Основную функцию РНК определяли в роли мессенджеров между генами ДНК и функциональными единицами клетки. Примерно 20 лет назад были выделены небольшие некодирующие РНК, которые получили название микроРНК – регуляторные РНК без какого-либо белок-кодирующего потенциала. Были открыты многие новые классы нормативного кодирования РНК, включая эндогенные мелкие интерферирующие РНК (эндо-сиРНК), PIVI-ассоциированные РНК (пиРНК) и длинные некодирующие РНК. Их значимость была определена во многих биологических процессах экспрессии, биогенеза, функции, механизмов и способов действия [1].
Проведено множество исследований и выделено более 35 000 микроРНК. Создана специальная база miRBase, в которой опубликованы все известные микроРНК, распределенные по видовой принадлежности.
МикроРНК способны регулировать трансляцию и/или деградацию матричных РНК (мРНК), снижая или усиливая синтез белков, которые кодируются мРНК [1], обеспечивая регуляцию экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Эта функциональная способность микроРНК расценивается с позиции биологических маркеров различных патологических процессов, в том числе опухолей. Интерес представляет изучение профиля микроРНК, участвующих в регуляции процессов репродуктивной системы и функции яичников.
Исследование экспрессии микроРНК при раке яичников имеет большое значение для практической медицины, на эту тему в современной литературе представлено большое количество оригинальных исследований и обзорных статей [1]. Однако микроРНК при нарушениях фертильности у женщин изучены в меньшей степени, исследования в этой области науки разноплановы и не структурированы. В статье приведены результаты опытов, которые позволяют получить данные о функциональных возможностях микроРНК, участвующих в стероидогенезе и фолликулогенезе яичников и при развитии синдрома преждевременной овариальной недостаточности (ПОН).
Синдром ПОН характеризуется преждевременным прекращением функции яичников, что приводит к развитию гипергонадотропной аменореи у женщин в возрасте до 40 лет. Триггер патологии в настоящее время не выявлен. ПОН относят к гетерогенным заболеваниям [2]. Генетические причины обнаруживаются у 20–25% женщин с ПОН. Подход с выявлением генов-кандидатов основан на изучении экспрессии и функции гена в течение фолликулогенеза или развития яичников на экспериментальных моделях или культуре клеток. За последние десятилетия установлено множество генов-кандидатов, но только несколько из них заслуживают внимания с позиции функциональной валидации [3]. К ним относят гены, связанные с миграцией и пролиферацией первичных зародышевых клеток (NANOS3), гибелью клеток (PGRMC1 и FMR1), специфическими факторами транскрипции ооцитов (FIGLA и NOBOX), другими факторами транскрипции, влияющими на фолликулогенез (NR5A1, WT1 и FOXL2), суперсемейством трансформирующих факторов роста (BMP15 и GDF9), и гены, кодирующие рецепторы к половым стероидам (FSHR, AMH и AMHR2).
В 6–13% случаев ПОН встречают премутацию гена FMR1, что связывают с повышенным риском развития патологии [2]. FMR1-белок экспрессируется в больших количествах в стволовых клетках яичников у плода, в клетках гранулезы зрелых фолликулов. Он представляет собой РНК-связывающий протеин, который оказывает супрессивное действие на трансляцию подмножества мРНК, избыточная экспрессия которого может ухудшить экспрессию генов развития ооцитов, что приводит к уменьшению размера исходного фолликулярного пула и формированию ПОН [4]. Также было высказано предположение, что накопление мутированной мРНК может оказывать долгосрочное токсическое действие на яичник и приводить к избыточной атрезии фолликулов [5].
Считают, что рекрутирование примордиальных фолликулов в основном контролируется паракринной взаимосвязью между ооцитом, фолликулярным эпителием, соседними текальными и интерстициальными клетками. Инициация роста примордиальных фолликулов и их дифференцировка в первичные фолликулы зависит от экспрессии ооцит-специфичных генов, которые регулируются специфическими факторами транскрипции [6]. При исследовании факторов транскрипции, участвующих в фолликулогенезе, были идентифицированы некоторые мутации, приводящие к формированию ПОН, в генах NR5A1, NOBOX, FIGLA и FOXL2 [7, 8].
