Особенности экспрессии эндогликозидазы в очагах аденомиоза у пациенток репродуктивного возраста с миомой тела матки

Маринкин И.О., Пивень Л.А., Соляников Д.А., Тимофеева Ю.С., Кулешов В.М., Соколова Т.М., Макаров К.Ю., Омигов В.В., Айдагулова С.В.

ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России, Новосибирск, Россия
Цель исследования. Изучить характер экспрессии гепараназы-1 (HPSE-1) и ее субстратов гепарансульфатов (HSP) в эутопическом и гетеротопическом эндометрии у пациенток репродуктивного возраста с аденомиозом и лейомиоматозом в зависимости от объема тела матки. Материал и методы. Проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии HPSE-1 и HSP в образцах операционного материала 48 пациенток. Пациентки разделены на 2 репрезентативные по возрасту группы, в зависимости от объема матки: 24 женщины – до 12 недель беременности и 24 – более 12 недель с быстро растущей миомой. Результаты. При объеме тела матки до 12 недель и более 12 недель в эутопическом эндометрии в пролиферативную фазу цикла уровень экспрессии HPSE-1 минимален – в единичных стромальных клетках. В очагах аденомиоза HPSE-1 экспрессируется в эпителии и субэпителиальных микрососудах, отрицательно коррелируя с экспрессией HSP; у пациенток с объемом тела матки более 12 недель экспрессия HPSE-1 значительно превышает показатели пациенток с объемом тела матки менее 12 недель (p<0,001), Заключение. Повышение активности HPSE-1 в гетеротопическом эндометрии сочетается с прогрессирующим характером лейомиоматоза и может способствовать инвазии эндометрия в миометрий с развитием аденомиоза.

Ключевые слова

аденомиоз
лейомиома
эндогликозидаза
иммуногистохимия
автоматический анализ изображения

Аденомиоз – гетеротопию эндометрия в миометрии – достаточно редко диагностируют до гистерэктомии, проводимой по поводу маточных кровотечений и анемии в связи с лейомиоматозом [1]. Однако при гистологическом изучении операционного материала в 30–50% клинических наблюдений находят очаги аденомиоза различной степени, характеризующиеся миграцией (или инвазией) эпителия и цитогенной стромы в миометрий [2, 3]. Способность к инвазии определяется пролиферативным и миграционным потенциалом патологических пролифератов эндометрия, а также свойствами микроокружения – клеток соединительной ткани миометрия и экстрацеллюлярного матрикса, компоненты которого ответственны за поддержание межклеточных контактов. Изменение этих двух параметров приводит к возможности инвазии ткани эндометрия за пределы эутопической локализации с развитием аденомиоза, сопровождающегося патологическими изменениями миоцитов и фибробластов, характеризующими также лейомиоматоз [4, 5]. В миоматозных узлах и перифокальном миометрии повышена активность металлопротеиназ-2 и 9 [6], что приводит к ослаблению межклеточных контактов.

Наряду с металлопротеиназами, в экстрацеллюлярном матриксе большинства тканей существует еще один значимый фермент, разрушающий межклеточные контакты, – гепараназа-1 (HPSE-1), которая является эндогликозидазой, расщепляющей углеводные молекулы гепарансульфатов (HSP) [7]. HSP протеогликаны являются базовыми компонентами внеклеточного матрикса, в котором они взаимодействуют с рядом физиологически важных макромолекул; при этом характер сульфатирования цепей HSP определяет потенциал взаимодействия протеогликанов и поддержание межклеточных контактов. Таким образом, ферментная деградация HSP с помощью HPSE-1 приводит к ослаблению межклеточных контактов и способствует миграционной активности клеточных элементов.

В связи с этим HPSE-1 как фермент деградации HSP является важным регулятором широкого спектра физиологических и патологических процессов, в том числе эмбрионального развития, тканевого гомеостаза, а также опухолевой трансформации и прогрессирования неопластических процессов [8, 9].

Высокая активность HPSE-1 установлена в клинических опухолевых образцах при аденокарциноме предстательной железы [10–12] и других злокачественных опухолях [13, 14]. Очень высокий уровень активности HPSE-1 был обнаружен в метастазах рака молочной железы в головном мозге; при этом ингибирование опосредованных HPSE-1 сигнальных путей способствовало повышению эффективности химиотерапии. Эти данные в совокупности с результатами других работ позволили рассматривать эндогликозидазу как одну из перспективных мишеней в комплексной противоопухолевой терапии [15, 16].

