По мнению многих исследователей, иммунные механизмы играют важную роль в развитии эндометриоза [2, 7]. Результаты многочисленных работ свидетельствуют, в частности, о существенных нарушениях функции перитонеальных макрофагов при эндометриозе [3, 5, 6]. Показано, что перитонеальные макрофаги женщин с эндометриозом гиперактивированы, продуцируют большое количество цитокинов и факторов роста [3, 6]. Однако, несмотря на высокий уровень активации, макрофаги женщин с эндометриозом не элиминируют из перитонеальной полости жизнеспособные фрагменты рефлюксного эндометрия. Молекулярные основы этого феномена до сих пор остаются до конца не установленными.
Как известно, удаление клеточного дебриса и апоптирующих клеток перитонеальными макрофагами
осуществляется через специфические поверхностные рецепторы, получившие название скевенджер рецепторов (scavenger receptors, или рецепторов-мусорщиков) [4, 6]. Эти рецепторы в настоящее время относят к группе PRR молекул (Pattern recognition receptors, или образ-распознающих рецепторов), которые определяют развитие реакций врожденного иммунитета в результате распознавания консервативных патоген-ассоциированных молекулярных структур [1, 4]. Кроме того, этот класс рецепторов играет важную роль в регуляции различных функций макрофагов, участвуя в активации макрофагов, в развитии их провоспалительной активности, а также в индукции апоптоза и в клиренсе апоптотических клеток [4]. При эндометриозе характер экспрессии рецепторов этого типа перитонеальными макрофагами остается пока практически неизученным.
Целью данного исследования было установить особенности спонтанной экспрессии скевенджер рецепторов перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом, а также определить характер влияния клеток аутологичного эндометрия на экспрессию скевенджер рецепторов макрофагами пациенток с эндометриозом.
Материал и методы исследования
В условиях гинекологической клиники ФГУ Ива новский НИИ материнства и детства им. В.Н. Го родкова Минздравсоцразвития России было про ведено обследование 51 женщины. Обследованные пациентки были распределены в 3 клинические группы. В первую (основную) группу вошли 32 женщины с наружным генитальным эндометриозом. Группу сравнения составили 10 женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором. Контрольная группа включала 9 практически здоровых фертильных женщин, поступивших для проведения плановой хирургической стерилизации. При проведении лапароскопии у них не было выявлено какой-либо генитальной патологии.
Материалом для исследования служила перитонеальная жидкость и биоптаты эндометрия из полости матки. Забор биологического материала производили во время лапароскопии. Выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной жидкости осуществляли стандартным методом скоростного центрифугировании в градиенте плотности фиколл-веро графина (d=1,078). Относительное содержание перитонеальных макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности скевенджер рецепторы А типа (CD204+ макрофаги) и В типа (CD36+ макрофаги), определяли с помощью моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеин изотиоцианатом, анти-CD204 (R&D Systems, USA) и антиСD36 (Beckman Coulter, France) методом проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA).
Для оценки ответа макрофагов на стимуляцию клетками аутологичного эндометрия проводили совместное культивирование in vitro обогащенной популяции перитонеальных макрофагов c эксплантами аутологичного эутопического эндометрия. Биоптаты ткани эутопического эндометрия макроскопически измельчали на фрагменты 1–3 мм в диаметре. Обогащенную фракцию макрофагов выделяли из популяции перитонеальных МНК с помощью стандартной процедуры прилипания клеток к пластику. В прилипающей фракции макрофаги составляли 87–90% всех клеток; 100–200 мкг ткани измельченного эндометрия помещали в 1 мл культуральной среды RPMI 1640, содержащей обогащенную фракцию перитонеальных макрофагов в концентрации 2 106 кл/мл, и инкубировали при 37 °С и 5% СО в течение 24 часов. После окончания срока культивирования проводили разделение фрагментов эндометриальной ткани и популяции перитонеальных макрофагов путем фильтрации через стальную мелкоячеистую сетку. Полученные макрофаги отмывали в среде RPMI 1640 и метили моноклональными антителами для проведения цитометрических исследований. Показатели перитонеальных макрофагов, которые культивировались в тех же условиях только в среде RPMI 1640, использовали в качестве контроля.