NR5A1 известен как стероидогенный фактор 1, относящийся к ранней дифференцировке гонад [8, 9], модулирующий стероидогенез посредством регуляции генов, участвующих в функционировании гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси, таких как STAR, CYP11A1, CYP17A1, CYP19A1, LH и INH. Нокаут в гене NR5A1 у мышей вызывает бесплодие в связи с развитием гипоплазии яичников и снижением количества ооцитов. У пациентов с ПОН дефект в гене NR5A1 приводит к нарушению фолликулогенеза [10].
NOBOX и FIGLA кодируют транскрипционные факторы ооцита, которые регулируют ооцит-специфичные гены, необходимые на ранних стадиях фолликулогенеза [11]. Полагают, что NOBOX регулирует экспрессию различных генов, специфичных для ооцитов, включая BMP-15 и GDF-9. Нокаут NOBOX у мышей приводит к постнатальной потере ооцитов [11]. FIGLA регулирует экспрессию генов блестящей зоны, поэтому нокаут этого гена у мышей также приводит к постнатальной потере примордиальных фолликулов. Мутации генов NOBOX и FIGLA были выявлены у небольшой части женщин с ПОН в некоторых исследованиях [12], поэтому был сделан вывод, что данный вид мутации встречается нечасто.
Ген FOXL2 экспрессируется главным образом в клетках гранулезы в период эмбриогенеза и весь репродуктивный период, отвечая за их дифференцировку. При нокауте гена у мышей возникают нарушения дифференцировки клеток гранулезы, что приводит к истощению примордиальных фолликулов. Мутации в гене FOXL2 могут быть связаны с развитием идиопатической формы ПОН [13].
SOHLH 1 и 2 вида экспрессируются исключительно в примордиальных фолликулах до стадии первичного фолликула и являются главными регуляторами ооцит-специфичных генов на стадии раннего фолликулярного роста и дифференцировки, включая гены NOBOX, FIGLA, BMP-15, GDF-9 [6]. При нокауте двух видов SOHLH у мышей возникали идентичные изменения в яичниках, приводящие к их атрофии в результате нарушения дифференцировки фолликулов [14]. При исследовании генетического материала женщин с ПОН также были выявлены гетерогенные варианты гена [15], однако необходимы исследования в разных этнических группах для установления причинно-следственных связей SOНLH 1 и 2 вариантов с ПОН.
BMP-15 является членом надсемейства трансформирующего фактора роста β (TGF-β), который кодирует ооцит-специфический фактор роста и дифференцировки, участвует в фолликулогенезе, способствует созреванию фолликулов, регулируя дифференцировку и пролиферацию клеток гранулезы. В модели на нокаутированных мышах по гену BMP-15 отмечено нарушение процессов овуляции [16]. Предполагают, что дефект в гене BMP-15 может приводить к изменению сигнализации клеток гранулезы и торможению процессов антиапоптоза, что приводит к ускорению атрезии фолликулов [16].
Ген GDF-9 – гомолог BMP-15, также относится к членам надсемейства TGF-β и выполняет те же функции. Кроме того, GDF-9 относят к генам, способным модулировать чувствительность клеток гранулезы к фолликулостимулирующему гормону (ФСГ) [17]. Нокаутированные мыши по гену GDF-9 полностью бесплодны. В отношении связи мутации генов BMP-15 и GDF-9 и ПОН достоверных исследований не существует, однако некоторые варианты мутаций этих генов встречаются у женщин с ПОН [17].
INHA кодирует α-субъединицу ингибина А и ингибина B, которые вместе со своими β-субъединицами представляют класс димерных гликопротеинов, принадлежащих также к надсемейству TGF-β. Ингибины, как известно, синтезируются в клетках гранулезы и контролируют работу гипофиза путем подавления синтеза ФСГ. Снижение синтеза ингибина приводит к увеличению выработки ФСГ, что в конечном итоге ведет к истощению фолликулярного пула. Женщины с идиопатической формой ПОН имеют более низкие значения концентрации ингибинов и более высокие концентрации ФСГ, чем фертильные женщины [18]. Исследования генетического материала женщин с ПОН выявили три полиморфизма гена [18]. Однако, по аналогии с геном SOLH 1 и 2 варианта, необходимы исследования в разных этнических группах для выявления значимости влияния полиморфизма гена на формирование ПОН.
