Задержка роста плода (ЗРП) является актуальной проблемой современного акушерства, занимая ведущее место среди причин перинатальной заболеваемости и смертности [1, 2].
Малые размеры при рождении могут привести к увеличению заболеваемости в перинатальном периоде и повышенному риску развития сердечно-сосудистых, неврологических и метаболических заболеваний во взрослом возрасте [3]. Воздействие различных неблагоприятных факторов в период беременности оказывает значительное влияние на эпигенетические процессы, которые играют ключевую роль в фетальном программировании. Согласно данной концепции воздействие факторов внутриутробной среды приводит к изменениям в метаболических и иммунных процессах при ЗРП [3–5].
В ранее проведенном нами исследовании [5] было представлено описание гормонов и адипокинов, участвующих в регуляции энергетического метаболизма при ЗРП и их роль в патогенезе данного осложнения беременности. Наибольший интерес представляет изучение глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), уровень которого у пациенток с ЗРП оставался высоким относительно группы сравнения на протяжении беременности и увеличивался ближе к доношенному сроку.
GLP-1 представляет собой инкретин, секретируемый после приема пищи из L-клеток тонкого кишечника и регулирующий гомеостаз глюкозы [6]. Согласно данным литературы, рецептор GLP-1 (GLP-1R) экспрессируется на многих типах клеток, включая макрофаги [7]. Однако до сих пор проведено мало исследований, в которых изучалось значение передачи сигналов GLP-1/GLP-1R и их активации.
Shiraishi D. et al. обнаружили, что GLP-1 индуцирует активацию преобразователя сигнала и активатора транскрипции 3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3). Как известно, STAT3 в макрофагах участвует в регуляции иммунных реакций [8]. Активация STAT3 необходима для дифференцировки макрофагов из фенотипа М1, продуцирующих преимущественно провоспалительные цитокины, в направлении фенотипа М2, вырабатывающих противовоспалительные факторы [9].
При изучении влияния GLP-1 на лимфоциты крови было обнаружено, что GLP-1 способен блокировать SDF-1-индуцированную миграцию CD4+ лимфоцитов [10].
Исходя из вышесказанного, GLP-1 способен влиять на фенотип лейкоцитов, связываясь со своими мембранными рецепторами, что приводит к появлению характерного фенотипа лейкоцитов (макрофагов и лимфоцитов), а именно противовоспалительного. Учитывая роль GLP-1 в развитии ЗРП, нами было решено изучить его влияние на про- и противовоспалительные факторы мононуклеарных клеток крови беременных женщин с ЗРП.
Цель исследования: изучить влияние GLP-1 на фенотипический профиль мононуклеарных клеток периферической крови женщин с ЗРП и определить потенциальные диагностические маркеры.
Материалы и методы
На базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (далее – Центр) проведено исследование, в которое были включены 56 беременных [5].
В основную группу (группа I) вошли 32 пациентки с установленным постнатально диагнозом ЗРП. Группу сравнения (группа II) составили 24 пациентки, у которых задержки роста не наблюдалось.
На антенатальном этапе диагноз ЗРП устанавливался согласно клиническим рекомендациям «Недостаточный рост плода, требующий предоставления медицинской помощи матери (задержка роста плода)» [2] и критериям единого консенсусного документа Дельфийской системы. После родоразрешения проводилась оценка массо-ростовых показателей новорожденного при помощи перцентильных шкал INTERGROWTH-21 [5]. При массо-ростовых показателях ниже 10-го процентиля устанавливался диагноз малого или маловесного к сроку гестации [11].
Исследование было одобрено на заседании локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Отбор пациенток и забор крови проводился по обращаемости в профильные отделения Центра по методу подбора пар согласно критериям включения и исключения, после подписания ими информированного добровольного согласия на участие в исследовании.
Критерии включения: возраст от 18 до 45 лет, одноплодная беременность на сроке 22–40 недель, осложнившаяся ЗРП (для основной группы), отсутствие ЗРП (для группы сравнения), подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании [12].
