Наиболее эффективным методом лечения бесплодия является использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), которые широко внедрены во всех странах мира. По данным European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE), в ближайшее время ежегодно в мире будет проводиться более 1 млн циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1]. Однако, несмотря на значительное совершенствование методов ВРТ, частота наступления беременности остается сравнительно невысокой и составляет около 35% на проведенный цикл [2].
Основную роль в достижении положительных результатов при использовании методов ВРТ, несомненно, играет качество гамет. В экспериментах на животных было показано, что качество ооцитов имеет более существенное значение, нежели характеристики сперматозоидов [3, 4]. В связи с этим оценка качества ооцита – одна из ключевых задач эмбриологии, позволяющая произвести в последующем селекцию лучших эмбрионов с максимальным потенциалом к имплантации. Основным способом определения качества ооцитов является их морфологическая оценка и визуализация различных экстра- и цитоплазматических аномалий строения. Данный метод является простым, доступным, но и субъективным. Помимо этого, были предложены и другие методы. Так, Patrizio P. et al. (2007) в качестве маркера качества ооцитов изучали экспрессию генов в гранулезных клетках [5], а Dawson A. et al. (2006) для скрининга ооцитов с хромосомными дефектами проводили биопсию полярного тельца [6]. Другие исследователи для оценки компетентности ооцитов изучали веретено деления [7] или содержание и мутации митохондриальной ДНК [8]. Однако все эти методики являются трудоемкими и инвазивными. В связи с чем научный интерес многих исследователей в настоящее время направлен на поиск неинвазивных маркеров качества ооцитов. Одним из таких направлений является изучение компонентов фолликулярной жидкости (ФЖ), что стало возможным благодаря развитию постгеномных методов анализа. Особое место среди них занимают метаболомные технологии, основанные на использовании масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [9]. Каждая из этих технологий имеет свои уникальные преимущества и недостатки. Так, метод масс-спектрометрии обладает высокой чувствительностью и специфичностью [10], а преимущества спектроскопии ЯМР состоят в том, что при оценке биологических жидкостей не требуется специальной подготовки образца и имеется возможность анализа небольших объемов исследуемого материала [11]. Методика масс-спектрометрии требует, чтобы различные классы соединений анализировались отдельно, и поэтому часто необходим этап предварительной хроматографии, что замедляет время анализа [12].
Метаболомика занимается измерением всех низкомолекулярных метаболитов (эндо- и экзогенных), которые могут быть обнаружены в живой клетке или организме [13]. Более того, существует мнение, что оценка метаболомного профиля любой биологической среды более информативна, чем прямые исследования экспрессии генов (геномика), мРНК (транскриптомика) и белков (протеомика). Сторонники метаболомного анализа жидкости объясняют это тем, что данная методика обеспечивает немедленную и точечную оценку функционального состояния биологической системы и ее клеток [14]. Биологические жидкости находятся в динамическом равновесии с клетками, поэтому качественный и количественный анализ метаболитов в жидкости отражает метаболизм внутри этих клеток [12]. ФЖ является биологической средой, в которой происходят наиболее важные этапы оогенеза, следовательно, есть основания полагать, что ее состав может указывать на качество ооцита, которое играет ключевую роль в оплодотворении, имплантации и раннем развитии эмбриона [15]. Более того, ФЖ является идеальной средой для оценки компетентности ооцитов, поскольку она получается вместе с ооцитом во время фолликулярной аспирации и обычно утилизируется. Ограничением ценности оценки ФЖ является факт высокой частоты встречаемости анеуплоидных ооцитов, что не может быть обнаружено с помощью анализа ее состава [12].
