Привычный выкидыш (ПВ) – это гетерогенное состояние, которое определяется как две и более клинические потери беременности в сроках до 22 недель гестации и имеет место у 2–5% беременных женщин. После двух предыдущих выкидышей риск прерывания беременности возрастает более чем в 2 раза и достигает 36–38% [1].
Среди этиологических факторов ПВ выделяют такие, как хромосомные аномалии (2–6%), анатомические изменения матки (10–15%), инфекционно-воспалительные (2–6%), эндокринные (17–20%), аутоиммунные (20%) заболевания, тромбофилические состояния (10%) [2]. Тем не менее около 50% случаев ПВ являются необъяснимыми (идиопатическими). Идиопатический ПВ (ИПВ) остается актуальной проблемой репродуктивной медицины во всем мире.
Исходя из актуальных представлений, одним из критических звеньев патогенеза ИПВ является аберрантная экспрессия провоспалительных цитокинов, приводящая к нарушению иммунного ответа [3]. В этом контексте интересными представляются фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкин (IL)-17, обладающие эмбриотоксической и антитрофобластной активностью [4]. Есть данные, что значительное повышение уровня TNF-α в периферической крови характерно для женщин с ИПВ (на 40–70% по сравнению с контролем) [5], в том числе связано с инициированием апоптоза и ингибированием инвазии трофобласта, активацией тромбокиназы, снижением экспрессии нуклеотидсвязывающего домена олигомеризации и усилением цитотоксичности клеток dNK, что, в свою очередь, приводит к недостаточному ремоделированию спиральной артерии, тромбозам, инфарктам трофобласта и его отслойке [6], нарушению функций децидуальных клеток, иммунологическому отторжению плода и, как следствие, к выкидышу. Большинство исследователей считают, что уровень IL-17 в сыворотке крови у женщин с ИПВ повышен [4] и служит независимым прогностическим фактором ИПВ. Повышенный уровень IL-17 обратно коррелирует с содержанием Treg-клеток в периферической крови и децидуальной оболочке, снижение которого потенцирует процессы отторжения эмбриона; независимо связан с активацией экспрессии транскрипционного ядерного фактора NF-kB, сокращением уровня экспрессии рецепторов прогестерона и ослаблением его функциональной активности, что приводит к децидуа-дисплазии, недостаточной нутритивной поддержке эмбриона, стимуляции сократимости миометрия и, в конечном счете, к выкидышу [7].
В то же время иммунная система серьезно ассоциирована с нейроэндокринной. В научном сообществе активно обсуждается заинтересованность дисфункциональности эпифизарно-гипофизарно-надпочечниковой оси в повышении риска ИПВ, и при этом особое значение придается изменениям секретирования кортизола и мелатонина [8]. Анализ гормонального статуса крови у женщин с ИПВ позволил выявить избыточный уровень кортизола и недостаточное содержание мелатонина [9]. Наряду с этим изменения уровня кортизола были связаны с важными этиологическими факторами ИПВ, такими как снижение фибринолитической активности сосудистой стенки, нарушение процессов полноценной инвазии и функций трофобласта, индукция апоптоза, ингибирование секреции прогестерона. В свою очередь, снижение уровня мелатонина в крови ассоциировано с иммунологическим отторжением трофобласта (за счет ингибирования секреции прогестерона) и стимуляцией сократимости миометрия (путем усиления синтеза простагландинов) [10].
В ряде работ продемонстрирована роль кишечной микробиоты в патофизиологии ИПВ, что объясняется ее ключевой ролью в формировании и модуляции нейро-иммунно-эндокринных реакций. Так, представлены убедительные данные о качественных изменениях микробного ландшафта у женщин с ИПВ [11]. В целом у женщин с ИПВ зафиксирован тренд на обеднение видового разнообразия бактерий и сокращение полезных комменсалов, сопровождающийся увеличением числа патобионтов [11–14]; вместе с тем информация о родовом составе фрагментарна и противоречива. Кроме того, в литературе имеются лишь единичные сообщения о сопряженности между микробиотой кишечника и воспалительными биохимическими маркерами у женщин с ИПВ. Отсутствуют работы, оценивающие взаимосвязь представителей микробиоты кишечника с концентрацией кортизола и мелатонина при ИПВ.