Критерии исключения: многоплодная беременность, преэклампсия во время беременности, использование донорских программ вспомогательных репродуктивных технологий, тяжелая экстрагенитальная патология, антифосфолипидный синдром, обострение инфекционных заболеваний, пороки развития и гемолитическая болезнь плода [12].
Забор венозной крови беременных проводился в пробирку с натрий-гепарином с последующей доставкой образца венозной крови в лабораторию в течение 30 минут. Исследование было проведено в два этапа.
На первом этапе для определения биологического эффекта GLP-1 было изучено влияние агониста рецептора GLP-1 (лираглутида) на фенотипический профиль мононуклеарных клеток, полученных от 6 пациенток с нормально протекающей беременностью и 6 пациенток с ЗРП. Для этого проводилось выделение PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови) с использованием фиколла, с последующим культивированием PBMC в среде rpmi 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой в течение 24 ч. После культивирования в 500 мкл среды добавлялось 5 нг лираглутида.
Кровь анализировалась при помощи проточного цитофлоуриметра «BD FACSCalibur» (USA). Для этого к мононуклеарным клеткам были добавлены антитела с флуоресцентными метками, и с помощью проточной цитофлуориметрии определено процентное содержание клеток, а также уровень экспрессии соответствующих маркеров. Относительное содержание поверхностных маркеров CD4, CD8, СD86 и CD163 определялось по оценке относительного уровня флуоресценции. Относительное содержание (%) моноцитов и лимфоцитов вычислялось как количество каждой популяции клеток к общему количеству моноцитов и лимфоцитов.
Для оценки диагностической значимости полученных маркеров на втором этапе исследования проводилось изучение их содержания и экспрессии в периферической крови беременных при ЗРП (n=32) и у женщин с физиологически протекающей беременностью (n=24) по вышеописанной методике.
Статистический анализ
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием R (версия 4.0.2, Вена, Австрия), OriginPro 8.5 (США) и Microsoft Excel. Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовался критерий Шапиро–Уилка (при числе наблюдений менее 50). Для сравнения двух групп по количественным показателям с распределением, отличным от нормального, применяли U-критерий Манна–Уитни. Описание данных представлено в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1; Q3). Сравнение качественных параметров проводилось с использованием точного критерия Фишера. Качественные характеристики представлены в виде: абсолютных значений и процентных долей (количество образцов/общее количество образцов, %) [5]. Для анализа связанных выборок использовался критерий знаковых рангов Вилкоксона. Оценка диагностической ценности полученных маркеров проводилась с помощью ROC-анализа, а также расчета чувствительности и специфичности при пороговом значении [12]. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Пациентки, включенные в исследование, были сопоставимы по исходной клинико-анамнестической характеристике (табл. 1).
Оценка массо-ростовых показателей включенных в исследование пациенток, а также анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза не выявили статистически значимых различий (р>0,05). В то время как анализ массо-ростовых показателей новорожденных показал: масса тела новорожденных с задержкой роста составила 1940 (1518; 2287) г., у детей, соответствующих гестационному возрасту – 3160 (2960; 3527) г. Согласно перцентильным шкалам INTERGROWTH-21, процентиль массы тела после рождения составил 2,0 (0,9; 3,0) и 69,5 (47,2; 84,5) по группам соответственно, р<0,001. Оценка состояния по шкале Апгар новорожденных детей составила от 5 до 9 баллов [5].
При изучении влияния синтетического аналога GLP-1 (лираглутида) на лимфоциты и моноциты крови здоровых беременных женщин (n=6) и женщин с беременностью, осложненной ЗРП (n=6), в эксперименте in vitro было обнаружено, что лираглутид оказывает разнонаправленное действие на относительное содержание CD4+ и CD8+ лимфоцитов, CD163+ и CD86+ моноцитов и уровень их экспрессии в крови беременных женщин (рис. 1, табл. 2) [13, 14].