Первые работы по изучению отдельных компонентов ФЖ проводились еще в 90-е гг. XX в. Так, Boreto-Ruiz W.C. et al. (1984) выявили взаимосвязь более высоких уровней эстрадиола в ФЖ с успешным оплодотворением и наступлением беременности. Авторы сделали вывод, что более высокие концентрации эстрадиола в ФЖ свидетельствуют о лучшем качестве ооцитов [16]. Позднее другие исследователи не подтвердили эти данные. Tarlatzis B. et al (1985), Ben-Rafael Z. et al. (1987), напротив, показали, что высокие концентрации эстрадиола и прогестерона в ФЖ свидетельствуют о плохом качестве ооцитов [17, 18], а Asimakopoulos B. et al. (2008) и вовсе не обнаружили корреляции между уровнями данных гормонов и характеристиками ооцитов [19]. Противоречивые данные в определении компетентности ооцитов были получены и при изучении роли других гормонов. Так, в исследовании Mendoza C. et al. (2002) уровни пролактина в ФЖ положительно коррелировали с качеством ооцитов [12, 20], а в работах Lee M. et al. (1987), Reinthaller A. et al. (1987) эти показатели, напротив, имели обратную зависимость [12, 21, 22]. Другие исследователи не выявили корреляции качества ооцитов с уровнем пролактина в ФЖ [12, 23]. Аналогично в ряде работ [24, 25] были опровергнуты полученные ранее данные о том, что высокие концентрации лютеинизирующего гормона (ЛГ) и андростендиона, а также низкие уровни тестостерона связаны с наступлением беременности в цикле ЭКО [12].
Помимо стероидных гормонов, в состав ФЖ входят ферменты, электролиты, цитокины, антиоксиданты, а также пептиды и белки. Компоненты ФЖ сгруппированы в следующие категории: а) гормоны; б) факторы роста суперсемейства трансформирующих факторов роста бета; в) другие факторы роста и интерлейкины; г) реактивные формы кислорода (АФК); д) антиапоптотические факторы; е) белки, пептиды и аминокислоты; г) сахара; з) простаноиды [15].
Исследования, направленные на поиск предиктора качества ооцитов среди данных компонентов ФЖ, не смогли идентифицировать вещества, которые можно было бы использовать как надежный маркер способности ооцитов к оплодотворению, развитию эмбриона и беременности. В связи с чем большинство исследователей в настоящее время проводят оценку не одного или двух веществ из отдельных фолликулов, а стремятся к сложному молекулярному анализу всех веществ, содержащихся в ФЖ [12, 15], что, возможно, будет способствовать более высокой точности прогнозирования исхода программы ЭКО.
Панель метаболитов ФЖ, обсуждаемых в литературе в качестве предикторов компетентности ооцитов, включает глюкозу, лактат, холин, фосфохолин, пролин, лейцин/изолейцин, глутамин и липопротеиды высокой плотности (ЛПВП). Так, в исследовании Wallace M. et al. (2012) было показано, что с плохим качеством ооцитов коррелируют низкие уровни лактата, холина/фосфохолина и более высокие концентрации глюкозы, ЛПВП [26].
Низкомолекулярные метаболиты представляют собой конечные продукты клеточных регуляторных процессов и, следовательно, показывают реакцию биологических систем на различные генетические, питательные или другие внешние воздействия [27]. В связи с этим можно предположить, что метаболомный профиль ФЖ может отличаться у пациенток различных возрастных групп и при некоторых гинекологических заболеваниях. Так, например, высокий уровень глюкозы в ФЖ наблюдался у пациенток с ожирением [26], наличие которого ассоциировано с плохим качеством ооцитов. Song J. et al. (2020) с использованием жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии изучали метаболомные изменения ФЖ у пациенток в зависимости от индекса массы тела (ИМТ). Авторы показали значительные изменения в ФЖ по мере увеличения ИМТ, что позволило сделать вывод об усилении апоптоза и развитии митохондриальной дисфункции в этой биологической среде. Однако остается неясным, насколько эти изменения оказывают негативное влияние на качество ооцитов, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбриона [28].
