Возрастающий уровень имплантационных нарушений и, как следствие, бесплодие требуют новых исследований для объяснения этого феномена, имеющего серьезный социально-экономический эффект. Во всем мире регистрируется 10–15% бесплодных браков, и имеется тенденция к их нарастанию [1]. Современный уровень развития методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является залогом их эффективного комплексного применения в лечении бесплодия в браке. Имплантация представляет собой один из важных этапов для достижения успеха в программах вспомогательных репродуктивных технологий [1]. Ее наступление зависит от трех основных составляющих: качества эмбрионов, рецептивности эндометрия, и хорошо сбалансированного взаимодействия эмбриона и эндометрия [2]. Имплантация эмбриона является одной из важных составляющих для наступления беременности, и неудача имплантации остается нерешенной проблемой в программах ВРТ. В двух третях неудач имплантации основной причиной является нарушение рецептивности эндометрия, в то время как сам эмбрион несет ответственность лишь за одну треть неудач [3]. Поэтому внимание исследователей сконцентрировано на особенностях эндометрия для повышения эффективности ВРТ. На сегодня существует две стратегии проведения ВРТ: перенос эмбриона в стимулированном цикле, когда эндометрий испытывает существенные гормональные влияния, связанные со стимуляцией, и перенос в естественном цикле, где эндометрий находится в физиологическом состоянии, но требуется криоконсервация и затем размораживание эмбрионов. Данная статья посвящена сравнению указанных стратегий.
Целью настоящего систематического обзора было оценить эффективность циклов переноса криоконсервированных/размороженных эмбрионов в программах ВРТ по сравнению с циклами переноса свежих эмбрионов.
Окно имплантации
Эндометрий восприимчив для эмбриона только в течение определенного периода времени максимальной рецептивности. Это так называемое «окно имплантации», период которого составляет несколько дней – примерно с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла, на 6–10-й день после пика лютеинизирующего гормона, в течение которого эндометрий находится в состоянии морфологической и функциональной зрелости для успешного прикрепления бластоцисты [2, 3]. Известно, что уровень сывороточных гормонов в естественном менструальном цикле, который влияет на развитие эндометрия, значительно меняется в стимулированных циклах программ ЭКО, в связи с чем «окно имплантации» сдвигается во времени или может отсутствовать [4]. Показана более высокая частота имплантации, клинической и прогрессирующей беременности в криоциклах ВРТ [4].
К настоящему времени стало совершенно очевидно, что наряду с эндокринным контуром регуляции репродуктивной системы существует и цитокиновый. Критические репродуктивные события, такие как менструация, овуляция, имплантация, характеризуются активацией цитокинового каскада в репродуктивной системе и, в частности, в яичниках и эндометрии, что позволяет иначе взглянуть на проблему неудач в програмах ВРТ. Однако некоторые механизмы этого влияния до сих пор во многом не изучены. Более того, наши знания о роли воспаления и его влиянии на репродуктивную функцию с современных позиций должны быть модифицированы [5]. С одной стороны, все инфекционные и воспалительные заболевания, даже протекающие субклинически, являются причиной нарушения имплантации. С другой – определенный уровень активации воспалительного ответа является необходимым для наступления беременности [6].
Это во многом связано с понятием «низкоуровневого» или физиологического воспаления, и механизмов его реализации. Поляризация иммунного ответа по Тh1 и Тh2 пути и деление макрофагов на М1 и М2 связаны с экспрессией разных спектров цитокинов и, соответственно, с совершенно различным их действием на ткани. Известно, что имплантация эмбриона связана с активностью Тh1, в то время как успешная беременность – с Тh2 вариантом иммунного ответа. Таким образом, на различных этапах беременности преобладают разные звенья иммунитета, то есть происходит переключение с одного вида иммунного ответа на другой [5].
Эндометрий представлен поверхностными эпителиальными клетками, гландулярным эпителием, а также гетерогенной стромой. Все эти компоненты взаимодействуют и осуществляют синтез и секрецию цитокинов под контролем половых гормонов. Цитокины эндометрия человека контролируются напрямую стероидными гормонами яичников, а также опосредованно через циклические изменения таких медиаторов, как факторы роста, медиаторы иммунитета, а при имплантации — и факторы, происходящие из эмбриона. Последняя позиция и составляет особенность иммунологии репродукции. Строма эндометрия человека представлена фибробластами, макрофагами, Т-клетками и естественными киллерными клетками. Неслучайно матка признана уникальным иммунным органом. Уникальность заключается в том, что приходящие в этот орган различные популяции лейкоцитов подвергаются трансформации, фенотипическое типирование которых затруднено, а соответственно, пока невозможно определить их функциональную активность и значимость [5].
