Увеличение количества женщин репродуктивного возраста с резко возросшим уровнем доли жировой ткани в массе тела стало представлять собой глобальную медицинскую и социальную проблему [1]. Ожирение во время беременности связано с рядом серьезных неблагоприятных акушерских исходов, включая гестационный диабет, преэклампсию и задержку роста плода [2, 3].
Плаценты женщин с ожирением характеризуются изменением ряда функций из-за проявлений воспаления и окислительного стресса [4, 5]. В плаценте и других органах нормальный ангиогенез регулируют многие факторы, среди которых фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [6]. По данным сравнительного иммуногистохимического (ИГХ) изучения плаценты беременных с гестационным и сахарным диабетом 1-го типа, установлено повышение уровня экспрессии VEGF и его рецепторов (VEGFR-1, -2, -3) в терминальных и стволовых ворсинах плаценты, выраженное в большей степени при сахарном диабете 1-го типа [7]. Согласно [8], при развитии и нарастании тяжести преэклампсии методом ИФА были выявлены гестационный эндотелиоз и статистически значимое снижение VEGF в сыворотке крови пациенток.
Адипокины – группа сигнальных молекул, продуцируемых клетками жировой ткани, а также плацентой (например, оментин), которые с позитивным эффектом принимают участие в метаболических процессах и в организации плацентарного барьера. У родильниц с ожирением в терминальных ворсинах плаценты была изучена экспрессия лептина и адипонектина наряду с анализом метилирования ДНК [9]; авторами показано, что ожирение у беременных сопровождалось снижением содержания лептина и адипонектина в терминальных ворсинах плаценты и утратой необходимого полезного влияния данных адипокинов на развитие внезародышевого органа; кроме того, выявлены неблагоприятные эпигенетические изменения в системах лептина и адипонектина.
При сравнении 96 беременных женщин с гестационным диабетом и 96 – без патологии не было выявлено статистически значимых различий по содержанию в крови оментина-1; однако были установлены значительно более низкие уровни оментина-1 у потомков матерей с гестационным диабетом, что увеличивало риск развития инсулинорезистентности в более позднем возрасте [10].
Материнский адипонектин может быть важным предиктором роста и массы тела плода при рождении независимо от ИМТ и резистентности к инсулину [11]. В рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании эффектов метформина с 12–18 недель беременности до родов у не страдающих диабетом беременных женщин с ИМТ более 35 кг/м2 сообщалось, что метформин не оказывал значительного влияния на центиль массы тела при рождении, что было основным исходом и не снижало риск гестационного диабета [12].
В целом относительно роли адипокинов в нарушении репродуктивной функции у женщин с ожирением имеются «противоречивые и неоднозначные результаты, что приводит к необходимости проведения дальнейших исследований» [13].
Цель работы: у женщин с высоким ИМТ без сахарного диабета изучить содержание адипокинов в сыворотке крови в I триместре беременности и экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в плаценте в III триместре.
Материалы и методы
Проведено наблюдательное описательное одномоментное исследование 70 беременных женщин с ожирением (ИМТ до беременности более
30 кг/м2), родоразрешенных в сроке 37–41 недель живым плодом без асфиксии, с оценкой по шкале Апгар 7–8 баллов. Первую (1-ю) группу составили 24 женщины в возрасте 30,3 (0,5) года с ожирением I степени: ИМТ 31,88 (1,40), 2-ю – 24 женщины 30,0 (0,9) года с ожирением II степени: ИМТ 36,60 (1,07) и 3-ю – 22 женщины 33,5 (0,8) года с ожирением III степени: ИМТ 42,20 (1,90). Контрольная группа – 22 женщины 28,5 (0,7) года с нормальным ИМТ – 21,0 (1,88). Во всех четырех группах преобладали повторнородящие женщины. Критерии исключения: женщины с хронической артериальной гипертензией, гестационным диабетом, преэклампсией и иной сосудистой экстрагенитальной патологией. Пациентки подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с законодательством РФ и этическими принципами проведения медицинских исследований, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации с изменениями, принятыми на 59-й Генеральной ассамблее WMA (Сеул, Южная Корея, 2008). Исследование одобрено этическим комитетом НГМУ (протокол № 1 от 24.06.2019).
