Потенциал-зависимый кальциевый канал L-типа, кодируемый порообразующей субъединицей α1 CaV1.2 (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 C, CACNA1C), демонстрирует одну из самых широких экспрессий в тканях организма – сердце, мозг, гладкие мышцы, эндокринную и иммунную системы, что и обуславливает такой многогранный эффект клинических проявлений при нарушениях его экспрессии [1]. Работа кальциевых каналов опосредуется транспортом ионов Са2+ внутрь клетки и из клетки, что ведет к изменению сопряжения процессов возбуждения и покоя с последующим изменением функции клетки [2].
Именно активация кальциевых каналов лежит в основе сокращения миокарда, гладкой мускулатуры (кишечника, матки, сосудов), поперечнополосатой (скелетной) мускулатуры, пейсмейкерной активности клеток проводящей системы сердца, выделения медиаторов нервными клетками, секреции ферментов и гормонов и т.д. [3]. Некоторые патогенные варианты гена Ca2+-канала L-типа CACNA1C могут вызывать мультисистемное заболевание, которое включает тяжелый синдром удлиненного интервала Q–T (Long Q–T syndrome, LQTS), врожденный порок сердца, дисморфические черты лица, синдактилию, аномальную иммунную функцию и нервно-психические расстройства, известное под общим названием «синдром Тимоти» [4]. Выявлена роль α1C в психических нарушениях, таких как биполярное расстройство, шизофрения, аутизм и т.д. [5]. Также в некоторых исследованиях установлена взаимосвязь экспрессии гена α1C с онкологическими заболеваниями (при опухолях головного мозга, лейкемии, раке молочной железы и т.д.) [6].
В акушерстве и гинекологии в развитии таких клинических состояний, как угроза преждевременных родов и преждевременные роды, аномалии родовой деятельности с тенденцией к слабости родовой деятельности, врожденная кардиомиопатия и нарушения ритма сердца у новорожденных, артериальная гипертензия во время беременности, в родах и послеродовом периоде, не последняя роль может принадлежать изменению функции кальциевых каналов. В 2019 г. нашими исследованиями была показана роль кальциевых каналов в развитии пролапса гениталий (ПГ) [7]. Мы предположили, что одна из версий формирования ПГ заключается в вовлечении гладкомышечного компонента [7, 8].
Помимо редукции коллагенового компонента, именно снижение тонуса и релаксации гладкомышечного компонента центральной части тазовой диафрагмы может привести к ПГ [7]. Данное предположение было выдвинуто на основании того, что пациентки с апикальной формой ПГ имели системную гладкомышечную «миопатию» (дивертикулы органов, признаки венозной флебопатии, раннюю миопию, запоры и ручное пособие при дефекации, первичную и вторичную слабость родовой деятельности и т.д.) [7].
Поэтому целью нашего исследования было более глубокое изучение экспрессии белка α1C в круглой связке матки у пациенток с ПГ и клиническими проявлениями генерализованной гладкомышечной «релаксации».
Материалы и методы
В условиях хирургического отделения НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России обследована 61 женщина от 40 до 70 лет (медиана возраста пациенток 53 (49,3; 60,8) года). Все пациентки были разделены на 2 группы: в I группу (основную) включена 31 больная с ПГ, во II группу (сравнения) – 30 пациенток с другой гинекологической патологией. Критериями включения явились: возраст 40–70 лет, наличие ПГ, информированное согласие пациентов на включение в исследование, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии. Критерии исключения: возраст до 40 и старше 70 лет, онкологические заболевания, инфекционные заболевания, психические расстройства; отсутствие информированного согласия.
Исследование одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Основным методом хирургического лечения пациенток с ПГ были: лапароскопическая (ЛС) mesh (сетчатая)-гистеропексия – 10/31 (32,3%), ЛС mesh-цервикопексия – 2/31 (6,5%), ЛС mesh-кольпопексия – 2/31 (6,5%). Данные объемы дополнялись: гистерэктомией – у 4/31 (12,9%), операцией по MacCall – у 10/31 (32,3%), ректопексией с и без использования импланта – у 4/31 (12,9%), сигмопексией с и без использования импланта – у 2/31 (6,5%); вагинальным доступом: передней, задней кольпоррафией и перинеолеваторопластикой – у 20/31 (64,5%), операцией Лефора–Нейгебауэра – у 1/31 (3,2%), сфинктеропластикой – у 1/31 (3,2%). В группе сравнения оперативные вмешательства лапароскопическим доступом по поводу основного заболевания представлены: гистерэктомия – 3/31 (14,3%), миомэктомия – 13/31 (61,9%), иссечение очагов эндометриоза – 4/31 (19,1%), иссечение очагов аденомиоза – 2/31 (9,5%), резекция яичника – 4/31 (19,1%).