Статистическая обработка данных включала определение среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследования
Возраст обследованных пациенток колебался от 26 до 35 лет и не различался в группах. Репродуктивная функция была реализована у 100% женщин контрольной группы. Роды в анамнезе были у 22% женщин основной группы и у 31% женщин группы сравнения. У всех женщин основной группы и группы сравнения на момент обследования было диагностировано бесплодие, при этом у женщин с наружным генитальным эндометриозом чаще отмечалось первичное бесплодие (56% случаев), а у женщин с трубно-перитонеальным фактором – вторичное бесплодие (78% случаев). В ходе проведения лапароскопической операции у всех женщин основной группы был выявлен наружный генитальный эндометриоз. По степени распространенности эндометриоидного процесса у женщин основной группы в 60% случаев был выявлен эндометриоз II степени, а в 40% случаев были диагностированы III и IV степени эндометриоза. У женщин группы сравнения в 100% случаев был диагностирован хронический сальпингит, который сочетался со спаечным процессов в малом тазу
в 22% случаев.
Мы провели оценку характера экспрессии скевенджер рецепторов A и В типа (CD204 и CD36 молекул)
перитонеальными макрофагами при эндометриозе. Анализ данных показал, что уровень CD204+ и CD36+ макрофагов в перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом был достоверно ниже аналогичных показателей у здоровых женщин (p<0,05 в обоих случаях, табл. 1). В группе сравнения экспрессия скевенджер рецепторов A и В типов перитонеальными макрофагами достоверно не отличалась от таковой в группе контроля (p>0,05 в обоих случаях). При сравнительном анализе данных у женщин основной клинической группы и группы сравнения было установлено, что содержание в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом CD204+ макрофагов было значительно ниже, чем у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием (p<0,01, табл. 1).
Таблица 1. Характеристика спонтанной экспрессии скевенджер рецепторов на поверхности
перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом.
Так как в основную группу женщин вошли пациентки с различными степенями эндометриоза, мы провели дифференцированный анализ данных, характеризующих спонтанную экспрессию скевенджер рецепторов перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндо метриозом в зависимости от степени распространенности эндометриоидного процесса. Как при I–II, так и при
III–IV степенях эндо метриоза экспрессия CD36 и CD204 молекул перитонеальными макрофагами
была достоверно ниже аналогичных показателей в контрольной группе (табл. 1). При этом достоверных отличий в экспрессии перитонеальными макрофагами скевенджер рецепторов в подгруппах женщин с наружным генитальным эндометриозом I–II и III–IV степенями распространенности патологического процесса выявлено не было (p>0,05 во всех случаях). При изучении ответа самих перитонеальных макрофагов на стимуляцию клетками эутопического эндометрия было установлено, что в контрольной группе после совместной инкубации макрофагов с аутологичным эндометрием происходило достоверное усиление экспрессии CD36 и CD204 мо лекул на поверхности макрофагов (p<0,05 в обоих случаях, табл. 2). У женщин с трубно-пе ри тонеальным
бесплодием в ответ на сти муляцию аутологичным эндометрием отмечалось значительное повышение
уровня CD36+ макрофагов (p<0,001). У пациенток с наружным генитальным эн дометриозом мы
не отмечали каких-либо изменений в экспрессии скевенджер рецепторов на поверхности макрофагов
после их контакта с аутологичным эндометрием (p>0,05 в обоих случаях, табл. 2).
Таблица 2. Характеристика экспрессии скевенджер рецепторов на поверхности перитонеальных
макрофагов после их взаимодействия с клетками аутологичного эндометрия.
