Инфекция, обусловленная вирусом папилломы человека (ВПЧ), выявляется у 50–80% населения и в 99,7% случаев гистологически подтвержденного рака шейки матки (РШМ), что представляет собой важную проблему общественного здравоохранения [10]. Несмотря на общее снижение уровня заболеваемости РШМ в экономически развитых странах, отмечается его рост у женщин в возрасте
до 35 лет. Высокая распространенность и смертность от РШМ в мире, а так же трудности и противоречия в оценке характера протекающего вирусного процесса диктуют необходимость его дальнейшего изучения.
У большинства зараженных женщин папилломавирусная инфекция (ПВИ) спонтанно разрешается, и только у 1 из 100 инфицированных развиваются клинические поражения [23]. Единственный положительный ВПЧ-тест у женщин не оправдывает радикального вмешательства, при этом диагностика и тактика врача в случаях преинвазивного поражения сложны и неоднозначны ввиду высокой вероятности элиминации вируса. Основная цель современных исследований – выделить из огромной когорты инфицированных тех женщин, которые относятся к группе высокого риска прогрессирования поражения, для чего необходимы новые молекулярные маркеры, перспективы которых определяются биологией вируса папилломы и патогенетическими механизмами трансформации тканей при инфицировании [20].
Характеристика ВПЧ и патогенетические механизмы трансформации
Идентифицировано более 100 различных типов ВПЧ, около 40 ассоциировано с аногенитальными поражениями; наиболее распространен 16-й тип (высокоонкогенный), который обнаруживают в 50–80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% – РШМ. Двухнитевая кольцевая ДНК вируса заключена в белковую оболочку – капсид. В геноме вируса (размером около 8000 пар нуклеотидов) выделены 6 генов, обеспечивающих на ранних этапах его жизненного цикла взаимодействия с клеткой-хозяином и репликацию вирусной ДНК, и еще 2 гена, кодирующих белки капсида. Геном ВПЧ разделен на 3 функционально активных региона: Long control region (LCR), early (E), late (L). Область LCR участвует в регуляции транскрипции вирусных генов. Регион Е включает гены (Е6, Е7, Е1, Е2, Е4, Е5), кодирующие ранние белки. Поздние гены (Ll, L2) кодируют структурные белки вириона. Три ранних гена (Е1, Е2, Е4) контролируют функции, необходимые для репродукции вируса, причем Е2 обладает функциями регулятора транскрипции
вирусной ДНК, которая начинается в регуляторной области LCR. В результате нарушений в различных участках генома ВПЧ ДНК вируса внедряется в хромосомы клетки хозяина. Разрыв ДНК вируса чаще всего происходит в области генов Е1 и Е2, что заканчивается их разрушением, приводящим к неконтролируемой экспрессии генов Е6, Е7 и соответственно к повышению синтеза белков Е6, Е7 [3].
Длительная персистенция ВПЧ обусловлена его способностью ускользать от иммунного надзора. Хотя изначально ВПЧ инфицирует базальные клетки, репликация вируса и синтез капсидных белков происходят в дифференцированных клетках поверхностного слоя эпителия, которому суждено погибнуть, при этом процесс не сопровождается признаками воспаления [29]. Проникая в клетку, вирус использует ее возможности для получения собственных белков. В первую очередь синтезируются белки, необходимые для поддержания и репликации вирусной ДНК, а затем клеточной трансформации. Ранние гены проявляют активность в базальных клетках эпителия. В дифференцированных кератиноцитах активны поздние гены, здесь происходит сборка инфекционных вирусных частиц.
Гены Е5, Е6, Е7 стимулируют пролиферацию и трансформацию клеток. Продукт гена Е5 важен на ранних стадиях инфекции, так как транскрибируется только с эписомальной ДНК. Белок Е5 активирует клеточный рост, формируя комплексы с рецепторами эпидермального фактора роста и колониестимулирующего фактора CSF-1. Показано, что E5 может предотвращать апоптоз, вызванный повреждением ДНК ультрафиолетом. Протеины Е6, Е7 названы онкобелками, их мишенями являются белки — супрессоры опухолевого роста ‒ р53 и pRb, участвующие в регуляции апоптоза. При интеграции ПВИ в геном человека, онкоген Е6 формирует инактивирующие комплексы с р53, Е7 ‒ с pRb (Е6/р53, E7/pRb), после чего инициируется процесс опухолевой трансформации. Кроме того, белок Е6 подавляет выработку интерферона, активирует теломеразу и предотвращает деградацию тирозинкиназ семейства SRC, таким образом усиливая пролиферацию. Белки Е6/Е7 индуцируют переход дифференцированных клеток в S-фазу клеточного цикла. Е7 также влияет на активность целого ряда белков клеточного цикла, таких как А и Е циклины, cdk2-киназу и ингибиторы циклинзависимой киназы р21 и р27 II и др. [3].
