Проблема преждевременного разрыва плодных оболочек (ПРПО) при доношенной беременности не теряет своей актуальности, несмотря на большое количество исследований в этой области и изобретение различных средств для подготовки шейки матки и индукции родов.
Преждевременное излитие околоплодных вод как минимум за час до начала родов встречается, по данным различных авторов, от 2,7 до 17% случаев [1, 2]. ПРПО при доношенной беременности ассоциирован с высоким процентом аномалий родовой деятельности, дистресса плода, родового травматизма, септических осложнений как для матери, так и для новорожденного. Развитие вышеперечисленных осложнений при ПРПО, а также отказ пациенток от подготовки шейки матки либо ее неэффективность, увеличение продолжительности родов и неготовность рожениц к такой продолжительности родов приводят к увеличению процента кесаревых сечений у данного контингента пациенток. Причем, как правило, это первородящие пациентки. Соответственно, решение проблемы ведения рожениц в ПРПО при доношенной беременности позволит сократить процент кесаревых сечений, а также снизить материнскую и перинатальную заболеваемость.
Связь инфекционного фактора ПРПО при недоношенной беременности доказана большим количеством работ [3–6]. Современные исследования демонстрируют как одну из ведущих причин преждевременного излития околоплодных вод воспалительные изменения плодных оболочек за счет восходящей инфекции [7]. Лейкоцитарная инфильтрация при разрыве плодных оболочек над внутренним зевом выявляется в 1/3 случаев дородового излития околоплодных вод [8]. Анализ микрофлоры влагалища и цервикального канала у пациенток с дородовым излитием позволит объяснить роль микробного фактора в реализации ПРПО при доношенной беременности.
Целью данного исследования было изучение микробиоты влагалища и цервикального канала у пациентов с ПРПО в сроке беременности более 37 недель и сравнение с микробиотой у пациенток со своевременным излитием околоплодных вод в родах.
Материалы и методы
На базе родильных отделений ГБУЗ ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова г. Самары нами были включены в исследование и проспективное наблюдение 143 пациентки со сроком беременности 37–42 недели. Из них основную группу с ПРПО составили 85 пациенток, 58 пациенток вошли в группу контроля со своевременным излитием околоплодных вод (воды у них отошли в родах после начала родовой деятельности). Мазки и посевы брали у пациенток с момента диагностики излития околоплодных вод в основной группе либо с началом активной фазы первого периода родов при наличии интактного плодного пузыря. В анализ были включены результаты бактериологического анализа влагалищного и цервикального содержимого путем культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов на специальных питательных средах, микроскопическое исследование мазков из влагалища и цервикального канала, окрашенных по Граму, а также исследование содержимого цервикального канала методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (Фемофлор 16) и применением детектирующего амплификатора ДТ-96 производства ООО «НПО ДНК-Технология» (РУ ФСР 2009/04663, патент №2362808 от 13.02.08). Исходно методика Фемофлор 16 была разработана для оценки состояния влагалища, а нами была использована с целью оценки и сопоставления бактериологических посевов и метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени микробного пейзажа цервикального канала. Данная технология предусматривает анализ биоты различных биотопов, в том числе и цервикального канала [9, 10], включающий определение микроорганизмов: Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp.
На базе кафедры акушерства и гинекологии ИПО СамГМУ совместно с частной медицинской компанией ООО «Независимая лаборатория ИНВИТРО» ранее был выполнен большой объем иммунологических и микробиологических исследований, особое внимание уделялось изучению биоценоза влагалища при различных акушерских и гинекологических патологиях [11, 12], а также в различные возрастные периоды с применением скрининга микрофлоры «Фемофлор 8», «Фемофлор 16», «Фемофлор 17» [13, 14]. Данная методика себя хорошо зарекомендовала в плане высокой чувствительности и специфичности выявления определенных групп микроорганизмов.