Следовательно, вопрос сопряженности микробиоты кишечника и ИПВ остается открытым.
Цель исследования: оценка изменений таксономического состава микробиоты кишечника и изучение на уровне родов их сопряженности с содержанием в сыворотке крови кортизола, мелатонина, TNF-α и IL-17 у женщин с ИПВ.
Материалы и методы
Исследование выполнялось на базе гинекологического отделения структурного подразделения Перинатального центра ГБУЗ РКБ им. Н.А. Семашко (Симферополь). В проспективное сравнительное исследование были включены 55 женщин с первичным ИПВ (средний возраст – 31,6 [26,9; 33,9] года), которые составили основную группу, и 60 женщин с физиологически протекающей беременностью (средний возраст – 30,3 [25,9; 33,2] года), обратившихся по поводу проведения аборта (контрольная группа).
Критериями включения в основную группу являлись: подтвержденный диагноз ИПВ; возраст женщин до 35 лет; нормальный кариотип пары; информированное согласие на участие в исследовании.
В основную группу не включались женщины с дефицитом или избыточной массой тела; генетическими и анатомическими причинами ПВ; хроническими инфекционными, воспалительными, эндокринными, аутоиммунными, тромбофилическими, онкологическими заболеваниями; хронической патологией пищеварительной и гепатобилиарной системы; синдромом раздраженного кишечника; бактериальными, вирусными и грибковыми инфекционными заболеваниями; психической патологией; курящие; с изменениями стула (диарея/запоры) и принимавшие средства, влияющие на стул, в течение 30 дней; вакцинированные в течение 60 дней до включения в исследование; принимавшие антибиотики, противовирусные, пробиотические и пребиотические препараты в течение 90 дней до включения в исследование.
В контрольную группу были включены женщины в возрасте до 35 лет; со сроком беременности до 22 недель (подтвержденным данными ультразвукового исследования); физиологически протекающей беременностью; неосложненным гинекологическим и акушерским анамнезом; наличием в анамнезе минимум одной успешной беременности; без хронической экстрагенитальной патологии и аллергических реакций в анамнезе; без психической патологии в анамнезе; с частотой респираторных инфекций не более 3 раз в год; без инфекционных и острых заболеваний, изменений стула (диарея/запоры) и не принимавшие средства, влияющие на стул, в течение 60 дней до включения в исследование; не принимавшие антибиотики, противовирусные, пробиотические и пребиотические препараты в течение 90 дней до включения в исследование; согласившиеся на участие в исследовании.
В контрольную группу не включались женщины с прегравидарным дефицитом или избыточной массой тела; беременностью, наступившей при помощи вспомогательных репродуктивных технологий; высоким риском выкидыша; повышением температуры тела более 36,9°С; отказавшиеся от участия в исследовании.
Диагноз ПВ устанавливали по кодификационным критериям Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE) [15].
У всех женщин с ИПВ и пациенток контрольной группы проводили анализ таксономического состава микробиоты кишечника. От всех участниц были получены образцы кала в соответствии с протоколом исследования. Транспортировка и хранение образцов до момента выполнения метагеномного анализа реализовывались с соблюдением холодового режима при температуре -80°C. Выделение тотальной ДНК из образцов кала участниц исследования осуществляли методом фенольной экстракции. Нуклеотидную последовательность выделенной ДНК определяли на высокопроизводительном секвенаторе SOLiD5500 Wildfire, AppliedBiosystems (США) методом шотган-секвенирования [16].
Фильтрация качества прочтений и их таксономическая классификация были оценены посредством программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 [17]. Таксономическую идентичность прочтений устанавливали следующим образом: изначально проводили подбор референсных значений операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основании сопоставления полученных нами прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes (версия 13.5) [18]; затем устанавливали таксономическую идентичность данных ОТЕ в соответствии с базой данных кишечной микробиоты человека HITdb с использованием протокола RDP [19].