На стадии активной репродукции вируса экспрессия генов Е6 и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно благодаря Е2, пока вирус находится в эписомальном состоянии, наблюдается доброкачественное течение инфекции. Ключевой момент в малигнизации клеток –отсутствие экспрессии гена Е2 при активной экспрессии Е6 и Е7 генов ВПЧ.
Показано, что индивидуальные генетические характеристики влияют на способность организма сопротивляться инфекции и защищать геном клетки от вирусной атаки. Примером могут служить изменения гена p53. Некоторые его варианты кодируют белок, более устойчивый к инактивации при ПВИ. Эта устойчивость, в частности, зависит от того, какая аминокислота находится в позиции 72 данного белка. Предполагают, что различия в частоте встречаемости устойчивого варианта p53 в разных этнических группах могут объяснить разный уровень заболеваемости РШМ [5].
Методы диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний могут быть подразделены на классические, включающие цитологический, гистологический, кольпоскопический методы, а также современные, к которым относят молекулярно-генетические.
Цитологический метод. Скрининговые исследования с помощью мазков по Папаниколау (Пап-тест)
позволили существенно снизить уровень заболеваемости РШМ, особенно в развитых странах. Однако метод позволяет диагностировать только текущую клиническую и субклиническую формы инфекции; высокий процент ложноотрицательных результатов связан со степенью субъективности при оценке Пап-мазка и ограничениями самой технологии. Специфичность метода высока ‒ 98%, однако чувствительность его колеблется от 30 до 87%, что диктует необходимость частого выполнения повторных скрининговых тестов [11]. Значение цитологического скрининга в борьбе с РШМ сохраняется, но совершенно очевиден тот факт, что он не дает возможности выявить все случаи предраковых изменений. Кольпоскопия рассматривается как чувствительный метод (80–90%)
определения субклинической формы ПВИ, предрака и РШМ. Однако специфичность его низкая (30–60%), как скрининговый метод кольпоскопия использоваться не может [7].
Гистологический метод. Гистологическое обследование не может быть применено часто, в то время
как ПВИ может персистировать долго. Гистология не дает прогноза в отношении прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN). Необходим поиск новых критериев, которые
помогут в ранней и корректной диагностике CIN и РШМ, а также в прогнозировании их течения.
Имунологические методы. Для ВПЧ типов 6, 11, 16, 18 и 33, поражающих половые органы, были
идентифицированы серореактивные области внутри L1 и L2, Е4 и Е7 протеинов. Однако диагностических тест-систем для определения антител к ВПЧ пока нет. Серологические методы анализа предназначены для выявления антител к онкобелкам ВПЧ в сыворотке пациентов. Достоверная корреляция между титром антител и неоплазией не обнаружена. Кроме того, обнаружение антител не коррелирует со стадией заболевания и не имеет, таким образом, диагностической значимости. Серологические тесты пока не приобрели клинического значения.
Молекулярно-генетические методы включают ряд современных технологий диагностики.
Обнаружение ДНК ВПЧ. Самой широко используемой в настоящее время диагностической методикой является полимеразная цепная реакция (ПЦР), так как ДНК ВПЧ длительно сохраняется в образцах тканей и ее можно легко идентифицировать. Это позволяет осуществлять диагностику даже при наличии минимального количества исследуемого материала. Практически любые методы выявления ДНК ВПЧ обладают 95–100% диагностической чувствительностью по отношению к тяжелым дисплазиям и РШМ [11,16]. Однако «качественное» определение ДНК ВПЧ имеет спорную клиническую значимость, поскольку не позволяет прогнозировать течение инфекции, которая в большинстве случаев элиминируется без лечения [9].