Эндометрий подвергается постоянным изменениям в течение менструального цикла под воздействием эстрогенов и прогестерона в соответствии с изменениями их концентрации [7]. Для успешного наступления имплантации развитие эндометрия и эмбриона должно быть синхронным. Можно предположить, что эмбрион, в свою очередь, также каким-то образом способствует созреванию эндометрия. Нарушения этого баланса могут изменить восприимчивость эндометрия и нарушить процесс имплантации.
Поэтому рецептивность эндометрия имеет важное значение для наступления беременности в естественных циклах, также как и в циклах лечения бесплодия [8].
Во многих исследованиях было высказано предположение, что контролируемая стимуляция суперовуляции отрицательно влияет на рецептивность эндометрия во время циклов ВРТ [9]. Это взаимодействие опосредовано суперфизиологическим уровнем эстрадиола и прогестерона при стимуляции во время фолликулярной фазы, что приводит к более быстрым морфологическим и биохимическим изменениям эндометрия. Эти колебания уровня гормонов могут приводить к асинхронности между готовностью эндометрия и переносом эмбрионов, что может служить причиной неудачи имплантации [10–12]. Показано, что высокие дозы эстрадиола приводят к активации воспалительного каскада, необходимого для имплантации, за счет гиперэкспрессии провоспалительных цитокинов по сравнению с естественным циклом. В конечном итоге, все эти изменения могут влиять на эффективность лечения бесплодия.
В программах ВРТ самые высокие показатели беременности получают в не стимулированных циклах с донорскими ооцитами. В этих циклах эмбрионы переносятся в эндометрий, который не подвержен действию суперфизиологических гормональных уровней, как при стимуляции суперовуляции, и максимально восприимчив к молекулярным сигналам, поступающим со стороны эмбриона [10]. Существуют технологии, использующие синхронизацию циклов донора и реципиента для исключения необходимости криоконсервации эмбрионов. В исследованиях, где при синхронизации циклов осуществляли перенос эмбрионов как донорам, так и реципиентам, были отмечены более высокие показатели беременности у реципиентов в сравнении с донорами ооцитов, хотя ооциты были одинакового качества, что может быть связано с негативным влиянием стимуляции у доноров ооцитов [10].
На сегодняшний день в связи с успехами методов криоконсервации эмбрионов качество замороженных эмбрионов и их потенциал имплантации не отличаются от свежих эмбрионов [13, 14]. Хотя в большинстве исследований, сравнивающих перенос нативных и криоконсервированных/размороженных эмбрионов, эмбрионы лучшего качества выбираются для переноса в стимулированном цикле, результаты схожи в обоих случаях [4]. Некоторые исследования показали хорошие результаты при криоконсервации всех полученных эмбрионов с последующим переносом размороженных эмбрионов у пациенток с повышенным риском развития синдрома гиперстимуляции яичников [15–18]. Поэтому при выборе эмбрионов хорошего качество для переноса в криоциклах и достижения наилучшей рецептивности эндометрия в этих циклах, можно получить более высокую частоту имплантации, тем самым повысить эффективность программ ВРТ.
В то же время в циклах с переносом криоконсервированных/размороженных эмбрионов оптимальная морфо-функциональная готовность эндометрия может быть достигнута использованием эстрогенов и прогестерона. В этом случае можно регулировать «окно имплантации» более точно, чем в циклах стимуляции суперовуляции с гонадотропинами [11, 12].
Криоконсервация эмбрионов
Криоконсервация гамет и эмбрионов человека – составляющая часть ВРТ. Одной из актуальных задач репродуктивной медицины является возможность длительного хранения криоконсервированных эмбрионов, что требует знания основных принципов криобиологии и совершенствования клинических и лабораторных подходов для успешной реализации программ криоконсервации [19].
Криоконсервация спематозоидов, ооцитов и эмбрионов представляет собой заморозку образцов, обработанных специальными средами, которые позволяют максимально заместить воду веществами-криопротекторами без ущерба для клеток. При температуре –196°С замедляются или прекращаются биохимические процессы клеточного метаболизма, лежащие в основе гибели клетки. Минимизация количества воды в образце позволяет избежать образования кристаллов льда, которые разрушают клетки в процессе заморозки и разморозки. Для криоконсервации эмбрионов используют ампулы или пластиковые мини-соломинки объемом 0,25 мл. Существует два метода – медленное замораживание и витрификация, по которым проводят криоконсервацию и последующее размораживание биологического материала.