В исследовании Karaer A. et al. (2019) было показано, что высокие концентрации глюкозы в ФЖ наблюдаются и у женщин с эндометриоидными кистами яичников [14]. Известно, что развитие фолликулов и стероидогенез зависят от содержания глюкозы; следовательно, изменение ее уровня в ФЖ будет оказывать неблагоприятное воздействие на рост фолликулов и созревание ооцитов. Повышение или снижение уровня глюкозы в ФЖ оказывает негативный эффект на созревание ядра и цитоплазмы ооцитов, а нарушение или асинхронность данного процесса, как известно, может приводить к появлению тех или иных морфологических аномалий строения яйцеклеток. Следует сказать, что имеются ограниченные данные о влиянии высоких уровней глюкозы на компетентность человеческого ооцита.
В исследовании Rice S. et al. (2005) было показано, что у женщин с синдромом поликистозных яичников наблюдается снижение в ФЖ уровня лактата, что подтверждает его роль в развитии ооцитов [29]. Эти же данные были подтверждены позднее в работе Wallace M. et al. (2012). Концентрация лактата была снижена в ФЖ тех фолликулов, где были получены ооциты, которые оплодотворились, но эмбрионы не дробились или же дробились, но беременность не наступила [26].
У пациенток с эндометриоидными кистами яичников в исследовании Karaer A. et al. (2019), напротив, наблюдалось повышение уровня лактата в ФЖ, что авторы объясняют повышенной гликолитической активностью гранулезных клеток и увеличением потребности в энергии растущего фолликула. Наряду с изменением концентрации лактата было отмечено и повышение уровней пирувата, что объясняется превращением глюкозы в пируват клетками кумулюса. Полученные данные позволили авторам сделать вывод о важной роли лактата и пирувата в обеспечении фолликулов энергией по мере роста и созревания ооцитов [14]. Помимо описанных изменений, у пациенток с эндометриоидными кистами яичников в ФЖ наблюдается повышение моноацилглицеринов, жирных кислот, карнитина, диацилглицерола, фосфатидной кислоты, фосфатидилсерина, лизофосфатидилглицерола, лизофосфатидилинозитола и лизофосфатидной кислоты, что было показано в работе Cordeiro F.B. et al. (2017) [9, 30]. По мнению авторов, наличие воспалительных и пролиферативных изменений, характерных для эндометриоза яичников, объясняет повышение уровней лизофосфатидилглицерола и лизофосфатидной кислоты в фолликулярной среде [9, 30].
Наиболее важным маркером качества ооцитов и фактором для прогноза исхода цикла ВРТ является возраст женщины. Известно, что состав ФЖ изменяется с возрастом, что может быть причиной снижения компетентности ооцитов [31]. Zhang et al. (2020) с использованием жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии изучали метаболизм липидов в ФЖ у пациенток разных возрастных групп. Известно, что липиды являются важной энергетической поддержкой роста и развития ооцитов; они участвуют в построении мембраны, регулируют клеточный цикл, развитие и апоптоз. В исследовании было показано, что метаболизм липидов у пациенток старшей возрастной группы претерпевает значительные изменения в основном за счет повышения уровня арахидоновой кислоты, которая влияет на развитие ооцитов, вызывая снижение фертильности [32]. Montani D. et al. (2019) показали различия в липидном профиле ФЖ у пациенток с положительным и отрицательным исходом цикла ВРТ [33]. В другом исследовании при оценке метаболомного профиля ФЖ у женщин старше 40 лет наблюдалось снижение уровня глюкозы и повышение лактата, что обусловлено нарушением метаболизма фолликулярных клеток у пациенток данной возрастной группы. Обращает на себя внимание тот факт, что у пациенток моложе 40 лет со сниженными показателями овариального резерва наблюдались аналогичные изменения состава ФЖ [34].