Генотипирование вируса. Наиболее эффективным методом установления персистенции ВПЧ является генотипирование вируса (методом ПЦР), позволяющее дифференцировать реинфицирование новым типом вируса от персистенции. При инфицировании несколькими генотипами ВПЧ одновременно прогноз течения заболевания менее благоприятный, а риск персистенции и риск развития РШМ по сравнению с инфицированием одним типом более высокий [19]. Для врача иметь подобную информацию важно, так как опасность представляет именно хроническая персистентная форма инфекции. При первичном инфицировании наиболее вероятно спонтанное излечение. О реинфицировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции – сохранение генотипа вируса через год после первого тестирования. Повторное инфицирование тем же генотипом вируса после самопроизвольного излечения считается практически невозможным, хотя этот вопрос дискутируется [6]. В современных тест-системах наиболее часто выявляют от 8 до 27 онкогенных типов ВПЧ.
Вирусная нагрузка. В качестве одного из критериев клинически значимой инфекции, с высокой степенью вероятности способной развиться в неоплазию, рассматривается вирусная нагрузка, хотя ее
прогностическая ценность на сегодняшний день однозначно не определена. Многие исследования
показали, что у пациентов с с высокими концентрациями вирусных геномов в образцах на начальных этапах ВПЧ-инфекции риск развития CINII/CINIII выше, чем у пациентов, имеющих низкую вирусную нагрузку [2,18]. Другие авторы не обнаружили достоверных различий между относительными концентрациями ДНК ВПЧ у женщин с CINI,II,III и считают, что степень вирусной нагрузки не отражает тяжести поражений и не может служить диагностическим критерием [30]. В настоящее время для выявления ВПЧ и определения клинически значимой концентрации ДНК в ткани используется различные тесты (Digene-тест, ПЦР в режиме реального времени).
Определение статуса ВПЧ. Возможность элиминации вируса из клетки-хозяина определяется совокупностью многих факторов. Особо важную роль при этом играет состояние физического статуса ДНК ВПЧ (эписомальная, интегрированная, смешанная).
Эписомальная (неинтегрированная) форма является признаком продуктивной инфекции, так как при этом производятся полноценные вирусные частицы. Присутствие вирусного генома в эписомальной форме чаще всего регистрируется при спонтанной регрессии CINI, которая обратима в большинстве случаев.
При интеграции ДНК вируса в хромосому клетки-хозяина вирусные частицы уже не производятся. Эта фаза, называемая непродуктивной ВПЧ-инфекцией, расценивается как первый шаг к опухолевому перерождению клетки, что чаще заканчивается развитием карциномы. Для поддержания трансформированного состояния клетки необходима также экспрессия онкогенов – синтез РНК и определенных вирусспецифических белков. В составе интегрированного вирусного генома имеется ген, продукт которого стойко нарушает нормальную регуляцию клеточного деления, превращая нормальную клетку в опухолевую, что сопровождается повышением количества транскриптов генов Е6 и Е7 и снижением/отсутствием экспрессии гена Е2, регулирующего транскрипцию вышеперечисленных генов. Биологическое значение интеграции вирусной ДНК в клеточный геном до сих пор неясно, поскольку эписомальная вирусная ДНК выявляется в значительном проценте (до 40) случаев РШМ. Регистрируется и смешанное присутствие в опухоли «молчащей» интегрированной вирусной ДНК и активно транскрибируемой эписомальной вирусной ДНК. Видимо, определяющим для развития опухоли является транскрипционная активность вирусного генома и синтез РНК, кодируемых генами Е6 и Е7, которые могут происходить как с интегрированной, так и с эписомальной формы. В последние годы
в качестве косвенного маркера интеграции ВПЧ наиболее часто применяют тесты с определением
соотношения генов Е2–Е6, а также определение мРНК Е6 и Е7 вирусных генов [8].
Для оценки физического состояния ВПЧ используются такие методы, как гибридизация in situ, ПЦР в режиме реального времени, обратная транскрипция ПЦР (ОТ-ПЦР).
Возможности современных прогностических маркеров
Изучение молекулярных биомаркеров для выявления прогностически неблагоприятных диспластических клеток может значительно уменьшить влияние субъективных обстоятельств, которые сопровождают стандартный морфологический подход, и заменить современные методы диагностики/скрининга. Обнаружение в клинических образцах дисбаланса различных маркеров указывает на присутствие клеток, несущих искаженную информацию, свойственную опухолевому росту.