Для получения адекватных результатов использовали только образцы с достаточным количеством клеток цервикального канала, попавших в пробирку с анализируемой пробой и достаточной общей бактериальной массой. Учитывались пробы, в которых количество ДНК клеток человека было больше 104 геном-эквивалентов (ГЭ) в образце, это показатель качества взятия мазка (КВМ). Величина общей бактериальной массы (ОБМ) для адекватной оценки биоценоза должна содержать не менее 106 ГЭ/образец. После амплификации автоматически устанавливали общее количество бактериальной массы, Lactobacillus spp. и различных видов условно-патогенных микроорганизмов. Количественная оценка цервикальной микрофлоры приводилась как в абсолютных, так и в относительных показателях к ОБМ. Абсолютный показатель – количество ДНК искомого микроорганизма в образце, выраженное в ГЭ, представленное в виде десятичного логарифма – lg. Относительный количественный показатель микроорганизма рассчитывали, как отношение количества искомого микроорганизма к количеству ОБМ. Он был представлен в двух форматах: разница десятичных lg количества соответствующей группы микроорганизмов и ОБМ и в процентах по отношению к ОБМ.
При микроскопии мазка оценивались количество эпителия, лейкоцитов, наличие палочковой, кокковой либо смешанной флоры, в том числе патогенной флоры: гонококки, трихомонады и т.д. С учетом соотношения этих показателей результаты исследования мазков были разделены на нормоценоз, бактериальный вагиноз, вагинит. Диагноз бактериального вагиноза ставился при наличии большого количества эпителиальных клеток в мазке при нормальном или сниженном количестве лейкоцитов, рН более 4,5. Диагноз вагинита ставился на основании большого количества лейкоцитов, присутствия кокковой, кокко-бациллярной флоры, выявления патогенных микроорганизмов.
Статистический анализ
Обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 10.0, SPSS 13. Для описания количественных данных использована медиана (Ме), а в качестве интервальной оценки – верхний (Q1) и нижний (Q3) квартили, так как исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения (несоответствие нормальному распределению определено методом Шапиро–Уилка), к количественным переменным относились натуральные логарифмы содержания различных видов микроорганизмов в анализе ПЦР в режиме реального времени. Остальные признаки относились к бинарным качественным переменным по типу есть/нет, частоты приведены в абсолютных числах и процентах. Анализ качественных признаков проводился с помощью таблиц сопряженности, с применением критерия χ2 либо двустороннего критерия Фишера. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Микроскопия мазков входит в стандарт обследования беременных и рожениц при поступлении в отделение. В соответствии с критериями интерпретации мазка характер микрофлоры влагалища распределился следующим образом. В основной группе нормоценоз имели 38 (52,05%) беременных из 73, а в контрольной – 35 (62,1%) из 58 пациенток. Нарушения биоценоза были выявлены в следующем соотношении: бактериальный вагиноз – в 12 (16,4%) случаях в основной группе и 12 (20,6%) в контрольной, вагинит – у 23 (31,5%) и 10 (17,2%) пациенток соответственно, но различия были статистически не значимы (χ2=3,5; df=2, р=0,17).
Парадоксальный результат был получен при анализе результатов бактериологического исследования отделяемого цервикального канала: роста микроорганизмов на стандартных средах не было у 40 (49,4%) из 81 пациенток основной группы и 29 (50%) из 58 женщин контрольной группы, то есть значимой разницы обсемененности цервикального канала по результатам посевов не получено (рисунок).
Разнообразие микробных ассоциаций при бактериологическом посеве было представлено факультативной анаэробной микрофлорой. Монокультуры выделены в основной группе у 24 беременных (29,6%), что почти в 2 раза больше, чем в контрольной – 10 (17,2%). У остальных пациенток в практически равном соотношении наблюдались ассоциации из двух, трех, четырех микроорганизмов (χ2=6,64; df=4, р=0,16). Наиболее частыми ассоциациями были Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp., E. coli, Klebsiella spp.
В контрольной группе чаще выявлялись Lactobacillus spp.: у каждой пятой пациентки, но тем не менее в группе пациенток с ПРПО они тоже наблюдались, но с меньшей частотой (табл. 1).
В обеих группах преобладали различные виды условно-патогенных стафилококков (Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus pasteuri), все они были в большом количестве – более 106 КОЕ. В основной и контрольной группах Staphylococcus spp. выявлялся у каждой пятой пациентки, и существенных различий в группах не наблюдалось.
На втором месте по частоте был Enterococcus faecalis: 14 (18,4%) в основной группе и 9 (15,5%) в контрольной, различия были статистически не значимы.