В настоящее время «золотым стандартом» криоконсервации признана методика ультрабыстрой заморозки – витрификация.
Значительную роль в формировании успеха криоциклов ВРТ вносит качество размороженных эмбрионов. Отбор жизнеспособных эмбрионов с хорошим прогнозом выживаемости после размораживания имеет важное значение для наступления беременности. Сохранение жизнеспособности эмбрионов в период фазовых изменений при криоконсервации зависит от ряда как физических (скорость охлаждения, химические криопротекторы, кристаллообразование, скорость оттаивания, удаление криопротектора), так и эмбриологических (эмбрионы на стадии пронуклеусов, эмбрионы ранних стадий дробления, эмбрионы на стадии бластоцисты) факторов.
Согласно данным зарубежной литературы [19], при криоконсервации эмбрионов на стадии пронуклеусов высока вероятность хаотического рассеивания хромосом и гибели зигот при замораживании. Относительно низкая жизнеспособность данных эмбрионов отрицательно влияет на частоту наступления беременности.
Эмбрионы ранних стадий дробления (2–8 бластомеров) пригодны для замораживания, если они в соответствии с морфологическими критериями относятся к классу качества 1 или 2 и содержат не более 20% цитоплазматических фрагментов. Основополагающими критериями эффективности программ замораживания являются морфологическая интактность эмбрионов после оттаивания и их способность к дальнейшему дроблению in vitro. Эмбрионы считаются выжившими, если по крайней мере 50% их бластомеров остаются интактными после оттаивания и удаления криопротекторов (индекс выживаемости 50%). Частота выживаемости определяется отношением числа выживших эмбрионов к числу всех криоконсервированных/размороженных эмбрионов и выражается в процентах.
Перенос криоконсервированных/размороженных эмбрионов
Первая беременность пациентки после переноса в полость матки криоконсервированных/размороженных эмбрионов была получена австралийскими врачами Тронсоном и Мором в 1983 г.
Программа криоконсервации имеет ряд существенных преимуществ:
- повышение индивидуальной вероятности наступления беременности;
- снижение числа повторных стимуляций яичников и пункций фолликулов, что значительно снижает медикаментозную нагрузку на женский организм;
- значительная экономия средств пациентов на приобретение дополнительных лекарств;
- предупреждение синдрома гиперстимуляции яичников;
- возможность зачатия ребенка через несколько лет, в том числе и после лечения онкологических заболеваний;
- возможность донорской передачи эмбрионов другим бесплодным семьям.
Однако у программы есть и недостаток – вероятность потери части эмбрионов в процессе замораживания и размораживания. По этой причине следует учесть все детали и особенности криоконсервации с целью сохранения большего числа эмбрионов.
В настоящее время криоконсервация методом витрификации делает возможным более широкое применение криопереносов как альтернативы переносам нативных эмбрионов. Также нужно учитывать тот факт, что эндометрий в стимулированном цикле претерпевает ряд изменений и оптимально не подготовлен к полноценному процессу имплантации [20].
Криоконсервация эмбрионов значительно расширяет клинические преимущества и возможности циклов ЭКО, повышая кумулятивную частоту наступления беременности в расчете на один цикл стимуляции суперовуляции. По данным исследования, проведенного C. Shen и соавт., частота наступления беременности при переносе криоконсервированных эмбрионов на стадии бластоцисты в сравнении с переносом нативных эмбрионов выше и составила 59,8 и 35,8% соответственно у женщин до 35 лет и 55,8 и 26,9% у женщин старше 35 лет [21]. Это в первую очередь связано c появлением нового сверхбыстрого способа замораживания эмбрионов – витрификации. Благодаря высокой скорости замораживания вода сразу переходит в желеобразное состояние, а эмбрион на 95% состоит из воды [19].
По результатам многих исследований при переносе криоконсервированных/размороженных эмбрионов по сравнению с переносом свежих эмбрионов значительно повышается частота наступления клинической беременности и текущие показатели беременности у пациенток в программах ЭКО. Результаты проведенных исследований также показали, что криоконсервация всех полученных эмбрионов хорошего качества с последующим переносом в криоцикле более выгодна для пациенток с нормальным и гиперответом на стимуляцию суперовуляции [4].