Определение уровня экспрессии указанных маркеров позволяет усовершенствовать прогноз течения заболевания и ответа на терапию, а также формирование групп риска пациенток, которые требуют более тщательного наблюдения. Анализ цитологических и гистологических препаратов на предмет определения молекулярных маркеров находит все более широкое применение.
До настоящего времени нет четкой определенности в отношении факторов, обусловливающих
различные темпы персистирования ПВИ и риск злокачественной трансформации [21].
Mетодики, базирующиеся на ПЦР, технологически исключительно чувствительны и способны обнаруживать специфические генетические нарушения задолго до формирования морфологически
определяемой опухоли. Иммуногистохимическая идентификация клеточных белков, которые сверхэкспрессированы в ВПЧ-пораженных клетках в ответ на экспрессию вирусных онкогенов Е6 и Е7, также является распространенным тестом, поскольку при этом существенно повышается качество информации, которую невозможно получить при традиционном гистологическом исследовании. Иммуногистохимический метод применяют для исследования мазков и образцов ткани. В таблице представлены некоторые прогностические маркеры при предраке шейки матки и методы их исследования.
Наиболее изученными тестами на сегодняшний день являются определение онкобелков Е6 и Е7,
Е2/Е6 и p16INK4A .
Таблица. Характеристики молекулярных маркеров.
Определение онкобелков Е6 и Е7. Увеличение синтеза онкобелков Е6 и Е7 в соскобах шейки матки
коррелирует с процессом интеграции вирусного генома в геном клетки хозяина и малой вероятностью спонтанной ремиссии. В большинстве случаев цервикальной карциномы интеграция вирусной ДНК в геном клетки хозяина предшествует сверхэкспрессии онкобелков Е6 и Е7 [32], а персистенция ПВИ сопровождается экспрессией онкобелка Е7 в 10,4 раза чаще, чем транзиторное течение. У 73,5% женщин с персистирующей ПВИ и сопутствующей тяжелой дисплазией регистрируется экспрессия онкобелка Е7 [1]. Отмечено, что экспрессия мРНК белков E6/E7 положительна в 90,6% (29/32) случаев, когда вирусная нагрузка превышает 500 копий ВПЧ-16/нг ДНК. Уровень мРНК белков E6/E7, как было установлено, увеличивается по мере нарастания тяжести поражения [17], следовательно, обнаружение мРНК белков E6/E7 может иметь более высокую прогностическую ценность и по сравнению с тестированием ДНК ВПЧ. Для определения ВПЧ мРНК белков E6/E7 используют технологию амплификации нуклеиновых кислот NASBA, позволяющую выявлять мРНК белков Е6/Е7, и ПЦР в режиме реального времени.
Важно подчеркнуть, что при диагностике ранних стадий предрака мРНК белков Е6/Е7 обнаруживается значительно реже, чем ДНК ВПЧ, что является основанием использовать этот маркер для триажа. Анализ 1798 случаев с периодом наблюдений 12 мес и последующее детальное обследование женщин с CINII–III показали чувствительность мРНК Е6/Е7 теста 81/84%, специфичность 91/87% соответственно, а также высокий показатель негативного прогноза – 0,99 /0,97 соответственно [28].
Определение Е2/Е6. Интеграция ДНК ВПЧ-16 в геном клетки-хозяина, приводящая к нарушению экспрессии гена Е2, является важнейшим параметром оценки уровня экспрессии протеинов Е6 и Е7, так как продукт гена Е2 является репрессором промотора, под контролем которого экспрессируются эти гены. ПЦР-технология позволяет выявить интегративную форму вируса посредством амплификации Е2 гена даже при очень низкой концентрации ДНК. Однако данный метод не способен выявить различия между эписомальной и смешанной формами, так как Е2 последовательность сохраняется в обоих случаях. Особый интерес представляет использование ПЦР в режиме реального времени для детекции физического состояния ВПЧ и определения вирусной нагрузки [4]. Для дифференцирования эписомальной формы геномной ДНК от смешанной определяется соотношение ВПЧ Е2 и Е6 ПЦР-продуктов (Е2/Е6). Снижение экспрессии гена ВПЧ-16 E2 было часто связано с интегративной формой ВПЧ-16 [12]. Преобладание интегративной и/или смешанной формы ВПЧ-16 коррелировало с прогрессированием степени CIN [4,13]. В опухолях, для которых характерна гетерогенность клеточной популяции, возможно выявление обеих основных форм персистенции вирусной ДНК.