Стероидзависимая фаза фолликулогенеза напрямую зависит от качества рецепторов ФСГ и лютеинизирующего гормона (ЛГ) (FSHR и LHR) и их лигандов. ФСГ, связываясь со своим рецептором, расположенным на поверхности клеток гранулезы малых антральных фолликулов, вызывает их активацию, синтез эстрадиола и рост фолликула. ЛГ участвует в созревании ооцита, стероидогенезе и овуляции. Были идентифицированы мутации в генах FSHR и LHR у женщин с ПОН. Однако для развернутой клинической картины ПОН мутации в генах должны быть выражены настолько, чтобы полностью вызывать резистентность к гонадотропинам, что встречается крайне редко. Обычно резистентность рецепторов к гонадотропинам не выражена, приводит к периодическим ановуляциям, иногда с появлением симптома олигоменореи [4].
ESR1- и ESR2-рецепторы к эстрогенам 1 и 2 являются лиганд-зависимыми и расположены на поверхности клеток гранулезы, регулируют экспрессию различных генов, участвующих в росте и пролиферации. Сигнализация эстрогенами поддерживает ФСГ-индуцированный фолликулярный рост (регулирует активность ФСГ, ингибирует апоптоз фолликулов) [19]. Нокаут мышей по гену рецептора ESR1 позволяет отследить потерю фертильности в результате отсутствия возможности роста фолликулов до антральной стадии, что проявляется наличием большого количества в яичниках атретических фолликулов. При исследовании женщин с ПОН в отношении генов к рецепторам эстрогенов однозначных заключений сделано не было, лишь установлена связь с повышенным риском формирования ПОН [20].
Первые исследования, посвященные изучению микроРНК в соматических клетках яичника и роли фермента Dicer1 в его продукции, были проведены Richards и соавт. (2002) [21]. Так, удаление фермента Dicer1 у экспериментальных животных приводило к бесплодию, преимущественно вызванному изменением среды в пределах маточной трубы и матки, влияющим на жизнеспособность эмбриона [22]. Кроме того, Hong и соавт. [22] наблюдали заметное ухудшение показателей овуляции в естественном цикле.
Lei и соавт. (2010 г.) установили важную роль сигнального пути микроРНК, регулируемого Direc1, в развитии фолликулов у мышей. Гены, в том числе 17-альфа-гидроксилазы (Cyp17A1), ароматазы (Cyp19A1), GDF-9 и BMP-15, среди прочих, были дифференциально выражены в условном нокауте [23]. В этом исследовании также оценивали экспрессию микроРНК-503, которая уменьшалась у нокаутированных мышей и временно восстанавливалась после стимуляции гонадотропином [23]. Однако специфическая роль для микроРНК-503 в функции яичника не была установлена.
В альтернативном подходе Otsuka и соавт. (2008) использовали гипоморфный аллель Dicer1 для глобального истощения Dicer1 до ~20% нормального уровня у мышей [24]. У животных выявлялось бесплодие, в желтом теле уменьшалась васкуляризация и сокращалось производство прогестерона.
Эти исследования указывают на то, что поддержание биодоступности микроРНК внутри гранулезы и лютеиновых клеток имеет значение для фолликулогенеза, овуляции и лютеиновой функции.
Дополнительные доказательства для микроРНК-опосредованной посттранскрипционной регуляции генов в качестве контроля над функцией яичников получены из ряда исследований, в которых изучали специфическую экспрессию микроРНК в ткани (фолликулярной и лютеиновой) или клеточной культуре (гранулеза) на разных стадиях развития фолликулов, в разные фазы менструального цикла или во время беременности. Было показано, что микроРНК может изменять свои модели экспрессии в зависимости от стадии развития фолликулов [25–27].