Таким образом, наличие гормонозависимого и спонтанного пролиферативного и проонкогенного потенциала эндо- и миометрия при аденомиозе и миоматозе [17, 18] обращает внимание к дальнейшему поиску регулирующих их формирование и развитие патогенетических факторов и прогностических биомаркеров.

Цель исследования – изучить характер экспрессии HPSE-1 и ее субстратов HSP в эутопическом и гетеротопическом эндометрии у пациенток репродуктивного возраста с аденомиозом и лейомиоматозом с учетом медленного и прогрессирующего развития миомы, оцениваемого по объему тела матки.

Материал и методы исследования

Проведено клинико-морфологическое исследование случай-контроль с акцентом на иммуногистохимическом изучении эндогликозидазной активности (по экспрессии HPSE-1) в эутопическом и гетеротопическом эндометрии 48 пациенток в возрасте от 25 до 45 лет (38,90±5,87 года) с клиническим диагнозом «симптомная миома тела матки». Диагноз установлен по данным ультразвукового исследования (УЗИ), предоперационной гистероскопии с раздельным лечебно-диагностическим выскабливанием, объективного обследования и интраоперационной картины. Аденомиоз верифицирован по результатам гистологического исследования операционного материала; во всех случаях установлена диффузная форма аденомиоза. Исследование одобрено комитетом по этике Новосибирской областной клинической больницы – клинической базы кафедры акушерства и гинекологии Новосибирского государственного медицинского университета.

Критериями включения в исследование были пациентки с диагностированными с помощью УЗИ миоматозными узлами и клиническими показаниями к хирургическому лечению, уровень ФСГ в крови менее 30 mМЕ/мл, а также информированное согласие пациентки. Среди клинических наблюдений были случаи с одной крупной лейомиомой или одной доминирующей и несколькими сравнительно меньшими опухолевыми узлами. Критерии исключения: терапия гормональными препаратами (по крайней мере, за 3 месяца до исследования) и неопластические процессы.

Пациентки разделены на 2 репрезентативные по возрасту группы, в зависимости от объема матки: 24 женщины – до 12 недель беременности (объем тела матки по УЗИ (226±92 мм3) и 24 – более 12 недель (1024±130 мм3) с быстро растущей миомой при динамическом наблюдении (увеличение объема на 4 недели в течение года) [19]. Опухолевые узлы были представлены I и II типом субсерозных, II типом субмукозных узлов и интерстициальной локализацией [20]. Оперативное лечение выполняли в плановом порядке на 7–12-й день (в течение фолликулярной фазы) менструального цикла.

Образцы операционного материала – эутопического эндометрия с миометрием, лейомиоматозных узлов и аденомиоза – фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2–7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта. Экспрессию HPSE-1 и HSP исследовали на парафиновых срезах толщиной 5 мкм с помощью двухшагового стрептавидин-биотинового иммуногистохимического метода, в качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к HPSE-1 («Abnova») в разведении 1:200 и к HSP («Serotec») в разведении 1:100; продукты реакции визуализировали с помощью диаминобензидина (DAB), срезы докрашивали гематоксилином. Для негативного контроля вместо первичных антител использовали 5% бычью сыворотку, в качестве позитивного контроля – препараты аденокарциномы предстательной железы. Площадь интра- и экстрацеллюлярных продуктов иммуногистохимической реакции оценивали с помощью микроскопа Axio Scope.A1 с фотокамерой AxioCam MRc5 и программного обеспечения ZEN blue (С.Zeiss), для каждого параметра оценивали по 30 изображений с увеличением 63×12.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных статистических программ Statistica v.6.0. Для оценки равенства дисперсий между независимыми выборками применяли критерий Фишера; для сравнения клинических показателей – парный критерий Вилкоксона; для сравнительной оценки DAB-позитивных продуктов иммуногистохимической реакции между группами – критерий Манна–Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты исследования

Объем тела матки, косвенно свидетельствующий о скорости прогрессирования патологического процесса, лег в основу деления пациенток на 2 группы, имеющие различия и в особенностях клинической картины (табл. 1). При отсутствии различий в возрасте пациенток и параметрах менструального цикла, у женщин 2-й группы объем матки достоверно превышал показатель 1-й группы (р=0,0008), и было снижено содержание гемоглобина в крови перед операцией (р=0,0235). Обращала на себя внимание тенденция более высокого индекса массы тела (ИМТ) и толщины М-эхо.

При клиническом обследовании пациенток с большим объемом матки (2-я группа, пролиферирующая миома, или прогрессирующий рост) чаще имел место болевой синдром, в анамнезе в 3 раза чаще – воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), обусловленные, в том числе более частыми искусственными прерываниями беременности. В отличие от 2-й группы, при объеме матки до 12 недель (1-я группа) выявлено в 4 раза больше случаев с патологией шейки матки (табл. 2).