Из разнообразного семейства Streptococcus spp. в посевах были выделены Streptococcus agalactiae только в основной группе у 3 (4,0%) пациенток, в контрольной группе Streptococcus spp. в посевах отсутствовали.
Частота выявления Escherichia coli была сопоставима в обеих группах: у 6 (8,0%) пациенток с ПРПО и 4 (6,9%) пациенток со своевременным излитием околоплодных вод, что соответствовало данным других исследований 2,5–7% [15, 16].
Обращает на себя внимание значимо более высокая частота выявления Raoultella ornithinolytica в контрольной группе – у 8 (13,8%) беременных и лишь у 1 (1,3%) пациентки основной группы (р=0,004).
В обеих исследуемых группах в единичных случаях нами выявлены Сorynebacterium spp.
Определение количества микроорганизмов из цервикального канала с помощью методики ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени выполнено у 22 беременных основной группы и 17 беременных контрольной, результаты приведены в таблице 2.
У пациенток в основной группе ОБМ была ниже, чем в контрольной, и ее медиана составила 6,0 (5,3;6,5) ГЭ/образце, тогда как в контрольной – 7,5 (7,0;8,1) ГЭ/образце (U=24,5; Z=-4,5; р=0,000), при адекватном КВМ. При этом ОБМ была достаточной для выполнения анализа. Согласно данным литературы [9], обсемененность цервикального канала в 10–100 раз меньше, чем во влагалище (106–109).
Основным представителем нормофлоры отделяемого влагалища у здоровых женщин репродуктивного возраста являются представители рода Lactobacillus spp. В норме на долю Н2О2-продуцирующих Lactobacillus spp. приходится от 80 до 100% всех микроорганизмов (Nugent et al., 1991; Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г., 2004). У здоровых женщин абсолютное количество Lactobacillus spp. практически не отличается от общего количества бактерий, то есть составляет 106–108 (Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2006). Наличие Lactobacillus spp. в цервикальном канале также является вариантом нормы, и в процентном соотношении должно преобладать над другими микроорганизмами (более 80%). В нашем случае абсолютное количество Lactobacillus spp. было ниже в основной группе (медиана 105,8), чем в контрольной – 107,6 (р=0,000). В 2 случаях (10%) в основной группе Lactobacillus spp. выявлены не были.
ОБМ в основной группе составила 6,0 (5,3;6,5), что значимо ниже, чем в контрольной – 7,5 (7,0;8,1). По результатам нашего исследования с помощью методики ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени были получены четыре варианта микрофлоры цервикального канала: пациенток с низкой ОБМ (меньше 106) в основной группе было 9 (40,9%), тогда как в контрольной группе – только 1 (5,9%, р=0,02), выраженное преобладание анаэробной микрофлоры наблюдалось только у пациенток основной группы – 5 случаев.
На первом месте по частоте выявления в контрольной группе были Staphylococcus spp. – 15 (88%), в основной – 10 (45%), р=0,007 (двусторонний критерий Фишера). В контрольной группе различные виды Staphylococcus spp. выделялись чаще, но при этом в более низком абсолютном количестве, поэтому на фоне преобладания Lactobacillus spp. данные результаты были отнесены к варианту нормы.
Более чем в 2 раза чаще выявлялись в контрольной группе представители семейства Enterobacteriaceae spp. – 8 (47%) и лишь у 4 (18%) беременных в основной группе, р=0,09 (двусторонний критерий Фишера). В отношении Streptococcus spp. ни в количественном соотношении, ни в частоте выявления различий в группах не наблюдалось.
При ПРПО не отмечено преобладания каких-либо видов облигатной анаэробной микрофлоры как в количественном соотношении, например, Gardnerella vaginalis + Prevotella bivia + Porphyromonas spp., так и по частоте выявления: 17 (77%) и 104,3 в основной группе и 13 (76%) и 104,2 в контрольной (р=0,9). Eubacterium spp. определялись одинаково часто в обеих группах: 15 (68%) и 11 (64%) соответственно (р=0,9), процентное соотношение в составе остальной микрофлоры также не различалось. Анаэробы: Sneathia spp. + Leptotrichia spp. + Fusobacterium spp., Megasphaera spp. + Veillonella spp.+ Dialister spp., Lachnobacterium spp. + Clostridium spp., Peptostreptococcus spp. наблюдались в основной группе чаще и в большей абсолютной и относительной концентрации, что подтверждает наше предположение о преобладании анаэробной микрофлоры у пациенток с ПРПО. Также отмечено преобладание грибов рода кандида – 8 (36%), по сравнению с контрольной группой – 3 (17%, р=0,28), однако различия были статистически не значимы.