Yao и соавт. (2009) изучили небольшое подмножество микроРНК с низкой экспрессией в примордиальных фолликулах и выраженной экспрессией в первичных фолликулах, включая let-7a, микроРНК-125b и микроРНК-143 [25]. Целью исследования было доказать, что экспрессия микроРНК регулируется ФСГ. Для этого клеточную линию яичников (KK1) обрабатывали ФСГ на 6, 12, 24 и 48 ч и оценивали экспрессию микроРНК. Было установлено, что уровень экспрессии микроРНК-143 был значительно снижен в клеточных культурах, обработанных ФСГ, в отличие от необработанных клеток, тогда как уровень экспрессии let-7a и микроРНК-125b, наоборот, увеличивался [25], что предполагает гормонзависимую экспрессию микроРНК. Однако степень гормональной регуляции микроРНК в клетках гранулезы и их роль при овуляции и лютеинизации остаются неизвестными.
Yao и соавт. (2010) исследовали влияние TGF-β1, участвующего в процессах роста и развития фолликулов, и экспрессию микроРНК в гранулезе преантральных фолликулов [26]. Было выявлено усиление экспрессии микро-РНК-712, микроРНК-224 и микроРНК-764- 3с. Также было показано, что участвующая в регуляции пролиферации гранулезы микроРНК-224 может способствовать высвобождению эстрадиола из клеток гранулезы за счет увеличения уровней мРНК CYP19A1 (ароматазы) [26]. Таким образом, в клетках яичника интраовариальные факторы могут координировать экспрессию микроРНК.
Yao и соавт. показали, что экспрессия микро-РНК-224 регулируется путем TGF-β 1/SMADS. Повышение экспрессии микроРНК-224 может усилить TGF-индуцированную пролиферацию клеток гранулезы и способствовать высвобождению эстрадиола при переходе от преантральной к ранней антральной стадии (in vitro) [26]. В другом экспериментальном исследовании было представлено, что инъекция в полость фолликула микроРНК-224 снижает экспрессию PTX-3 и нарушает овуляцию, что приводит к снижению числа участков имплантации [28]. Это исследование предполагает новые методы лечения бесплодия, связанные с нарушением овуляции и создание новых методов контрацепции.
Антимюллеров гормон (AMH) является членом подсемейства TGF-β и имеет решающую роль в тестикулярной и яичниковой функциях. В клинической практике AMH используется как маркер овариального резерва. Hayes E. и соавт. [29] на экспериментальной модели продемонстрировали, что действие AMH опосредовано индукцией микроРНК-181a и микроРНК-181b, которые регулируют передачу сигналов ФСГ и фолликулярный рост, влияя на последующую экспрессию гена AMH. Необходимы дальнейшие исследования, позволяющие подтвердить представленную роль микроРНК-181а in vivo.
Анализ биоинформации выявил наличие нескольких микроРНК-сайтов распознавания в пределах 3›UTR гена ароматазы у свиньи. Экспрессия микроРНК-378 в малых (1–3 мм) фолликулах была примерно в два раза больше, чем в больших (3–6 мм) фолликулах [30]. Чтобы определить, действительно ли микроРНК-378 способна непосредственно регулировать экспрессию ароматазы, in vitro, Xu и соавт. [30] сверхэкспрессировали микроРНК-378 в клетках гранулезы, выделенных из малых и больших фолликулов, и установили, что микроРНК-378 посттрансляционно снижает экспрессию ароматазы и, как следствие, синтез эстрадиола в клетках гранулезы. Таким образом, была установлена роль микроРНК-378 в фолликулогенезе. Toms D. и соавт. [31] показали, что микроРНК-378 может влиять на созревание ооцита посредством подавления экспрессии генов, связанных с его ростом и развитием (HAS2, PTGS2, CX43, ADAMTS1, PGR), что приводило к уменьшению экспрессии GDF-9, BMP-15, zona pellucida 3 (ZP3) и CX37 в ооцитах.