Изучение уровня экспрессии белка α1С в ткани круглых связок проводили методом вестерн блот. Образцы тканей размером 0,5×0,5 см из круглой связки были получены во время лапароскопического этапа операции по коррекции пролапса гениталий у больных I группы, а также во время лапароскопических операций при проведении гистерэктомии по поводу различной гинекологической патологии (рецидивирующей патологии эндометрия, миомы матки больших размеров, диффузно-узловой формы аденомиоза и др.) у больных II группы на базе хирургического отделения НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова. Образцы сразу замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С.
Перед анализом методом вестерн-блот каждый образец лизировали на льду на 30 минут раствором RIPA буфера (Pierce, США) с добавлением ингибиторов протеаз (Roche Applied Science, США) до получения однородной массы и центрифугировали при 13 000 об/мин при 4°С в течение 10 минут. Концентрацию белка в образце определяли методом Брэдфорда с использованием BSA в качестве стандарта белка с использованием набора BCA Quick Start Bradford Protein Assay (Bio Rad, США). 20 мкг общего белка и маркеры загружали в лунки градиентного геля мини-SDS-PAGE (5–20%) и разделяли электрофоретически, визуально контролируя фронт разделения по маркерам. Затем содержащиеся на геле белки переносили на PVDF мембрану (Bio Rad, США) при помощи системы мокрого переноса по протоколу производителя (Bio-Rad, США). Полученные мембраны блокировали с помощью 5% обезжиренного молока (Bio Rad, США) в фосфатно-солевом буфере с 0,5% Tween 20 (PBST) при 4°C в течение ночи. Мембраны инкубировали с первичными антителами против α1С (Invitrogen, США) и GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) (Invitrogen, США) в течение 1,5 ч при 37°C. После чего мембраны отмывали в PBST и окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Bio Rad, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Активацию пероксидазы для индукции сигнала проводили с помощью набора Clarity Western ECL Substrate (Bio Rad, США).
Для детекции использовали систему имиджера ChemiDoc (Bio-Rad, США), оптическую плотность полос измеряли с использованием программного обеспечения Image Lab (BioRad, США). Нормирование полученных данных проводили на уровень GAPDH.
Cтатистический анализ
Количественные показатели представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (SD) при нормальном распределении и в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала (Q1; Q3) при распределении, отличном от нормального. Статистическая значимость различий определялась с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при соблюдении нормального распределения, определенного с помощью критерия Шапиро–Уилка и равенства дисперсий, определенного с помощью критерия Левина. При несоблюдении указанных условий использовался непараметрический критерий Манна–Уитни. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с помощью точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для статистической обработки результатов и построения графиков использовались программы Compare2, GraphPad Prism 8.4.3.
Результаты и обсуждение
В основной группе средний возраст пациенток составил 56 (51; 61) лет, в группе сравнения – 52 (49; 54,5) года (р=0,46). Индекс массы тела (ИМТ) в I группе составил 26,6 (24,8; 30,1), во II группе – 24,8 (21,9; 28,1) (р=0,173). Статистически значимой разницы между группами по возрасту и ИМТ не выявлено.
В I группе ПГ был представлен: опущением матки и стенок влагалища II–III степени – 12/31 (38,7%) случаев; неполным и полным выпадением матки и стенок влагалища – 15/31 (48,38%) и 4/31 (12,9%) случаев соответственно. В группе сравнения ПГ выявлено не было. Сопутствующая гинекологическая патология у пациенток с ПГ была представлена миомой матки – у 6/31 (19,4%), аденомиозом и кистами яичников – у 2/31 (6,5%) и 2/31 (6,5%) соответственно.
Гинекологическая патология у пациенток II группы была представлена миомой матки – у 21/30 (70%), диффузно-узловой формой аденомиоза – у 16/30 (53,3%), наружно-генитальным эндометриозом – у 7/30 (23,3%), патологией эндометрия – у 6/30 (20%) и кистами яичников – у 6/30 (20%).
