Патогенез снижения фертильности при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов

Божедомов В.А., Николаева М.А., Ушакова И.В., Спориш Е.А., Рохликов И.М., Липатова Н.А., Сухих Г.Т.

Цель исследования. Показать связь между аутоиммунными реакциями против сперматозоидов, их функциональными характеристиками и реальной фертильностью.
Материал и методы. Выполнено клинико-лабораторное обследование 425 мужчин из бесплодных пар в возрасте 18–45 лет; фертильные мужчины, жены которых были беременны на сроке 8–16 нед, составили контрольную группу (n=82). Исследование спермы проводили в соответствии с требованиями ВОЗ, применяли компьютерный анализ спермы (CASA). Определение антиспермальных антител (АСАТ) в сперме – MAR и проточная цитофлуорометрия, в сыворотке крови – ELISA. Спонтанную и индуцированную ионофором А23187 акросомальную реакцию (АР) – с помощью двойного флуоресцентного окрашивания сперматозоидов с использованием флуоресцин-изотиоционат-меченного лектина P. sativum и тетраметилродамин-изотиоцианат-меченого лектина A. hypogaea. Оценку оксидативного стресса (ОС) проводили методом люминолзависимой хемилюминесценции. Повреждение хромосом апределяли по фрагментации ДНК методом дисперсии хроматина в геле инертной агарозы с визуальной оценкой под микроскопом образования ореола после кислотной денатурации ДНК и лизирования протеинов ядра.
Результаты исследования. Снижение реальной фертильности пропорционально проценту MAR-позитивных сперматозоидов. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов сопровождаются гиперпродукцией активных форм кислорода. Имеется положительная корреляция между результатами MAR-теста и трековой скоростью сперматозоидов, амплитудой колебания головки, процентом сперматозоидов с преждевременной и отсутствующей АР, процентом сперматозоидов с фрагментацией ДНК и степенью такой фрагментации.
Заключение. Ведущими факторами снижения фертильности у мужчин с АСАТ являются функциональные нарушения сперматозоидов: преждевременная гиперактивация, повышенная и/или отсутствующая АР и повышенная фрагментация ДНК. Патогенез патоспермии при иммунном бесплодии связан с ОС.

Ключевые слова

иммунное бесплодие
антиспермальные антитела
оксидативный стресс
акросомальная реакция
фрагментация ДНК сперматозоидов

Одной из причин мужского бесплодия являются аутоиммунные реакции против сперматозоидов, которые сопровождаются выработкой антиспермальных антител – АСАТ [1]. В присутствии АСАТ происходит агглютинация и снижение подвижности сперматозоидов, нарушается проникновение в цервикальную слизь и оплодотворение яйцеклетки; имеются данные, что АСАТ могут оказывать отрицательное влияние на раннее развитие эмбриона, имплантацию и течение беременности [2–7]. Однако патогенез снижения фертильности и невынашивания беременности при наличии АСАТ все еще не ясен.

Цель исследования: показать связь между аутоиммунными реакциями против сперматозоидов, их функциональными характеристиками и реальной фертильностью.

Материал и методы исследования

Выполнено клинико-лабораторное обследование 425 мужчин из бесплодных пар в возрасте 18–45 лет; фертильные мужчины, жены которых были беременны на сроке 8–16 нед, составили контрольную группу (n=82).

Исследование спермы проводили в соответствии с требованиями ВОЗ [8]. Вычисляли индекс качества спермы (ИКС) – количество сперматозоидов с нормальной морфологией и прогрессивной подвижностью в эякуляте (млн/эякулят). Дополнительно оценивали подвижность сперматозоидов с помощью компьютерного спермоанализатора «MTG» (Medical Technology Vertriebs Gmbh, Германия), программы «medeaLAB CASA»: вычисляли криволинейную (трековую) скорость (VCL, мкм/сек), прямолинейную скорость (VSL, мкм/сек), амплитуду горизонтального перемещения головки (ALH, мкм/сек) и линейность (LIN, %). Определение АСАТ IgG и IgA на сперматозоидах осуществляли методом MAR (mixed antiglobulin reaction) (Ferti Pro N.V., Бельгия) и с помощью проточной цитофлуорометрии (ПЦМ) с использованием приборов Facscan (Becton Dickinson, США) и Bryte (Bio-Rad, Италия); в сыворотке крови – с использованием набора «Spermatozoa antibody ELISA» (IBL, Германия). На основании результатов MAR-теста выделяли группу пациентов с умеренно выраженными иммунными реакциями (MAR%IgG=10–49%) и группу с аутоиммунным бесплодием по ВОЗ (MAR%IgG>50%).