Анализ качественного и количественного состава микробиоты кишечника реализовывали посредством идентификации видов, родов и фил микроорганизмов. Для оценки α-разнообразия сообщества вычисляли индекс Chao1; для вычисления показателя количества зафиксированных таксонов (Sobs) и показателя, отражающего реальное количество таксонов (ACE), использовали программу Mothur (версия1.22.0) (http:// www.mothur.org).
Исследование сыворотки крови для оценки концентрации кортизола, мелатонина, TNF-α и IL-17 проведено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и Immuno Biological Laboratories (Германия) согласно инструкции производителя.
Статистический анализ
Статистический анализ полученных результатов проведен с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., USA). Количественные показатели представлены в виде среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD) при нормальном распределении признака и в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала (Q1; Q3) при распределении признака, отличном от нормального. Качественные признаки описывали с помощью абсолютного количества значений и процентных долей. Сравнение между группами по количественным показателям осуществляли c использованием параметрического t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна–Уитни, по качественным – с использованием критерия χ2 (хи-квадрат). Направление и тесноту взаимосвязи между показателями оценивали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми различия считались при р<0,05.
Результаты
Характеристика женщин с ИПВ и контрольной группы представлена в таблице 1. Группы были паритетны по возрасту (р=0,122) и индексу массы тела (р=0,087).
Анализ таксономического состава микробиоты кишечника выявил в группе женщин с ИПВ в сравнении с женщинами контрольной группы статистически значимое сокращение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1 p=0,014) и тренд на снижение индексов ACE и Sobs (р=0,053; р=0,051 соответственно) (рис. 1).
Изменения родового состава кишечной микробиоты в группе женщин с ИПВ в сравнении с контрольной группой характеризовались статистически значимым cнижением представленности Bifidobacterium (р<0,001), Lachnospira (р=0,032), Roseburia (р=0,003), Coprococcus (р=0,012) и повышением представленности Ruminococcus (р<0,001) и Klebsiella (р=0,002) (рис. 2).
У женщин с ИПВ в сравнении с женщинами контрольной группы обнаружено статистически значимое увеличение в сыворотке крови значений кортизола, TNF-α и IL-17 и снижение уровня мелатонина (табл. 2).
Установлены статистически значимые корреляции показателей кортизола с представленностью бактерий Lachnospira (r=-0,51; p=0,002). Также удалось установить связь между значением мелатонина и представленностью бактерий Coprococcus (r=-0,49; p=0,012). Выявлены взаимосвязи концентрации TNF-α и IL-17 с индексом Chao1 (r=-0,51 p=0,002; r=-0,54, p=0,001 соответственно). Концентрация TNF-α положительно коррелировала с представленностью бактерий Ruminococcus (r=0,51; p=0,002), а концентрация IL-17 имела обратную корреляционную связь с представленностью бактерий Bifidobacterium (r=-0,52; p=0,001) (табл. 3).
Обсуждение
В данном исследовании конкретизированы изменения таксономического состава микробиоты кишечника и оценена их связь с сывороточными концентрациями кортизола, мелатонина, TNF-α и IL-17 в группе женщин с ИПВ.