Микоплазмы распределились в группах следующим образом: Mycoplasma hominis выделена только в 1 случае в основной группе, там же отмечалась более высокая частота встречаемости для Ureaplasma (urealyticum + parvum), однако различия были статистически не значимы (р=0,62). Что касается Мycoplasma genitalium, которая относится к абсолютным патогенам и в результатах анализа указывается только наличие данного микроорганизма либо его отсутствие без указания количества колоний, в нашем исследовании бактерия выявлена только в одном случае у пациентки из группы с ПРПО.
Обсуждение
Нормальная микрофлора влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста содержит грамположительные и грамотрицательные аэробные, факультативно-аэробные и облигатно-анаэробные микроорганизмы, при этом 95–98% всех микроорганизмов представлено Lactobacillus spp. [12]. К нормальной микрофлоре относятся также Mycoplasma hominis в титре менее 104 КОЕ/мл, грибы рода Candida в титре менее 103 КОЕ/мл [17]. Применение методики ПЦР с детекцией в режиме реального времени перспективно в плане исследования биотопа не только влагалища, но и цервикального канала. Однако показатели нормы для этой методики для различных биотопов пока окончательно не установлены, особенно во время беременности. Наши исследования продемонстрировали, что ОБМ при ПРПО значимо ниже, чем при интактном плодном пузыре, при этом наблюдается снижение абсолютного и относительного количества Lactobacillus spp. и преобладание облигатных анаэробов в цервикальном канале. Низкую ОБМ можно связать с антимикробной активностью околоплодных вод, что, соответственно, приводит к снижению обсемененности цервикального канала бактериальной флорой в сравнении с группой пациенток без отхождения околоплодных вод.
Согласно результатам нашего исследования, различные виды Staphylococcus spp. в небольшом количестве (103,3–103,9) являются наиболее распространенными представителями биотопа цервикального канала. Данные микроорганизмы относятся к нормальной микрофлоре желудочно-кишечного тракта и присутствуют практически у всех пациенток контрольной группы, в отличие от основной группы. Наши данные подтверждает ряд других работ [16, 17]. Изменение особенностей местного иммунитета приводит к усиленному размножению Staphylococcus spp.
Вторым по частоте выявления в бактериологических посевах цервикального канала был Enterococcus faecalis. По данным авторов Егоровой Ю.В., Нестерова А.С. [14], частота его встречаемости в биотопе цервикального канала здоровой женщины составляет 13%, при наличии воспалительных заболеваний возрастая в 2 раза. В нашем исследовании частота выявления Enterococcus faecalis составила 14 (18,4%) и 9 (15,5%), значимых различий при ПРПО и в контрольной группе мы не получили.
Streptococcus spp. выявлены в нашем исследовании у каждой пятой пациентки. Это условно-патогенный микроорганизм, который является естественным обитателем организма человека и локализуется преимущественно в кишечнике, носоглотке и влагалище. По данным центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC, 2018; Creti et al., 2013), в 30% случаев данный вид Streptococcus spp. колонизирует влагалище, что является вариантом нормы. Streptococcus spp. способствует развитию заболеваний лишь при определенных негативных условиях, ослабляющих иммунную защиту и снижающих общую резистентность организма.
Частота выявления Escherichia coli была одинаковой в обеих группах, составила около 6 (8,0%) при бактериологическом исследовании отделяемого цервикального канала. Наши результаты полностью подтверждают данные других исследований – 2,5–7% [16, 17]. Чаще всего эти микроорганизмы ассоциированы с заболеваниями мочевыводящих путей, описаны случаи неонатального сепсиса, особенно при сверхранних преждевременных родах. Анализ ПЦР в режиме реального времени позволяет идентифицировать семейство Еnterobacteriaceae, представители которого чаще наблюдались в контрольной группе – 8 (47,5%, р=0,08) случаев, тогда как в основной – лишь в 4 (18,2%) случаях (р=0,08; двусторонний точный критерий Фишера).