Особенности клинической картины, характер поражения матки и репродуктивные планы пациенток обусловили выбор и объем хирургического вмешательства. В 1-й группе (объем матки до 12 недель) преобладали миомэктомии – 15 (62,5%) случаев, надвлагалищная ампутация матки – 6 (25%) и экстирпация матки – 3 (12,5%). В отличие от 1-й группы, во 2-й группе с интраоперационным объемом матки более 12 недель доминировала надвлагалищная ампутация матки – 18 (75%) наблюдений, и лишь 6 (25%) женщинам выполнены миомэктомии.

При светооптическом исследовании операционного материала пациенток 1-й группы с медленным ростом объема матки в большинстве случаев диагностирован аденомиоз 1-й степени (21 из 24 случаев), в 3 остальных – 2-й степени. У пациенток 2-й группы степень аденомиоза чаще была более выраженной: 1 степень – 15 женщин, 2-я – 6 и 3-я – 3 пациентки.

Во всех клинических наблюдениях обеих групп эутопический эндометрий соответствовал морфологии пролиферативной фазы цикла, из них в 25% случаев отмечены признаки хронического эндометрита; при этом у пациенток 2-й группы в некоторых наблюдениях структурные особенности расценивали как проявления железисто-кистозной гиперплазии эндометрия.

В отличие от эутопического эндометрия, для гистологии гетеротопий эндометрия, или очагов аденомиоза, в пролиферативную фазу цикла характерен выраженный полиморфизм эпителиального и стромального компартментов: плотность цитогенной стромы, форма и диаметр просветов желез резко варьировали; отмечена кистозная трансформация с атрофией эпителия.

По данным иммуногистохимического исследования парафиновых срезов, экспрессия HPSE-1 в эутопическом эндометрии в обеих группах пациенток в раннюю и среднюю стадии фазы пролиферации менструального цикла была очень слабой – практически отсутствовала в эпителии желез и отмечалась в единичных стромальных клетках (рис. 1). Интра- и экстрацеллюлярные продукты иммуногистохимической реакции на HPSE-1 составили 0,33±0,07% площади в эутопическом эндометрии женщин 1-й группы и 0,44±0,16% – 2-й группы; и соответственно, в очагах аденомиоза двух групп пациенток – 0,24±0,05% и 2,28±0,9% (p<0,001).

Это согласуется с результатами X. Xu и соавт. [21], которые показали, что у пациенток с генитальным эндометриозом положительная реакция на HPSE-1 имела место в железистых и стромальных клетках образцов эутопического эндометрия, полученных в позднюю стадию фазы пролиферации, а также в раннюю, среднюю и позднюю стадии фазы секреции. С помощью методов статистического анализа (критерий Фишера) авторами установлено, что экспрессия HPSE-1 в секреторную фазу была достоверно выше, чем в раннюю и среднюю фазы стадии пролиферации, но недостоверно выше, чем в позднюю фазу пролиферации. В наших наблюдениях в очагах аденомиоза при медленном росте объема матки (до 12 недель) в 1-й группе экспрессия HPSE-1 также была минимальной, но при прогрессирующем росте миомы (2-я группа) – повышена в несколько раз.

При анализе результатов иммуногистохимического исследования экспрессии HPSE-1 в эутопическом эндометрии и очагах аденомиоза возникает вопрос, как эти различия согласуются с содержанием HSP – субстрата фермента HPSE-1. При изучении срезов с помощью специфических антител на углеводные цепи HSP установлено, что содержание DAB-позитивных продуктов реакции на HSP обратно пропорционально экспрессии HPSE-1 (рис. 2) и характеризуется минимальными показателями в очагах аденомиоза во 2-й группе – при прогрессирующем росте миом с большим объемом матки. Так, % площади экспрессии HSP в ткани эутопического эндометрия пациенток 1-й группы составил 7,92±2,8 и у пациенток 2-й группы – 8,64±3,88; в очагах аденомиоза обеих групп – 3,76±1,29% и 2,02±0,9% соответственно.

Таким образом, в очагах аденомиоза HPSE-1 экспрессируется в эпителии и субэпителиальных микрососудах, и при пролиферирующем характере роста миомы с объемом тела матки до 12 недель экспрессия HPSE-1 достоверно превышает уровень 2-й группы (p<0,001), что характеризуется негативной корреляцией экспрессии HSP (рис. 3). Это подтверждает важную роль HPSE-1 в деградации HSP и изменении микроокружения, в том числе свойств экстрацеллюлярного матрикса. Одновременно с этим, обращают на себя внимание аналогичные пролиферативные свойства и клеточных популяций миометрия в этой группе пациенток.