В некоторых ранее выполненных работах были продемонстрированы изменения состава микробиоты кишечника у женщин с ИПВ [11–14]. Нами также установлено, что состав микробного сообщества кишечника у женщин с ИПВ принципиально отличается от такового у женщин с физиологически протекающей беременностью. В частности, у женщин с ИПВ в сравнении с женщинами с физиологически протекающей беременностью констатировано сокращение бактериального α-разнообразия, что объективизировалось статистически более низким индексом Chao1. Аналогичные выводы были представлены Liu Y. et al. [13] и Guang Y. et al. [20].Также у женщин с ИПВ снижена представленность бактерий с иммуномодулирующим потенциалом – представителей рода Bifidobacterium, Lachnospira, Roseburia, Coprococcus и Prevotella, которые, как известно, продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), особенно бутират и пропионат. Понижение содержания последних сопровождается интенсификацией гистондеацетилазы и блокированием рецепторов, сопряженных с G-белками GPR41, GPR43 и GPR109А, и, как следствие – развитием хронического воспаления [21]. С другой стороны, нами обнаружена повышенная представленность потенциальных патобионтов, а именно бактерий рода Ruminococcus и Klebsiella. Представленные нами результаты отчасти согласуются с данными других авторов. В частности, в исследовании Cui Y. et al. [12] снижение представленности бактерий Prevotella, Roseburia, Lachnospirа и повышение представленности бактерий Ruminococcus, Klebsiella было характерно для женщин с ИПВ. В исследовании Liu Y. et al. [13] снижение численности Lachnospira, Roseburia, Prevotella, а в исследовании Jin M. et al. [11] – снижение представленности Prevotella было характерно для женщин с ИПВ. Противоречивость представленных данных во многом может определяться тем фактом, что работы выполнялись в разных географических областях, а также различиями в методологии включения обследованных в исследование. Нами не включались в исследование женщины с отягощенным гинекологическим анамнезом и коморбидной экстрагенитальной патологией, а также принимавшие пробиотики, пребиотики, симбиотические средства в предшествующие 3 месяца до проведения исследования, чтобы исключить их воздействие на результаты работы. Также важно отметить малый размер выборки в ранее описанных исследованиях [12, 13].
Как уже указывалось, у женщин с ИПВ обнаруживаются в крови высокие концентрации кортизола, TNF-α, IL-17 и снижение концентрации мелатонина, роль которых в патогенезе ИПВ подтверждена [4, 5, 8]. Полученные нами результаты сопоставимы с данными литературы: у женщин с ИПВ в сравнении с женщинами с физиологически протекающей беременностью зафиксированы статистически значимые различия по плазменным концентрациям кортизола, мелатонина, TNF-α и IL-17. Принципиально, что отдельные представители микробного сообщества кишечника у женщин с ИПВ сопряжены с плазменными концентрациями исследованных биомаркеров; этот факт может указывать на существование связи между составом, численностью микробиоты кишечника и ИПВ. Отрицательный характер корреляции с плазменной концентрацией кортизола был показан для рода Lachnospira, что свидетельствует о возможной значимой роли этих бактерий в нарушении регуляции функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси при ИПВ. В ходе анализа научных данных мы не обнаружили работ, в которых бы изучали сопряженность микробиоты кишечника с продукцией кортизола у женщин с ИПВ. Вместе с тем в работе Zhang Q. et al. [22] показано, что у больных с синдромом Кушинга Lachnospira отрицательно коррелировала с экспрессией кортизола. Подобная закономерность представлена в исследовании Michels N. et al. [23]: сокращение представленности бактерий Lachnospira было тесно ассоциировано с более высокой концентрацией кортизола у здоровых детей в возрасте от 8 до 16 лет. В литературе нами была обнаружена вероятная интерпретация этой корреляции. Известно, что Lachnospira является одной из основных бактерий, продуцирующих бутират. Ввиду того что КЦЖК обладают способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер, можно обсуждать их участие в регуляции гипоталамо-гипофизарной активности посредством прямого воздействия на секреторную функцию гипофизарных нейронов медиального паравентрикулярного ядра. Указания на то, что КЦЖК обладают способностью воздействовать на экспрессию кортизола, были получены в экспериментальных и клинических исследованиях. Так, в экспериментальном исследовании van de Wouw M. et al. [24] показано, что 7-дневное применение функциональных доз КЦЖК путем прямого введения в толстую кишку обеспечивало увеличение их концентрации в крови и редуцирование интенсивности реакции кортизола на психосоциальный стресс у здоровых лиц.