Для оценки спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомальной реакции (АР) применяли способ двойного флуоресцентного окрашивания сперматозоидов с использованием флуоресцин-изотиоционат-меченного лектина P. sativum (Sigma, США) и тетраметилродамин-изотиоцианат-меченного лектина A. hypogaea (Sigma, США) [9]. Оценку оксидативного стресса (ОС) осуществляли путем определения интенсивности свободно-радикальных процессов методом люминолзависимой хемилюминесценции [10] с использованием люминометра «LKB-Wallac 1256» (Финляндия) и «Хемилюминометра-003» (Россия). Об интенсивности хемилюминесценции судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования активных форм кислорода (АФК). Повреждение хромосом сперматозоидов характеризовали по фрагментации ДНК, оцениваемой методом дисперсии хроматина (SCD-test, Испания) в геле инертной агарозы с визуальной оценкой под микроскопом образования ореола после кислотной денатурации ДНК и лизирования протеинов ядра [11]. Оценивали процент сперматозоидов с признаками апоптоза и степень нарушения образования ореола по 5-балльной шкале.

Статистическая обработка данных выполнена с применением пакета прикладных программ «Statistica» (StatSoft, США); вычисляли медиану, M, S, значимость различий оценивали по критериям Стьюдента, Манна-Уитни и Фишера для независимых выборок, Хи-квадрат, выполняли корреляционный анализ (вычисляли коэффициенты R, Gamma).

Результаты исследования и обсуждение

В группах пациентов с АСАТ показатели спермограммы были существенно хуже, чем у фертильных мужчин (p<0,05–0,01), но в большинстве случаев соответствовали нормозооспермии [8] и не отличались при различных значениях MAR-теста (см. таблицу; p>0,05). Корреляция между наличием АСАТ и отдельными показателями спермограммы слабая. Имелись различия при использовании разных методов определения АСАТ: ИКС не зависел от MAR%IgG и IgA (p>0,05), количества АСАТ в крови, по данным ELISA (p>0,05), но отрицательно связан с процентом живых гамет, покрытых АСАТ IgG, по данным ПЦМ (R=-0,29; p=0,0005). Это подтверждает данные, полученные нами ранее [12].

Клинический показатель – длительность вынужденного бесплодия (ДВБ), – наоборот, зависел от результатов MAR IgG-теста даже при нормозооспермии (R=0,39; р=0,00001); причем антитела класса IgG демонстрируют в 2 раза более сильную связь, чем IgA (R=0,20; p=0,03); корреляции ДВБ с данными ПЦМ и содержанием АСАТ в крови (ELISA) нет (p>0,05).

Эти данные свидетельствуют о том, что снижение фертильности на фоне АСАТ обусловлено главным образом функциональными нарушениями сперматозоидов и подтверждают мнение, что методы обнаружения АСАТ на подвижных гаметах наиболее значимо связаны с реальной фертильностью [8, 13].

Для характеристики оплодотворяющей способности спермы использована оценка капацитации сперматозоидов (Кс) и АР, которые являются взаимосвязанными, но двумя отдельными событиями [14].

Компьютерная оценка подвижности показала (рис. 1), что с увеличением доли АСАТ-позитивных сперматозоидов увеличиваются их прямолинейная и криволинейная скорости, амплитуда горизонтального перемещения головки, т.е. наблюдаются начальные признаки гиперактивации, которую считают проявлением Кс [15, 16]. В норме Кс происходит в женском половом тракте при действии цитокинов, прогестерона и рецепторов zona pellucida и является условием для АР – необходимого процесса для пенетрации яйцеклетки [16, 17]. Преждевременная Кс до попадания в женский организм может рассматриваться как фактор, снижающий фертильность.