При объеме матки до 12 недель (1-я группа) при гистологическом исследовании операционного материала обнаружены лейомиомы различного диаметра, хорошо ограниченные, соответствующие по классификациям [2, 19] простым миомам. Опухолевые узлы представлены переплетающимися пучками цитологически монотонных гладкомышечных клеток с умеренно эозинофильной цитоплазмой и удлиненными ядрами без атипии и митотической активности, окруженных прослойками стромы с сосудами, матрикс-продуцирующими клетками и коллагеновыми волокнами. На поперечных срезах в небольшом числе случаев отмечена перинуклеарная оптическая прозрачность цитоплазмы опухолевых миоцитов. В 5 субмукозных лейомиомах выявлены фокусы некроза, организующегося с участием грануляционной ткани с большим числом сидерофагов.

У пациенток 2-й группы доминирующий и более многочисленные мелкие узлы характеризовались типичной структурой, однако у 17 из 24 пациенток отмечена повышенная «клеточность» лейомиоматозных узлов по сравнению с нормальным миометрием и с простыми миомами, что соответствовало гистологии пролиферирующей миомы. Клетки с эухромными овальными или удлиненными ядрами и скудной цитоплазмой формировали плотные пучки и были ассоциированы с крупными толстостенными сосудами, а также сосудами типа синусоидов и плотной периваскулярной мононуклеарной клеточной инфильтрацией. На периферии узлов опухолевые клетки незаметно интегрировались с окружающим миометрием.

Заключение

В очагах аденомиоза пациенток репродуктивного возраста с прогрессирующим ростом миоматозных узлов и объемом тела матки более 12 недель экспрессия HPSE-1 достоверно превышает соответствующие показатели пациенток с медленным ростом миомы и объемом матки до 12 недель. Сравнительный иммуногистохимический анализ эутопического и гетеротопического эндометрия демонстрирует отрицательную корреляцию между экспрессией HPSE-1 и ее субстратов HSP и свидетельствует о важной роли эндогликозидазной активности в изменениях экстрацеллюлярного матрикса миометрия при прогрессировании сочетанной патологии матки – адено- и лейомиоматоза.

Список литературы

1. Horng H.C., Chen C.H., Chen C.Y., Tsui K.H., Liu W.M., Wang P.H. et al. Uterine-sparing surgery for adenomyosis and/or adenomyoma. Taiwan J. Obstet. Gynecol. 2014; 53(1): 3-7. doi: 10.1016/j.tjog.2014.01.001.

2. Гуриев Т.Д., Сидорова И.С., Унанян А.Л. Сочетание миомы матки и аденомиоза. М.: МИА; 2012. 256с.

3. Taran F.A., Weaver A.L., Coddington C.C., Stewart E.A. Characteristics indicating adenomyosis coexisting with leiomyomas: A case – control study. Hum. Reprod. 2010; 25(5): 1177-82.

4. Bondza P.K., Maheux R., Akoum A. Insights into endometriosis-associated endometrial dysfunctions: a review. Front. Biosci. (Elite Ed). 2009; 1: 415-28.

5. Mehasseb M.K., Taylor A.H., Pringle J.H., Bell S.C., Habiba M. Enhanced invasion of stromal cells from adenomyosis in a three-dimensional coculture model is augmented by the presence of myocytes from affected uteri. Fertil. Steril. 2010; 94(7): 2547-51. doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.04.016.

6. Yang J.H., Wu M.Y., Chen M.J., Chen S.U., Yang Y.S., Ho H.N. Increased matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 secretion but unaffected invasiveness of endometrial stromal cells in adenomyosis. Fertil. Steril. 2009; 91(Suppl. 5): 2193-8. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.05.090.

7. Vlodavsky I., Ilan N., Naggi A., Casu B. Heparanase: structure, biological functions, and inhibition by heparin-derived mimetics of heparan sulfate. Curr. Pharm. Des. 2007; 13(20): 2057-73.

8. Theocharis A.D., Skandalis S.S., Tzanakakis G.N., Karamanos N.K. Proteoglycans in health and disease: novel roles for proteoglycans in malignancy and their pharmacological targeting. FEBS J. 2010; 277(19): 3904-23.

9. Iozzo R.V., Sanderson R.D. Proteoglycans in cancer biology, tumour microenvironment and angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 2011; 15(5): 1013-31.