Отдельно необходимо выделить Raoultella ornithinolytica. В результатах бактериологических посевов в контрольной группе этот микроорганизм наблюдался достаточно часто в 8 случаях (13,8%) против 1 случая (1,3%), р=0,01. Косвенно его преобладание в контрольной группе можно подтвердить также благодаря анализу ПЦР в режиме реального времени – более частое выявление представителей семейства Еnterobacteriaceae. Raoultella ornithinolytica представляет собой грамотрицательную инкапсулированную аэробную палочку, которая содержится в водных средах, рыбе и насекомых, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae. Raoultella spp. включает Raoultella electrica, R. terrigena, R. planticola и R. ornithinolytica. В литературе описаны случаи бактериемии, вызванной R. terrigena, R. planticola и R. ornithinolytica, на которую приходится около 0,15% всех случаев бактериемии [18]. В 2018 г. описан первый случай раннего неонатального сепсиса, вызванного R. оrnithinolytica, полирезистентной к антибактериальной терапии [19], с летальным исходом. Что касается акушерских осложнений, доказана роль Raoultella ornithinolytica в реализации септических послеродовых осложнений [20]. Ряд исследователей склонны связывать низкую частоту выявления Raoultella spp. в группе с ПРПО с особенностями метаболизма этих микроорганизмов, приводящего к повышенной выработке гистамина у данного микроорганизма, что, в свою очередь, приводило к созреванию шейки матки и запуску родовой деятельности до момента излития околоплодных вод, а уже затем – изменению качественных характеристик плодных оболочек [21]. По этой причине ассоциация ПРПО и наличия в посевах Raoultella ornithinolytica отсутствует.
В целом большинство вышеперечисленных условно-патогенных микроорганизмов входят в список бактерий, ассоциированных с аэробным вагинитом (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli и вызванная Streptococcus Group B), и многочисленными работами продемонстрирована их связь с неблагоприятными исходами беременности [22, 23], такими как преждевременные роды, ПРПО, ранний неонатальный сепсис, хориоамниониты и послеродовые метроэндометриты.
Значимых различий в частоте выявления в обеих группах выявлено не было, на втором месте по частоте стоит Eubacterium spp., Megasphaera spp. + Veillonella spp. + Dialister spp.,на третьем – Mobiluncus spp. + Corynebacterium spp.
Интерес представляет распределение Atopobium vaginae в группах, так как он ассоциирован с диагнозом анаэробного дисбиоза. По данным исследований, Atopobium vaginae в III триместре беременности может встречаться в норме в небольших количествах – 103 [16]. По данным других работ, Atopobium vaginae является маркером дисбиоза влагалища, особенно если абсолютные цифры превышают 103 [24]. Наши данные перекликаются с результатами М.А. Власовой и соавт. [17], которые в своей работе подчеркивают доминирующую роль анаэробных микроорганизмов в структуре дисбиоза влагалища у женщин с ПРПО в сроке 26–34 недели беременности. Нами выявлена преобладающая роль анаэробных микроорганизмов, но только уже в цервикальном канале. По нашим данным, частота выявления Atopobium vaginae в цервикальном канале была практически одинаковой в группах, однако превышение ГЭ в образце наблюдалось только в основной группе. Выделение Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis было характерно также только для основной группы, что касается Ureaplasma (urealyticum + parvum), она выделена в обеих группах в количестве 103-4 практически в равных соотношениях.
Заключение
Таким образом, основываясь на результатах проведенных исследований, у пациенток с ПРПО чаще наблюдается дисбиоз влагалища по типу бактериального вагиноза. По результатам ПЦР в режиме реального времени ОБМ цервикального канала при ПРПО ниже, чем в группе контроля. Данный парадокс мы склонны связывать с антимикробным действием околоплодных вод и механическим смыванием микроорганизмов. Наблюдалось абсолютное и относительное снижение доли Lactobacillus spp. и повышение абсолютного и относительного числа облигатных анаэробных микроорганизмов, а также Mycoplasma spp. и Ureaplasma spp.
По результатам исследования, Raoultella ornithinolytica можно выделить как протекторный фактор для ПРПО, ее частота была значимо ниже в основной группе.