Обсуждение
Таким образом, для женщин с наружным генитальным эндометриозом была характерна сниженная экспрессия скевенджер рецепторов перитонеальными макрофагами. Следует отметить, что угнетение экспрессии рецепторов этого типа не зависело от степени патологического процесса и было характерно как для женщин с малыми формами наружного генитального эндометриоза, так и для пациенток с распространенными формами эндометриоза. Так как подобных изменений не было отмечено в группе сравнения, то мы сделали вывод о том, что нарушения в экспрессии скевендер-рецепторов не связаны с бесплодием, которое было диагностировано у всех пациенток с эндометриозом, а определяются наличием эндометриоидных очагов в перитонеальной полости
у женщин основной группы. В литературе ранее высказывалось мнение о том, что нарушение клиренса фрагментов рефлюксного эндометрия из перитонеальной полости у женщин с эндометриозом может быть связано с экспрессией функционально неполноценных скевенджер рецепторов перитонеальными макрофагами [6]. Однако экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу, в доступной нам литературе мы не встретили.
Как известно, молекулы CD204, относящиеся к A классу скевенджер рецепторов, участ вуют
в распознавании макрофагами моди фицированного аполи попротеина В, ли по про теинов низкой
плот ности, апоптотических клеток, β-амилоидного пептида, фосфолипидов [4]. Эти рецепторы вовлекаются также в развитие как адаптивного, так и врожденного иммунного ответа вследствие распознавания различных грам- и грам+ патогенов [4]. CD36 молекулы, относящиеся к В классу скевенджер рецепторов, регулируют более широкий спектр физиологических и па тологических процессов, включая клиренс апоп тотических клеток, транспорт жирных кислот, адгезию, ангиогенез, атеросклероз и проти вомикробную защиту [4]. Учитывая эти данные, можно предположить, что выявленное нами снижение экспрессии CD204 и CD36 молекул на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом может приводить к угнетению своевременного клиренса макрофагами эндометриальных клеток из перитонеальной полости.
Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при эндометриозе нарушен ответ перитонеальных макрофагов на сти муляцию клетками эутопического эндометрия и в нарушение этого ответа непосредственно во влекаются скевенджер рецепторы.
При анализе данных, полученных после про ведения in vitro совместного культивирования перитонеальных макрофагов с клетками аутологичного эндометрия, было установлено, что у здоровых женщин и у женщин с трубно-пери тонеальным бесплодием взаимодействие перитонеальных макрофагов с аутологичным эндометрием приводит к значительному усилению экспрессии макрофагами скевенджер рецепторов. По-видимому, данное явление является физиологичным и отражает нормальную реакцию макрофагов на клетки эктопически перемещенного эндометрия.
У пациенток с наружным генитальным эндометриозом каких-либо изменений в экспрессии
скевенджер рецепторов на поверхности макрофагов после их контакта с аутологичным эндометрием
не происходило. С одной стороны, отсутствие ответа макрофагов на клетки эндометрия может быть
связано с измененными антигенными свойствами самой эндометриальной ткани при эндометриозе.
В литературе имеются данные о том, что в эндометрии пациенток с эндометриозом отмечается аберрантная экспрессия ряда минорных трансплантационных антигенов, интегриновых молекул и белков теплового шока, нарушена регуляция апоптоза [8, 9]. Существует мнение, что эти особенности эндометриальной ткани при эндометриозе позволяют эндометриальным клеткам ускользать от атаки со стороны клеток иммунной системы, в том числе и со стороны перитонеальных макрофагов [9].
С другой стороны, отсутствие адекватного ответа макрофагов на клетки аутологичного эндометрия
может определяться изменением функциональной активности самих перитонеальных макрофагов. Как
известно, скевенджер рецепторы непосредственно участвуют в процессах клеточной адгезии, а антитела к ним способны блокировать адгезию клеток [4]. Изначально низкая экспрессия скевенджер рецепторов может вести к нарушению контакта макрофагов с объектами фагоцитоза, результатом чего является угнетение в макрофагах каскада внутриклеточных процессов, способствующих полно ценной элиминации из перитонеальной полости клеток эктопически перемещенного эндометрия.
Таким образом, угнетение экспрессии «рецепторов-мусорщиков» на поверхности перитонеальных макрофагов является важным фактором, определяющим нарушение локального иммунного ответа в перитонеальной полости на клетки эктопического эндометрия и участвующим в механизмах развития и роста эндометриоидных очагов.