10. Кунин И.С., Бобоев М.М., Куценко О.С., Мостович Л.А., Айдагулова С.В., Григорьева Э.В. Молекулярные маркеры метастазирования аденокарциномы предстательной железы. Онкоурология. 2012; 4: 44-8.

11. Suhovskih A.V., Mostovich L.A., Kunin I.S., Boboev M.M., Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Grigorieva E.V. Proteoglycan expression in normal human prostate tissue and prostate cancer. ISRN Oncology. 2013; Article ID 680136. doi: 10.1155/2013/680136.

12. Suhovskih A.V., Tsidulko A.Y., Kutsenko O.S., Kovner A.V., Aidagulova S.V., Ernberg I., Grigorieva E.V. Transcriptional activity of heparan sulfate biosynthetic machinery is specifically impaired in benign prostate hyperplasia and prostate cancer. Front. Oncol. 2014; 4: 79. eCollection 2014.

13. Barash U., Cohen-Kaplan V., Dowek I., Sanderson R.D., Ilan N., Vlodavsky I. Proteoglycans in health and disease: new concepts for heparanase function in tumor progression and metastasis. FEBS J. 2010; 277(19): 3890-3. doi: 10.1111/j.1742-4658.2010.07799.x.

14. Zhang X., Xu S., Tan Q., Liu L. High expression of heparanase-2 is an independent prognostic parameter for favorable survival in gastric cancer patients. Cancer Epidemiol. 2013; 37(6): 1010-3. doi: 10.1016/j.canep.2013.09.012.

15. Pisano C., Vlodavsky I., Ilan N., Zunino F. The potential of heparanase as a therapeutic target in cancer. Biochem. Pharmacol. 2014; 89(1): 12-9. doi: 10.1016/j.bcp.2014.02.010.

16. Zhang L., Ngo J.A., Wetzel M.D., Marchetti D. Heparanase mediates a novel mechanism in lapatinib-resistant brain metastatic breast cancer. Neoplasia. 2015; 17(1): 101-13.

17. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. Миома матки. М.: МИА; 2006. 176с.

18. Verit F.F., Yucel O. Endometriosis, leiomyoma and adenomyosis: the risk of gynecologic malignancy. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2013; 14(10): 5589-97.

19. Подзолкова Н.М., Коренная В.В., Колода Ю.А. Миома матки. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2015. 160с.

20. Кулаков В.И., Савельева Г.М., Манухин И.Б., ред. Гинекология. Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2009. 1088с.

21. Xu X., Ding J., Rao G., Shen J., Prinz R.A., Rana N., Dmowski W.P. Estradiol induces heparanase-1 expression and heparan sulphate proteoglycan degradation in human endometrium. Hum. Reprod. 2007; 22(4): 927-37. doi: 10.1093/humrep/del483.

Поступила 26.04.2016

Принята в печать 27.05.2016

Об авторах / Для корреспонденции

Маринкин Игорь Олегович, д.м.н., профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии, ректор ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 222-32-04. E-mail: rector@ngmu.ru
Пивень Людмила Анатольевна, к.м.н., доцент кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 315-98-65. E-mail: ludmilapiv@yandex.ru
Соляников Дмитрий Александрович, ассистент кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 315-98-65. E-mail: solyanikovda@gmail.com
Тимофеева Юлия Сергеевна, ординатор кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 315-98-65. E-mail: julie_srg@mail.ru
Кулешов Виталий Михайлович, д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 341-04-36. E-mail: kuleshov_vm@mail.ru
Соколова Татьяна Михайловна, д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 315-98-65. E-mail: tatyana3965@mail.ru
Макаров Константин Юрьевич, д.м.н., доцент кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 222-93-12. E-mail: fdpngma@mail.ru
Омигов Владимир Вилорьевич, к.м.н., научный сотрудник лаборатории клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 226-35-60. E-mail: omigov@vector.nsc.ru
Айдагулова Светлана Владимировна, д.б.н., профессор, зав. лабораторией клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон: 8 (383) 226-35-60, 8 (913) 909-22-51. E-mail: a_sv@ngs.ru

Для цитирования: Маринкин И.О., Пивень Л.А., Соляников Д.А., Тимофеева Ю.С., Кулешов В.М., Соколова Т.М., Макаров К.Ю., Омигов В.В., Айдагулова С.В. Особенности экспрессии эндогликозидазы в очагах аденомиоза у пациенток репродуктивного возраста с миомой тела матки. Акушерство и гинекология. 2016; 11: 79-85.
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.11.79-85

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.