Ранее было показано, что существует положительнаясвязьмеждупроцентомАСАТ-позитивных сперматозоидов и процентом гамет, преждевременно утративших акросому [18, 19]. Согласно нашим уточненным данным, при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов имеют место нарушения двух типов: избыточность спонтанной и недостаточность индуцированной АР. Как видно на рис. 2, нередко эти нарушения наблюдаются вместе. Чем больше сперматозоидов покрыты АСАТ, тем больше выражены эти нарушения: только у 40% мужчин с иммунным бесплодием по ВОЗ сохраняется нормальная АР, что существенно меньше, чем у фертильных (p<0,001) и в группе с MAR%IgG=10–49% (p<0,01).

Остается неясным принципиальный вопрос: сами аутоиммунные реакции против сперматозоидов вызывают нарушения АР, или АСАТ взаимодействуют с гаметами, акросома которых неполноценна в результате действия каких-то других факторов – генетических или экзогенных.

Полученные данные об отрицательном влиянии аутоиммунных реакций на Кс и АР объясняют результаты исследований, в которых было получено снижение успеха оплодотворения яйцеклетки in vitro спермой с АСАТ [5, 7]. В то же время ясности в этом вопросе нет, поскольку, по мнению авторов недавнего систематического обзора и мета-анализа [20], наличие АСАТ не влияет на процент беременностей при ЭКО и переносе эмбриона.

Полученные нами данные позволяют объяснить обнаруженное некоторыми авторами увеличение процента неудачных беременностей при наличии АСАТ [2, 3]. Установлено, что при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов растет доля гамет с нарушениями структуры хромосом. В среднем, процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК при иммунном бесплодии (MAR%>50%) в 1,6 раза больше, чем при MAR%=10–49% (р=0,003); в пределах нормы – 10 и 55% значений у пациентов этих групп (p<0,01) соответственно. Для степени фрагментации ДНК различия выражены меньше – в 1,25 раза (р=0,01); в пределах нормы – 21 и 55% образцов соответственно. Зависимость между MAR IgG и повреждением ДНК – прямая: R=0,48 (p=0,003) для процента сперматозоидов с фрагментацией ДНК и R=0,43 (p=0,007) для степени дисперсии хроматина (рис. 3).

Вероятной причиной преждевременной АР и повышенной фрагментации ДНК при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов является ОС. Известно, что избыточная продукция АФК при инфекционно-воспалительных процессах, варикоцеле, диабете и некоторых других заболеваниях приводит к повреждению мембраны сперматозоидов, снижению их подвижности и нарушению оплодотворяющей способности [21–23]. При этом АФК способны непосредственно повреждать ДНК хромосом и инициировать апоптоз сперматозоидов [23–25], в результате чего беременности чаще заканчиваются спонтанными абортами [26], могут возникать врожденные аномалии и детские раки [25, 27]. Способность АСАТ нарушать развития зародыша обсуждается давно [4], имеются подтверждающие это экспериментальные данные [28]; иммунные реакции против сперматозоидов у женщин считают фактором нарушения имплантации [29]. Но имеются ли повреждения структуры ДНК при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов, не известно. Нами впервые было установлено [22, 30], что у пациентов с иммунным бесплодием продукция в сперме АФК существенно повышена: между MAR% IgG и продукцией АФК имеется прямая зависимость (R=0,34; p=0,03); еще более сильна связь продукции АФК с количеством IgG на гаметах, по данным ПЦМ (R=0,81; p=0,0007).

Роль ОС в патогенезе мужского иммунного бесплодия подтверждает использование антиоксидантов, способных химически связать избыток АФК и предотвратить повреждение клетки. На фоне лечения происходит быстрое уменьшение доли АСАТ-позитивных сперматозоидов и нормализация АР [31].