Yin и соавт. [32] в исследовании на мышах обнаружили, что микроРНК-383 в основном выражена в клетках гранулезы и ооцитах. Сверхэкспрессия микроРНК-383 позволила выявить, что она ингибирует RBMS1 (одноцепочечный взаимодействующий белок-1), влияя на его устойчивость к мРНК. Принудительная экспрессия RBMS1 ослабляет микроРНК-383-опосредованный эффект, способствующий стероидогенезу. Нокдаун SF-1 (стероидогенного фактора-1) угнетает экспрессию гена-хозяина микроРНК-383, что указывает на транскрипционную регуляцию микроРНК SF-1. Также SF-1 участвует в регуляции высвобождения эстрадиола микроРНК-383 и RMBS1 из клеток гранулезы. Это исследование раскрывает уникальную роль для микроРНК-383 в посредничестве фактора SF-1 и синтезе эстрадиола клетками гранулезы [32].
Активины, которые синтезируются яичником, важны для развития фолликулов и поддержания фертильности, способствуют росту преантральных фолликулов и пролиферации клеток гранулезы. Zhang и соавт. [33] на культуре клеток гранулезы яичников мыши показали, что подавление экспрессии микроРНК-181а зависит от дозы и времени обработки активином А. Чрезмерная экспрессия микроРНК-181a в культуре клеток приводила к уменьшению пролиферации клеток гранулезы путем прямого связывания с 3›UTR рецептором активина IIA (Acvr2a) мРНК, с последующим ингибированием клеточной пролиферации [33]. Кроме того, в фолликулах у мыши экспрессия микроРНК-181a снижалась по мере прогрессирования от примордиальных, преантральных до антральных стадий. По мнению Zhang Q. и соавт., результаты исследований свидетельствуют о том, что микроРНК-181а может ингибировать пролиферацию клеток гранулезы и развитие фолликулов в яичниках in vivo на посттранскрипционном уровне. Подтверждение своей гипотезы исследователи наблюдали в небольшой выборке пациентов с ПОН, в сыворотке крови которых микроРНК-181a была увеличена в 4,5 раза [33].
Yan и соавт. показали, что микроРНК-145 непосредственно регулирует экспрессию рецептора 1 активина, ингибирует пролиферацию клеток гранулезы у мышей [34], и в дальнейшем было установлено, что данная микроРНК способна регулировать развитие примордиальных фолликулов у мышей [35].
В клетках гранулезы мышей до и после овуляторной дозы хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) были определены десять микроРНК с уменьшенной экспрессией (miR-483, miR-491, miR-484, miR-329, miR-433-3p, miR-532, miR-431, miR-672, miR-99b и miR-351) и три микроРНК с увеличенной экспрессией (miR-132, miR-212 и miR-21) [27]. Было продемонстрировано, что гормоны могут иметь in vivo влияние на уровень экспрессии микроРНК, и выдвинута гипотеза, что микроРНК-212 и микроРНК-132 могут играть ключевую роль в регуляции транскрипции генов в клетках овариальной гранулезы.
МикроРНК-21 играет физиологическую роль при функционировании яичников [27, 36]. Анализ экспрессии на протяжении всего периовуляторного периода (период времени между началом стимуляции ЛГ/ХГЧ и овуляции) у мышей показал, что ЛГ транскрипционно регулируется pri-miR-21 [36]. Кроме того, комплементарные блокированные нуклеиновые кислотные олигонуклеотидные ингибиторы микроРНК-21 были способны индуцировать апоптоз. Было показано, что потеря активности микроРНК-21 in vivo у мышей, подвергающихся стимуляции яичников, вызвала значительное подавление овуляции, по сравнению с группой контрольных животных [36].
Была предположена функция микроРНК-143 в регуляции сигналов TGF-B и FSHR и регуляции апоптоза и атрезии фолликулов [37]. Кроме того, Zhang J. и соавт. [38] установили, что микроРНК-143 у мышей способна ингибировать пролиферацию клеток прегранулезы в примордиальных фолликулах и снижать регуляцию экспрессии генов, связанных с клеточным циклом, что имеет решающее значение для определения овариального резерва яичников.
Wang C. и соавт. [39], исследовав микроРНК-125a-5p, определили, что ее сверхэкспрессия усиливает апоптотические изменения в клетках гранулезы у мышей, и предположили, что роль данной микроРНК может быть важной в патогенезе ПОН.