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Для исследования содержания адипокинов (адипонектина и оментина) в сроке беременности 8–9 недель из локтевой вены натощак забирали 10 мл крови в сухую пробирку и центрифугировали при 1500 rpm в течение 10 мин. Супернатант замораживали при -70°С в пластиковых пробирках. Исследования выполняли с помощью коммерческих тест-систем Human Adiponectin ELISA и The Ray Bio Omentin Enzyme Immunoassay EIA (Германия) по инструкциям производителей. Результаты ИФА регистрировали на вертикальном фотометре «Униплан» (Россия) при длине волны 450 нм. Для определения концентрации каждого из адипокинов в анализируемых образцах строили калибровочные графики по «средним» показателям оптической плотности каждого стандартного раствора.
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование
Изучали экспрессию VEGF на парафиновых срезах в плаценте у 6 случайно выбранных женщин каждой из 4 групп с помощью готовых к использованию кроличьих моноклональных антител (кат. № RM-9128-R7). Использовали набор UltraVision Quanto Detection System HRP (ThermoScientific) с диаминобензидином (DAB); ядра клеток докрашивали гематоксилином. Продукты ИГХ-реакции изучали в 15 полях зрения (т.е. 90 на группу) с максимально плотной локализацией ворсин с помощью микроскопа Axio Scope.A1 с фотокамерой AxioCam MRc5 и программой анализа изображения Zen blue (С. Zeiss) при увеличении 400, отдельно акцентируя внимание на суммарной экспрессии (VEGFСУММ), в синцитиотрофобласте (VEGFСТБ) и капиллярах плода (VEGFКАП ПЛОДА), которые выражали в мкм2.
Статистический анализ
Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (критический уровень значимости р< 0,05), используя программное обеспечение Microsoft Excel 2019 и MedCalc Statistical Software, version 18.9.1 (http://www.medcalc.org; 2018), с учетом нормального распределения данных (проверка осуществлялась с использованием критерия Шапиро–Уилка). Для оценки корреляции между экспрессией VEGF в структурных компартментах плаценты и адипокинов в крови с ИМТ использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (критерий Шапиро–Уилка для ИМТ: W=0,94; p<0,001). Количественные данные приведены в виде M (SD). Категориальные данные сравнивали с использованием критерия χ2. В случае множественных межгрупповых сравнений применяли поправку Бонферрони (критический уровень значимости для данного исследования – 0,008).
Результаты и обсуждение
У женщин с ожирением М (SD) индекса массы тела (ИМТ) составила в 1-й группе 31,51 (1,13) кг/м2, во 2-й – 36,70 (1,27) и в 3-й – 41,86 (1,89), что статистически значимо превышало показатель контрольной группы 20,90 (1,93) и отличалось при попарном сравнении групп с ожирением между собой (p<0,0001).
Содержание адипонектина в крови (в сроке беременности 8–9 недель) женщин контрольной группы составило 41,17 (20,86) мкг/мл, что статистически значимо превышало показатели каждой из групп с ожирением: 1-й группы (26,66 (13,90) мкг/мл, р=0,003), 2-й (26,93 (16,55) мкг/мл, р=0,003) и 3-й (17,41 (9,82) мкг/мл, p<0,0001). При попарном сравнении показатели 1-й группы превышали показатели 3-й (р=0,02) и 2-й группы – 3-й (р=0,03), однако 1-я и 2-я группы практически не различались между собой (р=0,95) (рис. 1).
С целью выявления закономерности между содержанием адипонектина в крови (на сроке 8–9 недель) и ИМТ был проведен корреляционный анализ. Статистически значимые результаты получены только у женщин 2-й и 3-й групп – с ожирением II и III степени (рис. 2): с нарастанием ИМТ содержание адипонектина снижалось. Коэффициент корреляции Спирмена rs=-0,46, р=0,003, 95% ДИ (-0,678;-0,171).
Содержание еще одного адипокина – оментина – в крови (на сроке 8–9 недель) женщин контрольной группы составило 346,49 (78,26) мкг/мл и статистически значимо не отличалось от 1-й группы (308,72 (110,88) мкг/мл, р=0,08), при этом средние значения и контрольной, и 1-й групп превышали показатели групп с ожирением: 2-й группы (179,63 (88,25), p<0,0001 при обоих сравнениях) и 3-й группы (191,16 (90,26) мкг/мл, p<0,0001 и р=0,0006, соответственно). При этом содержание оментина в крови женщин с ожирением II и III степени практически не отличалось, р=0,67 (рис. 3).