В результате эксперимента было установлено, что активация GLP-1 рецепторов на поверхности PBMC может изменять фенотип моноцитов и лимфоцитов периферической крови [13, 15], что согласуется с данными литературы [8]. Так, в ранее проведенном нами исследовании было изучено содержание факторов энергетического метаболизма в плазме крови беременных при ЗРП [5]. Установлено, что содержание GLP-1 статистически значимо повышено в крови женщин с беременностью, осложненной ЗРП (p=0,003).
Согласно данным литературы, GLP-1 обладает противовоспалительной активностью [15–17]. В исследовании Shiraishi D. et al. было показано, что активация GLP-1R in vitro может ингибировать воспалительные реакции и модулировать иммунный ответ [8, 18]. Синтетические аналоги GLP-1 (лираглутид, эксендин и эксенатид) также способны подавлять секрецию макрофагами различных воспалительных цитокинов in vitro [8, 14]. Авторами было показано, что эксенатид изменяет фенотип макрофагов в сторону противовоспалительного фенотипа путем значительного повышения уровня противовоспалительного цитокина интерлейкина (IL)-10, и снижения, как фактора некроза опухоли (TNF)-α, так и IL-1β в культивируемых моноцитах/макрофагах человека [8]. Также сообщалось, что агонисты рецептора GLP-1 уменьшают накопление моноцитов/макрофагов в стенке артерии за счет ингибирования воспалительной реакции макрофагов. Кроме того, макрофагами, полученными из моноцитов человека, культивируемых с GLP-1, повышалась поверхностная экспрессия CD163 и CD204, увеличивалась секреция IL-10, и активировался путь STAT3, в то время как STAT1 ингибировался [8]. На основании описанных данных было высказано предположение, что GLP-1 участвует в активации и поляризации макрофагов в направлении противовоспалительного фенотипа М2, что предоставляет первые доказательства того, что передача сигналов GLP-1/GLP-1R коррелирует с активацией STAT3 и поляризацией макрофагов.
Так как содержание GLP-1 в периферической крови при ЗРП повышено, то можно ожидать, что фенотип PBMC у женщин с ЗРП будет отличаться от фенотипа женщин с нормально протекающей беременностью. Чтобы проверить данное предположение было решено изучить относительное содержание (рис. 2А) CD4+ и CD8+ лимфоцитов, CD86+ и CD163+ моноцитов в крови женщин с ЗРП (n=32) и у женщин с нормально протекающей беременностью (n=24) и уровень их экспрессии (рис. 2B).
Было отмечено более высокое статистически значимое относительное содержание CD4+ моноцитов (р=0,02) и низкое относительное содержание CD8+ лимфоцитов (р=0,006) в периферической крови женщин при ЗРП (67,25 (62,77; 68,63)% и 27,60 (24,65; 31,93)% соответственно); в то время как их уровень у женщин с нормально протекающей беременностью соответствовал 57,85 (56,00; 67,00)% и 37,05 (32,00; 38,00)% соответственно. Однако уровень экспрессии CD4 и CD8 лимфоцитами в исследуемых группах не показал статистически значимых различий. Так, экспрессия CD4 в основной группе составила 1340,50 (1246,25; 1493,50) отн.ед., а в группе сравнения – 1299,00 (969,00; 1596,00) отн.ед. (р=0,82). Экспрессия CD8 у женщин с ЗРП составила 1956,0 (1872,0; 2086,4) отн.ед. и 2086,0 (1945,0; 2308,0) отн.ед. при физиологически протекающей беременности (р=0,07).
Уровень экспрессии CD86 моноцитами был статистически значимо снижен в основной группе и составил 35,9 (26,4; 151,0) отн.ед., а в группе сравнения – 153,95 (147,00; 168,00) отн.ед. (p=0,02). Однако при изучении относительного содержания CD86+ моноцитов статистически значимых различий между исследуемыми группами получено не было (р=1,00). Так, в основной группе относительное содержание CD86+ составило 60,0 (18,8; 68,0)%, в группе сравнения – 51,1 (44,0; 73,3)%.