Выявление p16INK4A и Ki-67. Ген p16INK4A несет достаточно точную диагностическую информацию для идентификации клеток с нарушенным профилем регуляции экспрессии к онкогенам высокого риска (ВР-ВПЧ). Считается, что сверхэкспрессия белка р16INK4a происходит вследствие инактивации гена ретинобластомы онкогенным белком вируса Е7 и формирования инактивирующих комплексов с онкопротеином Е7 (E7/pRb). Поскольку накопление р16INK4A в клетках свидетельствует о трансформации, предложено выявлять такие клетки на гистологических срезах или в цитологических мазках по окраске специфическими антителами к р16INK4а. Уровень мРНК гена р16INK4а определяется также методом ОТ-ПЦР.
Иммуногистохимический метод основан на выявлении клеточного протеина p16INK4a, участвующего в регуляции клеточного цикла. В нормальных эпителиальных клетках шейки матки протеин p16INK4a экспрессируется в очень малом количестве и иммуногистохимическими методами не выявляется, поэтому может рассматриваться как непрямой маркер активной экспрессии ВР-ВПЧ.
Иммуногистохимические исследования показывают, что р16INK4a высоко выражен фактически в 100% случаев CINI–II, но реже обнаруживается в СINI [21]. Указывается, что наряду со 100% точностью окрашивания p16INK4а в высокосортных дисплазиях, уровень р16INK4а может помочь идентифицировать низкосортные цервикальные повреждения, которые связаны с высокоонкогенными
типами ВПЧ и обладают повышенным риском прогрессии. Кроме того, p16INK4а может быть полезен для триажа ВПЧ-положительных женщин, когда ВПЧ-тест используется в качестве первичного скрининга. Чувствительность p16INK4A для CINII составила 81–95%, специфичность – 95–100%,
прогностическая ценность положительного теста –100% [15].
Маркер клеточной пролиферации Ki-67 также активно изучается в последние годы и характеризуется высокой чувствительностью/специфичностью (98,4/97,8%) для диагностики CIN высокой степени [25]. Наблюдение за 7906 женщинами Германии, включенными в скрининг, показало высокую степень негативного прогноза (99,1%) у ВПЧ-положительных женщин при отрицательных результатах показателей p16INK4A и Ki-67 [27].
Перспективы применения маркеров
Исследования по изучению диагностической эффективности различных биомаркеров при предраке и РШМ активно продолжаются. Важная роль принадлежит оценке прогностической ценности каждого теста. При тяжелых степенях предрака и РШМ эффективность биомаркеров и ДНК-тестов высока.
Однако имеется настоятельная необходимость выявления случаев клеточной пролиферации
с неблагоприятным прогнозом еще на стадии ранних клеточных изменений и инфицирования, когда кольпоскопия и цитология малоэффективны. Очень важно найти тот биомаркер, который будет служить методом триажа у женщин с нормальными цитологическими мазками, а также при мазках типа атипичных плоскоэпителиальных клеток неопределенного типа (ASCUS) и низкой степени внутриэпителиального поражения (LSIL) для выявления групп реально высокого прогностического риска. Молекулярные маркеры имеют более высокую диагностическую точность, так как они более объективны. Уже идентифицирован ряд потенциальных маркеров, которые после клинической ратификации должны внести вклад в диагностику, прогноз и лечение цервикального рака.
Сочетание маркеров может повысить чувствительность и специфичность диагностики. Скрининг РШМ, основанный на молекулярных маркерах, уже технически выполним. Доказано, что финансовые затраты общества на проведение эффективного молекулярно-генетического скрининга ниже, чем на лечение больных с запущенными формами ПВИ и РШМ. Несмотря на несомненную перспективность и объективность методов молекулярной диагностики, вопрос об их специфичности и чувствительности остается актуальным. Это связано с тем, что опухоль всегда состоит из смеси нормальных и злокачественных клеток, поэтому выделяемая из них ДНК также гетерогенна, что необходимо учитывать при решении вопроса о применимости молекулярных тестов.
В заключение следует подчеркнуть, что внедрение современных методов молекулярной диагностики в широкую онкологическую практику неизбежно требует серьезного технического перевооружения существующих клинических лабораторий, а также специальной подготовки персонала. Сами методы должны пройти масштабные клинические испытания с учетом принципов рандомизации, поэтому в настоящее время нуждаются в детальном изучении.
