Iager A.E., Kayisli U.A., Patrizio P. Alteration of gene expression in human cumulus cells as a potential indicator of oocyte aneuploidy. Hum. Reprod. 2012; 27(8): 2559-68.
  25. Burnik Papler T., Vrtacnik Bokal E., Lovrecic L., Kopitar A.N., Maver A. No specific gene expression signature in human granulosa and cumulus cells for prediction of oocyte fertilisation and embryo implantation. PLoS One. 2015; 10(3): e0115865.

Поступила 09.06.2015
Принята в печать 26.06.2015

Об авторах / Для корреспонденции

Сафронова Наталья Александровна, аспирант отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-25-01. E-mail: n_safronova90@bk.ru
Калинина Елена Анатольевна, д.м.н., руководитель отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-13-41. E-mail: e_kalinina@oparina4.ru
Донников Андрей Евгеньевич, к.м.н., с.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-13-41. E-mail: a_donnikov@oparina4.ru
Бурменская Ольга Владимировна, д.б.н., с.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-13-41. E-mail: o_bourmenskaya@oparina4.ru
Макарова Наталья Петровна, к.б.н., научный сотрудник отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-25-01 E-mail: np.makarova@gmail.com
Кулакова Елена Владимировна, к.м.н., научный сотрудник отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-25-01. E-mail: e_kulakova@oparina4.ru
Алиева Камила Уллубиевна, к.м.н., научный сотрудник отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-25-01. E-mail: k_alieva@oparina4.ru

Для цитирования: Сафронова Н.А., Калинина Е.А., Донников А.Е., Бурменская О.В., Макарова Н.П., Кулакова Е.В., Алиева К.У. Перспективы исследования маркеров клеток кумулюса для оценки качества ооцитов и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2015; 12: 21-25.

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.