Полученные данные в пользу переноса криоконсервированных эмбрионов в сравнении с переносом свежих эмбрионов могут быть связаны с неблагоприятными последствиями стимуляции суперовуляции на рецептивность эндометрия и гиперактивацией провоспалительных цитокинов, и как следствие, воспаления в нем, а также с совершенствованием методов криоконсервации [4].
В конце фолликулярной фазы при стимуляции суперовуляции, небольшое увеличение уровня прогестерона в сыворотке крови (то есть преждевременная лютеинизация) напрямую коррелирует с уровнем ФСГ, и это увеличение связано с преждевременной перестройкой ультраструктурной морфологии эндометрия и его эхогенности [11, 22–24]. В циклах со стимуляцией суперовуляции повышение уровня прогестерона может привести к преждевременному созреванию эндометрия, не влияя при этом на качество эмбрионов, и тем самым к снижению частоты имплантации вследствие асинхронности между переносом эмбриона и восприимчивостью эндометрия [25].
Наилучшая рецептивность эндометрия достигается в естественных циклах или в циклах с заместительной гормональной терапией экзогенными эстрогенами и прогестероном, по сравнению со стимулированными циклами [7, 26]. Существуют данные, что высокий уровень эстрогенов (>2500 пг/мл) может ухудшить созревание эндометрия и имплантацию [26]. В нескольких исследованиях были описаны случаи трансформации эндометрия в самом начале лютеиновой фазы у женщин в циклах стимуляции суперовуляции, и если это происходило раньше, чем на 3 дня, то беременность не наступала [9]. Профиль экспрессии генов эндометрия может быть избыточным или недостаточным у пациенток, подвергшихся стимуляции суперовуляции, в частности экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона изменяется в стимулированных циклах, что указывает на преждевременное созревание эндометрия по сравнению с естественными циклами [27–29].
Криоконсервация эмбрионов стала рутинной процедурой при проведении программы ЭКО при невозможности переноса нативных эмбрионов. В циклах переноса криоконсервированных/размороженных эмбрионов эндометрий готовится к переносу в естественном цикле, либо с применением заместительной гормональной терапии. Высказано предположение, что во время переноса криоконсервированных/размороженных эмбрионов эндометрий более восприимчив к имплантации, чем в циклах стимуляции суперовуляции [30, 31].
Существуют различные способы подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов, но из-за недостатка доказательств рекомендовать какой-либо один конкретный протокол не представляется возможным [32]. Использование метода витрификации с недавних пор при криоконсервации эмбрионов показало более высокую выживаемость эмбрионов по сравнению с медленным замораживанием, в результате чего значительно повысило частоту имплантации и наступление беременности в расчете на перенос [30, 33–36]. Таким образом, использование криоконсервации жизнеспособных эмбрионов может быть альтернативой, чтобы избежать вредного воздействия на готовность эндометрия к имплантации эмбриона при стимуляции суперовуляции [4].
Хотя во многих проводимых исследованиях не оценивали частоту рождения живого ребенка, а судили об эффективности лечения бесплодия на основании наступления клинической беременности и ее текущих показателей, как основных итогов являющихся общепринятыми [37], эти показатели вполне сопоставимы и могут быть применены для оценки эффективности программ ЭКО [4]. Во всех исследованиях можно сделать предположение о рецептивности эндометрия, но не утверждать точно. Вполне возможно, что процесс криоконсервациии/разморозки косвенно повлек за собой выбор лучших эмбрионов, повышая при этом долю хороших эмбрионов в группе переноса криоконсервированных/размороженных эмбрионов, тем самым повышая эффективность, приписываемую лучшей рецептивности эндометрия [14]. Так как в исследования были включены пациенты с нормальным ответом и гиперответом яичников на стимуляцию суперовуляции, полученные результаты не могут быть экстраполированы на все типы пациентов в программах ВРТ.
Заключение
Таким образом, результаты многих исследований свидетельствуют о повышении частоты имплантации, наступления клинической беременности и ее успеха путем переноса криоконсервированных/размороженных эмбрионов в не стимулированном цикле по сравнению с переносом нативных эмбрионов в циклах стимуляции суперовуляции. Эти результаты могут быть объяснены более точной синхронизацией взаимодействия эмбриона с эндометрием и оптимальным уровнем физиологического воспаления при переносе в естественном цикле по сравнению с циклами стимуляции суперовуляции. Полученные данные дают основания для пересмотра стандартной тактики проведения программы ВРТ в пользу криоконсервации эмбрионов для переноса в не стимулированном цикле.