Обнаружена статистически значимая корреляция между уровнем мелатонина и представленностью бактерий Coprococcus. Можно предположить, что одной из причин установленной нами корреляции является способность последних блокировать сигналы в комплексе р-CREB-связывающего белка – арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы за счет ингибиции триптофана, являющегося прекурсором серотонина, из которого впоследствии и продуцируется мелатонин. В работах отечественных и зарубежных авторов описаны схожие тесные ассоциации представленности Coprococcus с концентрациями метаболитов триптофана и сывороточного мелатонина у пациентов с ювенильным идиопатическим артритом и сахарным диабетом 2 типа [25, 26].
Обсуждая полученные нами результаты в отношении связи микробиоты кишечника с показателями в крови TNF-α и IL-17 в группе женщин с ИПВ, важно отметить, что только некоторые из них согласуются с данными литературы. Ранее взаимосвязь между микробиотой кишечника и провоспалительными цитокинами оценивалась в работе Liu Y. et al. [13]. Было выявлено, что у пациенток с ИПВ уменьшение бактериального разнообразия ассоциировалось с повышением в крови концентрации TNF-α и IL-17 [13]. Полученные нами данные также не противоречат приведенным исследованиям. Этот факт может указывать на то, что у пациенток с ИПВ провоспалительные эффекты микробиома, вероятно, вызваны целостным дисбиозом кишечника. Кроме того, в своем исследовании мы обнаружили прямую связь между уровнем в крови TNF-α и представленностью Ruminococcus. Как известно, бактерии Ruminococcus синтезируют липополисахарид глюкорамнан, который, активируя TLR4-опосредованные реакции, инициирует выработку дендритными клетками костного мозга провоспалительных цитокинов, включая TNF-α [27]. К настоящему времени накоплен достаточный пул исследований, указывающих на то, что Bifidobacterium способны влиять на выраженность воспалительных реакций [28–30]. Так, снижение численности Bifidobacterium сопряжено с развитием преэклампсии [28], сокращением сроков жизни аллотрансплантата сердца, повышенным риском развития аутоиммунных состояний [29] и воспалительных заболеваний кишечника [30]. Как известно, снижение представленности бактерий рода Bifidobacterium сопряжено с активацией ацетилирования гистонов и подавлением метилирования ДНК, что, в свою очередь, приводит к усилению активации транскрипции, опосредованной NF-kB, и интенсификации экспрессии IL-17. Отрицательная корреляция между концентрацией в крови IL-17 и численностью Bifidobacterium, обнаруженная в нашем исследовании, является дополнительным доказательством этой ассоциации. Вместе с тем полученные нами результаты не согласуются с данными исследования Liu Y. et al. [13], в котором была установлена отрицательная связь между концентрацией в крови IL-17 и представленностью Prevotella у женщин с ИПВ. Несогласованность полученных нами результатов с данными сопоставляемого исследования, как указывалось ранее, скорее всего, является следствием различий в дизайне исследования, а именно включением женщин с ИПВ без гинекологической патологии и метаболических нарушений. В то время как в исследовании Liu Y. et al. [13] синдром поликистозных яичников и инсулинорезистентность не являлись факторами исключения. Этот факт мог повлиять на отличия ассоциаций TNF-α и IL-17 с представителями микробиоты кишечника у женщин с ИПВ от имеющихся в литературе. Тем не менее данные, представленные Liu Y. et al. [13], и наши результаты позволяют говорить о существенной роли микробного сообщества кишечника в иммуногенезе ИПВ. Следовательно, причинно-следственная сопряженность между микробиотой кишечника и системным профилем провоспалительных цитокинов при ИПВ нуждается в более углубленной проработке и продолжении исследований в этом направлении.
Заключение
У женщин с ИПВ установлено значительное снижение разнообразия представителей и изменение таксономического состава микробиоты кишечника. Выявленные статистически значимые связи между отдельными представителями микробного сообщества кишечника и гормональными и воспалительными маркерами косвенно подтверждают постулат о сопряженности представленности и состава микробиоты кишечника с ИПВ. Потенциальная коррекция микробиоты кишечника может иметь профилактическую и терапевтическую значимость для женщин с ИПВ.