Полученные данные уточняют патогенез снижения фертильности при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов, и заставляют более осторожно относиться к применению методов ЭКО, в т.ч. интрацитоплазматической инъекции сперматозоида при иммунном мужском бесплодии, когда имеет место ОС сперматозоидов и повышена фрагментация ДНК. Целесообразны дальнейшие исследования в этом направлении, чтобы подтвердить и количественно охарактеризовать взаимосвязь фрагментации ДНК, с одной стороны, и результатов лечения иммунного бесплодия у мужчин методами ЭКО, с другой.

Заключение

Фертильность мужчин при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов снижена пропорционально доле подвижных гамет, покрытых АСАТ, и обусловлена функциональными нарушениями сперматозоидов: преждевременной гиперактивацией, нарушениями АР и повышенной фрагментацией ДНК, связанными с ОС.

Список литературы

1. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple. Cambridge: Cambridge University Press; 2000: 32.
2. Mazumdar M.D., Levine A.S. Antisperm antibodies: etiology, pathogenesis, diagnosis and treatment. Fertil. Steril. 1998; 70: 799–810.
3. Koide S.S., Wang L., Kamada M. Antisperm antibodies associated with infertility: properties and encoding genes of target antigens. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 2000; 224(3): 123–32.
4. Walsh T.J., Turek P.J. Immunologic infertility. In: Lipshuitz L.I., Howards S.S., Niederberger C.S., eds. Infertility in the male. 4th ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2009: 277–94.
5. Francavilla F., Barbonetti A. Male autoimmune infertility. In: Krause W.K.H., Naz R.K., eds. Immune infertility. The impact of immune reaction on human infertility. New York: Springer; 2009: 145–53.
6. Божедомов В.А., Лоран О.Б., Сухих Г.Т. Этиология и патогенез мужского аутоиммунного бесплодия. ч. 1–2. Андрология и генитальная хирургия. 2001; 1: 72–7; 78–87.
7. Check J.H. Antisperm antibodies and human reproduction. Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 2010; 37(3):169–74.
8. WHO laboratory manual for the examibation and processing of human semen. 5th ed. Geneva: WHO; 2010. 271 p.
9. Nikolaeva M.A., Golubeva E.L., Kulakov V.I., Sukhikh G.T. Evaluation of stimulus-induced acrosome reaction by two-colour flow cytometric analysis. Mol. Hum. Reprod. 1998; 4(3): 243–50.
10. Громенко Д.С., Фархутдинов Р.Р., Галимов Ш.Н. и др. Способ регистрации активных форм кислорода в семенной жидкости для оценки фертильности. Патент на изобретения № 2272291 от 20.03.2006.
11. Nieschlag E., Behre H.M., Nieschlag S., eds. Andrology. Male reproductive health and disfunction. 3rd ed. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag; 2010: 92; 148; 273–5.
12. Божедомов В.А., Николаева М.А., Голубева Е.Л., Бокарева Е.И., Самко А.А., Файзуллин Л.З. и др. Проблемы диагностики иммунологической причины мужского бесплодия. Проблемы репродукции. 2007; 2: 81–9.
13. Agarwal A., Said T.M. Tests for sperm antibodies. In: Krause W.K.H., Naz R.K., eds. Immune infertility. The impact of immune reaction on human infertility. New York: Springer; 2009: 155–64.
14. Li C.Y., Jiang L.Y., Chen W.Y., Li K., Sheng H.Q., Ni Y.et al. CFTR is essential for sperm fertilizing capacity and is correlated with sperm quality in humans. Hum. Reprod. 2010; 25(2): 317–27.
15. Suarez S.S. Hyperactivated motility in sperm. J. Androl. 1996; 17: 331-5.
16. Yanagimachi R. Mammalian fertilization. In: Knobil E., Neill J.D., eds. The physiology of reproduction. New York: Raven Press; 1994: 189–317.
17. Roldan E.R., Murase T., Shi Q.X. Exocytosis in spermatozoa in response to progesterone and zona pellucida. Science. 1994; 266(5190): 1578–81.
18. Божедомов В.А., Николаева М.А., Сухих Г.Т., Лоран О.Б. Влияние антиспермальных антител на мужскую репродуктивную функцию. Андрология и генитальная хирургия. 2000; 2: 25–33.
19. Feng H.L., Hang Y.B., Sparks A.E., Sandlow J.I. Characterization of human sperm antigens reacting with anti-sperm antibodies from an infertile female patients serum. J. Androl. 2008; 29(4): 440-8.
20. Zini A., Fahmy N., Belzile E., Ciampi A., Al-Hathal N., Kotb A. Antisperm antibodies are not associated with pregnancy rates after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. 2011; 26(6): 1288–95.
21. Ramya T., Misro M.M., Sinha D., Nandan D. Sperm function and seminal oxidative stress as tools to identify sperm pathologies in infertile men. Fertil. Steril. 2010; 93(1): 297–300.
22. Божедомов В.А., Громенко Д.С., Ушакова И.В., Торопцева М.В., Галимов Ш.Н., Е. Л. Голубева Е.Л. и др. Причины оксидативного стресса сперматозоидов. Проблемы репродукции. 2008; 6: 67–73.
23. Tremellen K. Oxidative stress and male infertility — a clinical perspective. Hum. Reprod. Update. 2008; 14(3): 243–58.
24. Aitken R.J., De Luliis G.N. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 2010; 16(1): 3–13.
25. Ménézo Y., Dale B., Cohen M. DNA damage and repair in human oocytes and embryos: a review. Zygote. 2010; 18(4): 357–65.
26. Zini A., Boman J., Belzile E., Ciampi A. Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. 2008; 23(12): 2663–8.
27. de Jonge C.J., Barratt C.L.R., eds. The sperm cell: production, maturation, fertilization, regeneration. Cambridge: Cambridge University Press; 2006: 182.
28. Naz R.K. Effects of antisperm antibodies on early cleavage of fertilized ova. Biol. Reprod. 1992; 46(1): 130–9.
29. Cline A.M., Kutteh W.H. Is there a role of autoimmunity in implantation failure after in-vitro fertilization? Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2009; 21(3): 291–5.
30. Короткова И.В., Николаева М.А., Божедомов В.А., Голубева Е.Л., Крутских А.Ю., Тер-Аванесов Г.В., Сухих Г.Т. Уровень генерации свободных радикалов в образцах эякулята бесплодных пациентов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001; 131(6): 658–60.
31. Божедомов В.А., Николаева М.А., Ушакова И.В., Мингболатов А.Ш., Александрова Л.М., Липатова Н.А. и др. Роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе мужского иммунного бесплодия. Андрология и генитальная хирургия. 2010; 4: 62–6.