При изучении относительного содержания CD163+ моноцитов и уровня экспрессии были получены статистически значимые различия между исследуемыми группами. Уровень экспрессии CD163 в основной группе был статистически значимо повышен и составил 124,0 (25,2; 148,0) отн.ед. и 25,2 (24,8; 29,0) отн.ед. в группе сравнения (р=0,02). Похожая тенденция наблюдалась при изучении относительного содержания CD163+ моноцитов в крови беременных женщин. Относительное содержание CD163+ в основной группе составило 66,0 (47,1; 74,0)% и 37,8 (36,8; 45,8)% – в группе сравнения (р=0,001).
Так как наибольшая статистически значимая разница между исследуемыми группами была обнаружена в относительном содержании CD163+ моноцитов периферической крови, данный фактор был рассмотрен как потенциальный маркер ЗРП. Для оценки диагностической значимости относительного содержания CD163+ моноцитов периферической крови был проведен ROC-анализ (рис. 3).
Установлено, что площадь под ROC-кривой относительного содержания CD163+ моноцитов составила 0,83 (95% ДИ 0,68–0,99) с пороговым значением 40,7%, для которого чувствительность составила 100% и специфичность –77%. Прогностическая ценность положительного результата составила 78,3% (95% ДИ 61,4–95,1), отрицательного результата – 100,0% (95% ДИ 100–100). Согласно экспертной шкале, определение относительного содержания CD163+ моноцитов в периферической крови женщин с ЗРП обладает «очень хорошей» диагностической ценностью, что позволяет рассматривать относительное содержание CD163+ моноцитов в качестве потенциального маркера в диагностике ЗРП на антенатальном этапе.
Таким образом, полученные результаты подтверждают описанный выше эксперимент in vitro c лираглутидом и согласуются с данными литературы. Повышенное содержание GLP-1 в периферической крови беременных женщин с ЗРП, по-видимому, меняет фенотип моноцитов и лимфоцитов крови за счет активации GLP-1 рецепторов на их поверхности, оказывая, тем самым, противовоспалительный эффект за счет повышенного относительного содержания CD4+ лимфоцитов и CD163+ моноцитов и пониженного относительного содержания CD8+ лимфоцитов в периферической крови беременных. Это может указывать на возможность их участия в одном сигнальном пути, сигнальной молекулой которого является GLP-1, запускающий специфический клеточный ответ в виде активации выраженного противовоспалительного эффекта за счет STAT3 [19]. Активация STAT3 при воздействии GLP-1 на иммунные клетки, описанная различными авторами, может непосредственно приводить к активации WNT-сигнального пути, которые, как известно, обладают перекрестными связями [20].
Изучение сигнальных путей, в которые вовлечены гормоны, инкретины и адипокины, является перспективным направлением и может указать на потенциальные мишени для диагностики и терапии ЗРП, однако это требует дальнейшего изучения.
Заключение
Определение факторов, участвующих в регуляции энергетического метаболизма, и их влияние на фенотипический профиль мононуклеарных клеток периферической крови при задержке роста плода способствует пониманию патогенетических механизмов развития данного осложнения беременности.
Изучение фенотипического профиля мононуклеарных клеток периферической крови у женщин с ЗРП выявило изменение относительного содержания CD4+ и CD8+ лимфоцитов, CD86+ и CD163+ моноцитов и уровня их экспрессии в периферической крови беременных, что указывает на возможность их участия в одном сигнальном пути. При этом относительное содержание CD163+ моноцитов может стать потенциальным маркером в диагностике ЗРП (AUC=0,83).
Представленные результаты показали, что сигнальной молекулой в данном сигнальном пути является GLP-1, который при ЗРП запускает специфический клеточный ответ в виде активации выраженного противовоспалительного эффекта, проявляющегося повышенным относительным содержанием CD4+ лимфоцитов и CD163+ моноцитов и пониженным относительным содержанием CD8+ лимфоцитов в крови женщин с беременностью, осложненной ЗРП.
Изучение данного сигнального пути поможет понять новые механизмы развития данного осложнения беременности и установить потенциальные маркеры, которые позволят верифицировать ЗРП на антенатальном этапе.