Учитывая одинаковый возраст пациенток, различий в сопутствующей экстрагенитальной патологии выявлено не было. Исключения составляли лишь заболевания, которые могли быть рассмотрены в контексте соединительнотканного фенотипа. Так, в I группе миопия встречалась у 18/31 (58,1%) женщин (во II группе – у 3/30 (10%)) (р<0,0001); вегето-сосудистая дистония по гипотоническому типу в молодом возрасте – у 16/31 (51,6%) (во II группе – у 3/30 (10%)) (р=0,001); хронический тонзиллит – у 13/31 (42%) пациенток (во II группе – у 6/30 (20%)) (р=0,097); варикозное расширение вен нижних конечностей и геморрой – у 11/31 (35,5%) (во II группе – у 9/30 (30%) и у 1/30 (3,3%) соответственно) (р=0,786) (рис. 1).
Полученные данные не противоречили указаниям на заболеваемость, характерную для дисплазии соединительной ткани (ДСТ) [9].
Все пациентки основной группы и группы сравнения имели в анамнезе роды. В I группе среднее количество родов на одну пациентку составило 1,8, во II группе – 1,6. Одни роды в анамнезе в I группе были у 10/31 (32,3%) пациенток, двое и более – у 21/31 (67,7%); во второй – у 13/30 (43,35) и 17/30 (56,7%) женщин соответственно. Разница в количестве родов в I и II группе была статистически незначимой (p=0,434). Тем не менее ПГ развился только у пациенток I группы. Высокая частота родов в анамнезе не всегда ведет к развитию ПГ. Так, по данным литературы, в странах Азии и Африки, где у женщин в среднем 5–8 родов, ПГ развивается в 4 раза реже, чем у пациенток в странах Европы, где частота родов в анамнезе на одну женщину в среднем не превышает 1,8 [10–12]. Развитие ПГ у нерожавших пациенток также не всегда укладывается в контексте родовой травмы [13, 14].
Значимых различий по весу рожденных детей в первых и вторых родах в обеих группах также не было. Группы значимо различались лишь по весу новорожденного в третьих родах. Во II группе вес плода был в 1,2 раза выше, чем в I группе (р=0,002) (табл. 1).
И, тем не менее, случаев опущения и выпадения половых органов во II группе выявлено не было. Это не противоречит данным отечественной литературы, где описано формирование ПГ у пациенток в течение 1 года после первых неосложненных родов плодом до 3400 г [15]. Кроме того, рождение детей с более низкой массой тела, характерное для пациенток с ДСТ, также ставит под сомнение родовую травму как причину развития ПГ [16–18].
Частота травм промежности в I группе составила: самопроизвольный разрыв промежности I–II степени – 5/31 (16,1%) случаев, эпизиотомия – 10/31 (32,3%); во II группе – 4/30 (13,3%) и 2/30 (6,6%) случаев соответственно. Значимых различий в группах по самопроизвольному разрыву промежности выявлено не было (р>0,892).
Средняя продолжительность первых родов в основной группе и в группе сравнения не различалась и составила 9 (4,3; 12) и 9 (8; 14,3) ч соответственно, длительность вторых родов – 7 (4; 9) и 7 (7; 10) ч, что не отличалось от особенностей течения родов в популяции. Однако в группе пациенток с ПГ у 10/31 (32,3%) женщин имелась тенденция к увеличению частоты быстрых и стремительных родов, по сравнению с 1/30 (3,3%) во II группе (р=0,006), что не противоречило данным других авторов [19].
Несмотря на отсутствие различий в паритете и родовом травматизме в группах, ПГ сформировался именно в I группе. Так, у пациенток I группы после единственных родов в анамнезе ПГ был выявлен у 10/31 (32,3%) (через 16 (6; 18) лет), после вторых родов – у 17/31 (54,8%) (через 10,5 (4,5; 17,5) лет), после третьих – у 4/31 (12,9%) больных (через 8 (2; 10) лет).
ПГ в ряде случаев был наследственным. Так, наследственность по ПГ была отягощена у 9/31 (29%) женщин в I группе, в то время как во II группе указаний на ПГ у родственников не было (p=0,007). Полученные результаты не противоречат данным отечественных и зарубежных авторов [15, 20, 21].
Апикальная форма ПГ в I группе была представлена: маточным пролапсом III степени – у 5/31 (16,1%) пациенток, неполным выпадением матки и стенок влагалища – у 15/31 (48,4%), полным выпадением – у 4/31 (12,9%) женщин. Также в I группе было 7/31 (22,6%) больных с локальными формами опущения стенок влагалища в виде цисто-, ректоцеле II–III степени.