Анализ метаболома ФЖ в зависимости концентрации сывороточного антимюллерова гормона (АМГ) в разных возрастных группах показал, что уровни глюкозы были снижены, а концентрации лактата и прогестерона существенно повышены, как у женщин до 35 лет со сниженным овариальным резервом, так и у пациенток старше 35 лет с нормальными показателями овариального резерва. Авторы делают вывод, что данные метаболические нарушения могут быть причиной нарушения компетентности в развитии ооцитов и последующего развития эмбриона [35].
De la Barca С.J.M. et al. (2017) провели оценку 136 метаболитов в ФЖ у 57 женщин в зависимости от параметров овариального резерва [36]. В группу со сниженным овариальным резервом были отнесены пациентки, имеющие уровень АМГ <2 нг/мл, ФСГ > 8 МЕ/л и наличие менее 4 фолликулов. Было показано значительное снижение активности плазмалогенов у женщин со сниженными параметрами овариального резерва по сравнению с группой контроля. Функции плазмалогенов ФЖ до конца не изучены, а снижение их уровня в сыворотке крови связано с окислительно-восстановительным дисбалансом. Одна из гипотез состоит в том, что уменьшение плазмалогенов в ФЖ у пациенток старшего репродуктивного возраста может быть связано с окислительным стрессом, приводящим к чрезмерному потреблению этих молекул [37]. Более высокие уровни активных форм кислорода и более низкие концентрации антиоксидантов как свидетельство окислительного стресса были обнаружены в ФЖ у пациенток с отрицательным исходом программы ЭКО в сравнении с теми, у кого беременность наступила [38].
Рядом исследователей было высказано предположение, что состав ФЖ изменяется при стимуляции яичников [12, 39, 40]. Так, Enien W. et al. (1995) продемонстрировали, что при проведении овариальной стимуляции гормональная внутрифолликулярная среда изменяется в зависимости от используемого протокола [40]. Авторы изучали содержание эстрадиола, прогестерона, тестостерона и хорионического гонадотропина в 129 образцах ФЖ в стимулированных и естественных циклах ЭКО, а также рассчитывали соотношение прогестерон/эстрадиол. Было показано, что концентрация эстрадиола и тестостерона в ФЖ была существенно ниже, а соотношение прогестерон/эстрадиол значимо выше в стимулированных циклах по сравнению с естественными циклами. Более того, уровень эстрадиола и хорионического гонадотропина человека были значительно ниже при проведении овариальной стимуляции в протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона по сравнению с «длинным» протоколом [40]. В работе Santos M. (2012) также было показано, что в стимулированных циклах концентрация эстрадиола и ЛГ в ФЖ существенно ниже, чем в естественных циклах. Авторы полагают, что стимуляция овуляции приводит к изменениям в уровнях различных компонентов ФЖ, однако корреляции с качеством гамет ими выявлено не было [39].
Xia L. et al. (2014) с использованием газовой хроматографии/масс-спектрометрии изучали метаболомный профиль ФЖ у пациенток с повторными неудачами имплантации в программе ЭКО. Авторы показали, что в данной группе женщин наблюдается повышение уровней 12 аминокислот (валина, треонина, изолейцина, цистеина, серина, пролина, аланина, фенилаланина, лизина, метионина) и понижение содержания дикарбоновых кислот, холестерина и некоторых органических кислот. Данные компоненты ФЖ, по мнению исследователей, ответственны за качество и созревание ооцитов, и определение их концентраций может быть полезно для отбора компетентных ооцитов и эмбрионов у пациенток с повторными неудачами имплантации в программе ЭКО [41].
Заключение
Таким образом, изучение компонентов ФЖ, влияющих на результативность программ ВРТ, – одно из важнейших направлений репродуктивной медицины. Однако, как показано в данном обзоре литературы, несмотря на большое количество исследований метаболомного профиля данной биологической среды, предикторы качества ооцитов и исходов программ ВРТ до конца не определены. Требуется дальнейшее изучение состава ФЖ на большей выборке пациенток, а также в зависимости от показателей овариального резерва, возраста и наличия различной гинекологической патологии.