Выявлена умеренная отрицательная корреляция между ИМТ женщин всех 4 групп и содержанием оментина: rs=-0,565, p<0,0001 (рис. 4).
Анализ акушерских клинических показателей (таблица) выявил статистически значимые различия по массе плацент с постепенным уменьшением от контрольной группы до 3-й группы (беременные с самым высоким ИМТ).
В контрольной группе (табл.) отсутствовали клинические проявления хронической плацентарной недостаточности – задержка внутриутробного роста (ЗВУР) и хроническая гипоксия плода (ХГ). При этом по числу случаев ЗВУР во 2-й группе выявлены статистически значимые отличия с контрольной группой (р<0,05); кроме того, по показателю ХГ 2-я и 3-я группы отличались от контрольной (р<0,01).
У родильниц с ожирением при гистологическом исследовании образцов плаценты выявлены инволютивно-дистрофические изменения ворсин различной степени выраженности в сочетании с компенсаторно-приспособительными реакциями: развитыми синцитио-капиллярными мембранами, полнокровием сосудов, большим количеством хориальных симпластов, что можно расценивать как проявления клеточного типа адаптации [14]. Наряду с этим при морфометрическом исследовании увеличение ИМТ сопровождалось прогрессирующим снижением численной плотности капилляров в терминальных ворсинах плацент: в 1-й группе – в 2 раза, во 2-й группе – в 2,2 раза, в 3-й группе – в 2,5 раза по сравнению с показателем контрольной группы [15], что свидетельствует о редукции васкулогенеза.
При ИГХ-исследовании образцов плацент на сроке 37–41 недель отмечено варьирование экспрессии VEGF в терминальных и вторичных ворсинах с уменьшением DAB-позитивного окрашивания при прогрессировании ожирения, в т.ч. за счет большей выраженности атрофии и фиброза (рис. 5).
Изучение экспрессии VEGF в плаценте родильниц при помощи автоматического анализа изображения (рис. 6) выявило статистически значимое (р<0,0001) уменьшение площади DAB-позитивных зон у женщин с ожирением (508809 (228264) мкм2 в 1-й группе, 368556 (225529) мкм2 во 2-й и 349441 (148609) мкм2 в 3-й группе) по сравнению с контрольной группой (864662 (230605) мкм2), при этом 2-я и 3-я группы не различались между собой (р=0,46), имея меньшие показатели по сравнению с 1-й группой (р<0,0001).
При выделении зон плодовых капилляров и автоматической оценке в них площади экспрессии VEGF получены результаты, аналогичные особенностям суммарной экспрессии в 4 группах (рис. 7). Так, по сравнению с контрольной группой (311 810 (107 857) мкм2) выявлено статистически значимое (р<0,0001) уменьшение площади DAB-позитивных зон у родильниц с ожирением (114 607 (58 286) мкм2 в 1-й группе, 56906 (41221) мкм2 во 2-й и 51 531 (45571) мкм2 в 3-й группе), при этом 2-я и 3-я группы не имели различий между собой (р=0,50), но были меньше по сравнению с 1-й группой (р<0,0001).
Поскольку VEGF интенсивно экспрессировался в синцитиотрофобласте (рис. 5), были отдельно проанализированы закономерности его экспрессии, полученные при вычитании показателей каждого поля зрения:(VEGFСТБ=VEGFСУММ – VEGFКАП ПЛОДА). VEGFСТБ в контрольной группе (552 853 (208 553 мкм2) статистически значимо (р<0,0001) превосходил показатели каждой из групп родильниц с ожирением: 1-й группы (394 203 (200 193), 2-й (311 649 (193 567) и 3-й группы (297 910 (134 180) мкм2. При этом при этом 2-я и 3-я группы не имели различий между собой (р=0,54), но были меньше по сравнению с 1-й группой (р<0,001). Полностью аналогичные закономерности выявлены при изучении соотношения VEGFКАП ПЛОДА / VEGFСУММ .
В результате проведенного исследования также удалось установить умеренную отрицательную корреляцию во 2-й и 3-й группах с ожирением между ИТМ и экспрессией VEGF в капиллярах плода терминальных ворсин плаценты: rs=-0,67, p<0,0001, 95% ДИ (-0,786; -0,509) (рис. 8).