В среднем ПГ (апикальные формы) у пациенток основной группы был выявлен в 42 (36,5; 47,3) года, локальные формы опущения стенок влагалища – в 46 (34; 51,5) лет. Из апикальных форм, маточный пролапс 3 степени, возникнув в относительно молодом возрасте (в 49 (40,5; 56,5) лет), прогрессировал до полного выпадения матки и стенок влагалища к 55 (51; 61) и 61,5 (58,8; 65,8) годам соответственно. Если в возрасте 49 лет апикальная форма пролапса не превышала 16,1%, то к 62 годам данный показатель достигал 61,3%. Средний возраст пациенток на момент операции с апикальными формами ПГ составил 56,5 (49,5; 61) лет, с локальными формами – 55 (51; 58) лет.
Таким образом, апикальная форма ПГ формируется сразу как самостоятельная форма и не является следствием прогрессирования локальных форм, а лишь прогрессирует со временем. Известно, что если ПГ у пациенток существует более 5 лет, то риск рецидива после хирургической коррекции увеличивается в 3 раза [22].
Локальные формы не имеют такого быстрого прогрессирования, что подтверждается тем, что пациентки с локальными формами ПГ были прооперированы в среднем через 16–18 лет (с апикальными – через 12 лет).
На наследственный характер патологии мог указывать и симптомокомплекс ДСТ. Помимо перечисленных выше (миопия, варикозная болезнь и т.д.), обращали на себя внимание такие клинические проявления ДСТ как гипермобильность суставов (ГМС), нарушение функции аноректального отдела тазовой диафрагмы в анамнезе до родов (жалобы на запоры, ручное пособие и т.д.), малые аномалии развития, в том числе по данным эхокардиографии.
Так, ГМС выявлена у 24/31 (77,4%) пациенток I группы в сравнении с 8/30 (26,7%) во II группе (р<0,0001). Если в среднем в популяции индекс ГМС по шкале Бейтона составляет 2,1 балла, то у пациенток с ПГ этот показатель составил 4,4 (2,37) балла по сравнению с 2,0 (1,31) баллами во II группе.
Ведущими у пациенток I группы были жалобы со стороны аноректального отдела тазовой диафрагмы, которые достигали 35% по сравнению с 10% во II группе (табл. 2). Так, жалобы на ощущение инородного тела во влагалище и чувство неполного опорожнения кишечника предъявляли 20/31 (64,5%) и 6/31 (19,4%) женщин соответственно, запоры – 17/31 (54,8%) больных, недержание газов – 8/31 (25,8%), ручное пособие во время дефекации оказывали 11/31 (35,5%) женщин I группы. Во II группе основными жалобами были: бесплодие – в 2/30 (6,7%) случаях, тянущие боли внизу живота – в 14/30 (46,7%), меноррагия – в 18/30 (60%), рецидивирующая патология эндометрия – в 4/30 (13,3%), рост миоматозных узлов – в 9/30 (30%), а жалобы на запоры лишь в 3/30 (10%) случаях.
Также в I группе отмечалось недержание мочи – в 10/31 (32,3%) случаях, затрудненное мочеиспускание – в 5/31 (16,1%) случаях (табл. 2).
Казалось бы, жалобы со стороны аноректального отдела диафрагмы были обусловлены ПГ; однако ранее было показано, что у нерожавших первобеременных с синдромом ДСТ частота указанных жалоб не отличалась от частоты жалоб у рожавших пациенток с ПГ [14]. На основании чего и сделан вывод, что указанные жалобы скорее отражают дисфункцию тазового дна, чем являются следствием ПГ [14].
Высокая частота хронического гастрита – 9/31 (29%) и мочекаменной болезни – 4/31 (12,9%) в I группе по сравнению со II группой могли быть обусловлены вероятным наличием латентного гастро- и нефроптоза, а также рефлюкс-эзофагита на фоне грыжи пищеводного отверстия диафрагмы.
Известно, что синдром ДСТ у женщин, помимо гипермобильности суставов, эластоза кожи, сколиоза и т.д., характеризуется плоскостопием [9]. Была изучена высота подометрического индекса (ПДИ) стопы. Плоскостопие у пациенток I группы выявлялось в 3 раза чаще (у 15/31 (48,4%)) по сравнению со II группой (у 5/30 (16,7%)) (p=0,008). В основной группе ПДИ составил 27,48 (2,08), что соответствовало плоскостопию 1–3 степени, а во II группе – 28,98 (0,84), что являлось вариантом нормы. Данный показатель обратно коррелировал с возрастом пациенток (-0,509; p=0,01) и наличием ПГ; т.е. чем в более молодом возрасте было выявлено плоскостопие, тем более тяжелыми формами был представлен ПГ, что не противоречит данным литературы [14, 23].