Об авторах / Для корреспонденции

Божедомов Владимир Александрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова и кафедры клинической андрологии ФПКМР ГБОУ ВПО РУДН
Николаева Марина Аркадьевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России
Адрес: 117997, Россия. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail:MNikolaeva@oparina4.ru
Ушакова Ирина Вячеславна, кандидат биологических наук, эмбриолог отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: ir_ushakova@oparina4.ru
Спориш Евгений Александрович, врач-уролог ФГБУ Поликлиника №1 УДП РФ, соискатель каф. клинической андрологии ФПКМР ГБОУ ВПО РУДН Адрес: 119002, Россия, Москва, пер. Сивцев Вражек, 26/28. Телефон: 8 (499) 241-42-11
Рохликов Игорь Михайлович, кандидат медицинских наук, зав. окружным урологическим отделением ЦАО Москвы ГБУЗ Городская поликлиника № 68 ДЗ Москвы, соискатель каф. клинической андрологии ФПКМР ГБОУ ВПО РУДН
Адрес: 119180, Россия, Москва, ул. М. Якиманка, 22, стр. 1. Телефон: 8 (499) 238-47-79
Липатова Наталья Алексеевна, кандидат медицинских наук, врач клинической лабораторной диагностики, кафедра клинической андрологии ФПКМР ГБОУ ВПО РУДН
Адрес: 109386, Россия, Москва, ул. Ставропольская, 23. Телефон: 8 (495) 782-65-89
Сухих Геннадий Тихонович, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, заведующий каф. акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: g_sukhikh@oparina4.ru

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.