Ожирение II и III степени у беременных женщин способствует развитию плацентарной недостаточности, о чем свидетельствуют выявленные нами структурные изменения терминальных ворсин и фиброзные изменения вторичных ворсин по сравнению с контрольной группой и ожирением I степени (рис. 5). Ожирение беременной женщины без коморбидной патологии может быть причиной плацентарной недостаточности, поскольку в начале беременности прегравидарное ожирение способствует формированию системного воспаления на протяжении всей беременности со снижением общей «антиоксидантной емкости», не сопровождающейся при этом окислительным повреждением плаценты [16]. Высокие адаптационные возможности данного внезародышевого органа продемонстрированы при различных патологических процессах [17, 18].
По-видимому, в тех случаях, когда ожирение – единственное фоновое заболевание беременной, даже значительное снижение экспрессии VEGF в ворсинах плаценты не всегда приводит к плацентарной недостаточности, о чем свидетельствуют клинические данные (табл.).
Ранее показано, что экспрессия VEGF возрастала в плаценте женщин с гестационным диабетом и сахарным диабетом I типа, что расценивалось как компенсаторная реакция [7] в условиях гипоксии. VEGF в норме высоко экспрессирован в плаценте; как и в других тканях, данный фактор роста стимулирует рост, выживание и пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов. Механизм действия VEGF достаточно хорошо известен: в условиях гипоксии/ишемии ткани повышается продукция транскрипционного фактора HIF, который стимулирует высвобождение VEGF-A. Циркулирующий VEGF-A затем связывается с рецепторами VEGF на эндотелиальных клетках, активируя тирозинкиназу и молекулярные механизмы ангиогенеза. Наряду с этим, VEGF-A является вазодилататором (опосредованно, через повышение синтеза оксида азота) [19].
У женщин с артериальной гипертензией по сравнению со здоровыми родильницами при исследовании экспрессии VEGF в капиллярах плода и других компартментах плаценты статистически значимые различия не выявлены, при этом у женщин с артериальной гипертензией увеличена экспрессия VEGF в синцитиотрофобласте, так же как и количество синцитиальных узелков, что предложено рассматривать как маркер артериальной гипертензии у родильниц [14].
Полученные нами результаты – синхронное снижение экспрессии VEGF при нарастании степени ожирения беременных женщин, возможно, свидетельствует об изменении типа компенсаторно-приспособительных реакций плаценты, подавлении сосудистого типа адаптации (который считается наиболее эффективным) [20] с заменой его клеточным типом.
Таким образом, у беременных женщин с прегравидарным ожирением I–III степени без гестационного диабета выявлено позитивное влияние двух адипокинов сыворотки крови, оцениваемое с помощью ИФА в I триместре беременности: чем выше содержание адипонектина и оментина в I триместре, тем меньше клинически выражена некомпенсированная плацентарная недостаточность и экспрессия VEGF в терминальных ворсинах плаценты при срочных родах.
Согласно результатам нашего исследования, снижение содержания некоторых адипокинов в сыворотке крови в I триместре беременности, характерное для беременных женщин со II и III степенями ожирения, может служить предиктором снижения экспрессии VEGF в III триместре беременности у женщин с прегравидарным ожирением.
Заключение
У женщин с ожирением I–III степени при беременности 8–9 недель содержание адипонектина в крови статистически значимо снижено по сравнению с женщинами с нормальным ИМТ. По содержанию оментина женщины контрольной группы и с I степенью ожирения не отличались, но превосходили показатели женщин со II и III степенью ожирения. Содержание обоих адипокинов при II и III степени ожирения было минимальным и не различалось. Выявлена умеренная отрицательная корреляция между ИМТ женщин всех 4 групп и содержанием оментина в образцах крови.
При ИГХ исследовании на сроке 37–41 недель суммарная экспрессия VEGF в терминальных ворсинах плаценты и экспрессия в капиллярах плода у родильниц с ожирением была статистически значимо редуцирована по сравнению с показателями контрольной группы. При попарном сравнении в группах с высоким ИМТ наибольшая экспрессия VEGF установлена при ожирении I степени по сравнению со II и III, не различающимися между собой.
Таким образом, при сравнении женщин с прегравидарным ожирением различной степени выявлено, что снижение содержания адипонектина и оментина в I триместре беременности сопровождается редукцией экспрессии VEGF в плаценте в III триместре. Поэтому высокий ИМТ, начиная со II степени ожирения, даже без гестационного диабета, может рассматриваться как фактор риска развития плацентарной недостаточности.