При динамометрии кистей рук в I группе было выявлено снижение силы до 25,5 (23,75; 27) даН по сравнению со II группой – 30 (28,5; 31) даН (p<0,0001) и прямо коррелировало с плоскостопием (0,536; р=0,01). Указанные фенотипические проявления подтверждали «саркопенический» фенотип.
В 2018 г. у пациенток с ПГ с низкими уровнями экспрессии α1С нами были показаны и такие проявления «саркопенического фенотипа» как астенический (гипотрофический) тип телосложения (30%), мышечная астения (29%), нарушение рефракции с детства (22,2%), артериальная гипотензия (60%), функциональная истмико-цервикальная недостаточность во время беременности (23%), быстрые и стремительные роды (37,6%), склонность к запорам (55%), варикозная болезнь (39,5%), протрузия и релаксация тазового дна (51%), апикальные формы ПГ (60%), повышенная ГМС (48,8%), сколиоз 2 степени (33%), плоскостопие 3 степени (73,8%), гипотоническая дисфункция кишечника (50–60%), наличие именно апикальных форм ПГ и т.д. [3]. Было показано, что именно «саркопенический» фенотип характерен для больных с ПГ, и именно при апикальных формах [2, 3].
Поскольку кальциевые каналы CaV1.2 представлены во всей гладкомышечной системе и являются основной структурой, которая образует проводящий Ca2+-канал, снижение тонуса и релаксация гладкомышечного компонента центральной части тазовой диафрагмы вследствие нарушения функции Ca2+-канала, может играть не последнюю роль в развитии ПГ [7, 8].
Всем пациенткам с ПГ в данном исследовании был выполнен сравнительный анализ экспрессии белка α1С. Выявлено, что у пациенток с ПГ (I группа) уровень экспрессии белка α1С был ниже, чем в группе сравнения: 3,034 (0,8108; 4,040) отн. ед. против 4,098 (2,508; 6,543) отн. ед. (p=0,0045) (рис. 2).
На мембране белок α1С детектировался в виде двух бэндов, примерно 240 и 260 кДа (рис. 3). Мы предположили, что белок весом 260 кДА является зрелым (гликолизированным). Экспрессию α1С оценивали по сумме двух бэндов.
Учитывая, что у пациенток с ПГ имеется симптомокомплекс «саркопенического фенотипа», то, вероятно, локальные изменения микроциркуляции могут также являться пусковым механизмом к развитию начальных форм ПГ [24].
Нарушение тонуса сосудистой стенки подтверждает и варикозное расширение вен нижних конечностей, которое в нашем исследовании встречалось у 35,5% больных I группы [3]. Предыдущими нашими исследованиями (лазерная допплерометрия) на микроциркуляторном уровне было показано, что для пациенток с ПГ на системном уровне характерен гиперемический (застойный) тип микроциркуляции с компенсаторной собственной пейсмейкерной активацией тонуса сосудов [25, 26]. Поэтому изучение гемодинамики при эхокардиографии в контексте особенностей микроциркуляции у пациенток с ПГ и уровня экспрессии белка α1С представляет определенный интерес.
Всем пациенткам с низким уровнем экспрессии белка α1С мы выполнили эхокардиографию (табл. 3):
В представленном анализе эхокардиограмм у пациенток с ПГ помимо ПМК и МАР сердца, характерных для ДСТ, прослеживается тенденция к снижению ФВ (р=0,02), увеличению КДО (р=0,05) на фоне более тонкой задней стенки ЛЖ (р=0,005), что подтверждает «саркопенический» фенотип у пациенток с ПГ.
Таким образом, изменение работы кальциевого канала в сторону снижения экспрессии белка α1С у пациенток с синдромом ДСТ, ведет к формированию миастенического фенотипа, что определяет не только характерный тип гемодинамики, но и гиперемический тип микроциркуляции. Указанные механизмы могут являться предикторами развития ПГ.
Указанные изменения могут отражать определенные закономерности вовлечения стромально-мышечного компонента и косвенно указывать на наличие ДСТ.
Выводы
1. У пациенток при ПГ наблюдается снижение уровня экспрессии белка α1С по сравнению с пациентками без ПГ.
2. Пациентки с низким уровнем экспрессии белка α1С имеют определенный клинический симптомокомплекс ДСТ, который укладывается в понятие «саркопенический фенотип».
3. Особенности течения родов у пациенток при ДСТ с саркопеническим фенотипом в ряде случаев также взаимосвязаны с низким уровнем экспрессии белка α1С, что определяет предпосылки к формированию ПГ.
4. Форма ПГ (апикальная) в ряде случаев может определяться изменением работы кальциевого канала в сторону снижения экспрессии белка α1С.