Интерес представляют исследования, в которых изучали экспрессию микроРНК-23a в сыворотке крови у пациентов с ПОН. Влияние микроРНК-23a на апоптоз клеток гранулезы изучалось путем выявления экспрессии X-связанного ингибитора белка апоптоза (XIAP) и каспазы-3 с последующим подсчетом апоптотических клеток после окрашивания [40]. При этом у пациенток с ПОН в плазме крови определялся высокий уровень микроРНК-23а.
Lin и соавт. [41] сравнили экспрессию микроРНК в свиных фолликулах и определили, что микроРНК-26b значимо повышен в атретических фолликулах. Авторы представили, что мутантный ген атаксии телеангиэктазии (Atm), участвующий в репарации ДНК, был прямой мишенью микроРНК-26b, поэтому при обработке микроРНК-26b клеток гранулезы число разрывов в ДНК увеличивалось.
Chen и соавт. [42], изучив уровень микроРНК-146a у пациенток с ПОН, установили, что микроРНК оказывает стимулирующее действие на апоптоз клеток гранулезы через гены IRAK1 и TRAF6. Cho S. и соавт. [43] подтвердили активность микроРНК-146a в отношении гранулезы на культуре клеток посредством регуляции генов-мишеней (FOXO3, FOXL2 и CCND2).
При синдроме поликистозных яичников (СПКЯ) изучали микроРНК в фолликулярной жидкости пациентов и идентифицировали ~120 микроРНК. Наиболее высокоэкспрессируемые микроРНК нацелены на гены, связанные с репродуктивными, эндокринными и метаболическими процессами (микроРНК-132, микроРНК-320, микроРНК -520c-3p, микроРНК-24, микроРНК-222 – регулируют концентрацию эстрадиола; микроРНК-24, микроРНК-193b, микроРНК-483-5b – регулируют концентрацию прогестерона). Активность микроРНК-132 и микроРНК-320 у пациентов группы контроля была значительно ниже, чем у пациентов с СПКЯ [44]. Стоит напомнить, что ранее эти молекулы были идентифицированы, как ЛГ-регулируемые в клетках гранулезы у мышей [27]. В 2015 г. было проведено подобное исследование, в котором в фолликулярной жидкости у женщин были идентифицированы микроРНК-320a и микроРНК-197 с повышенной экспрессией [45]. Исследователи предположили, что эти микроРНК могут влиять на качество эмбрионов, что было продемонстрировано на лабораторных животных (мышах). Функцию исследовали на ооцитах экспериментальных животных, вводя в фолликулы микроРНК-320a и микроРНК-197 и наблюдая увеличение потомства. Предполагаемые цели и любые возможные роли для микроРНК-320a и микроРНК-197 еще предстоит определить.
В другом исследовании микроРНК-93, -133 и -223, которые нацелены на GLUT4, чувствительный к инсулину транспортер глюкозы, были оценены в жировой ткани пациентов с СПКЯ. Авторы демонстрируют прямое действие микроРНК-93 на GLUT4 и указывают, что микроРНК-93, -133 и -223 сверхэкспрессируются у пациентов с СПКЯ и у женщин с резистентностью к инсулину, поэтому была выдвинута гипотеза, что изменения в экспрессии микроРНК могут частично объяснить патогенез двух патологических состояний [46].
Заключение
МикроРНК представляют собой регуляторные некодирующие белок малые РНК, способные снижать либо усиливать синтез белков, что позволяет рассматривать их с позиции биологических маркеров патологических процессов в различных системах и органах. Была установлена роль микроРНК в фолликулогенезе, в том числе в качестве регуляторов апоптоза в клетках гранулезы, при овуляции и лютеинизации, что позволяет рассматривать их как регуляторов репродуктивной функции. Экспериментально показано, что экспрессия микроРНК в клеточных культурах модулируется факторами роста и стероидными гормонами, но не определены степень регуляции и роль в овуляции, кроме того, не все микроРНК демонстрируют такие же изменения in vivo. Однако было установлено, что микроРНК могут быть важными регуляторными молекулами, участвующими непосредственно в формировании ПОН и СПКЯ, биологическими маркерами овариального резерва, что имеет большое значение в репродуктологии. Необходимы дальнейшие систематизированные исследования по выявлению микроРНК.
