В настоящее время одним из наиболее распространенных методов лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). Несмотря на усовершенствование эмбрионального этапа программы ЭКО, позволяющего выбрать для переноса в полость матки эмбрионы высокого качества, результативность ЭКО остается достаточно низкой [1, 2]. Одной из важных задач вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является повышение вероятности наступления беременности при селективном переносе одного эмбриона [3]. По данным J. Gunbi и соавт. [4], только треть циклов ВРТ приводит к развитию беременности и около четверти из них – к рождению ребенка. Наступление беременности во многом зависит от трех составляющих: рецептивности эндометрия, функционально полноценного эмбриона, способного к имплантации, и доставки эмбриона к зоне имплантации [5, 6].
В последние годы отмечается значительный интерес к поиску новых стратегий, позволяющих уменьшить число неудач и повысить эффективность программ ЭКО [7]. В настоящее время оценка эмбрионов в основном основывается на морфологических критериях, однако точность такого метода отбора эмбрионов остается недостаточно высокой, хотя его использование и привело к значительному повышению результативности программ ЭКО [8].
В последние годы отмечается рост альтернативных неинвазивных подходов к разработке новых методов анализа качества ооцитов, эмбрионов и имплантации эмбриона. В качестве материала в таких методиках могут выступать сыворотка крови, фолликулярная жидкость, эндометрий, клетки цервикального канала, трофэктодерма бластоцисты и др. Среди широкого спектра биохимических маркеров, определяемых в этих материалах, в последнее время особое внимание исследователей привлекает белок периостин (POSTN) [9].
Периостин (POSTN), также известный как остеобласт-специфический фактор 2, относится к семейству белков внеклеточного матрикса и выступает в качестве лиганда интегринов (молекулы межклеточной адгезии), участвует в адгезии и миграции клеток [9]. Периостин является витамин К-зависимым белком. Витамин К обеспечивает карбоксилирование остатков глютаминовой кислоты, входящих в состав некоторых белков. В результате они превращаются в остатки гамма-карбоксилглютаминовой кислоты (Gla-радикалы) и приобретают способность связывать кальций. Белки, для активации которых требуется такое карбоксилирование, называются «витамин К-зависимыми» [10].
Экспрессия мРНК периостина в сыворотке крови, фолликулярной жидкости значимо коррелирует с качеством бластоцисты. Согласно данным авторов, по уровню периостина и морфологическим критериям можно прогнозировать наступление беременности более точно, чем учитывая только морфологические критерии [11]. Таким образом, периостин может быть использован в качестве дополнительного маркера для улучшения прогнозирования результатов ЭКО.
Взаимодействие эмбриона и эндометрия представляет собой важный фактор для успешной имплантации и достижения беременности [12]. Несколько внеклеточных матриксных белков, такие как ламинин, фибронектин и остеопонтин, были определены как ключевые регуляторы этого взаимодействия. Недавние экспериментальные данные продемонстрировали, что секретируемый белок периостин, принадлежащий к семейству внеклеточных матриксных белков, может играть центральную роль в регулировании взаимосвязи эмбриона с эндометрием. Особенно важно, что экспрессия периостина способна прогнозировать качество ооцитов, эмбрионов, частоту имплантации и исход беременности в естественных циклах [13].
По данным литературы известно, что механизм колонизации раковых клеток идентичен с механизмом имплантации [14]. В связи с решающей ролью периостина в метастатических процессах, можно предположить, что этот белок может оказывать влияние на некоторые важные этапы процесса имплантации. В эндометрии человека присутствие белка периостина, как в стромальных так и в эпителиальных клетках, находится под влиянием менструального цикла и беременности. Периостин может активировать дифференцировку эндометрия для имплантации. Экспериментальные данные на животных продемонстрировали, что периостин может запустить децидуализацию эндометрия, прикрепление и/или миграцию трофобластических клеток [6].
Цель исследования: оценить роль витамин К-зависимого белка периостина как маркера качества ооцитов, в последующем бластоцисты и эффективность лечения в программах ЭКО/ИКСИ.
Материал и методы исследования
В исследование были включены супружеские пары, обратившиеся в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Обследованы 100 пациенток в соответствии с критериями включения (трубный фактор бесплодия, мужской фактор бесплодия с невыраженной патозооспермией, возраст пациентки не более 37 лет, регулярный менструальный цикл, отсутствие системных аутоиммунных заболеваний). Критериями исключения были: противопоказания для проведения ЭКО, в том числе экстрагенитальная патология, наружный и внутренний эндометриоз III и IV стадии, миома матки больших размеров, патозооспермия III–IV степени, злокачественные новообразования любой локализации, пороки развития внутренних половых органов.
В соответствии с результатами лечения бесплодия были сформированы две основные группы: I группа – пациентки с успешным исходом лечения (n=28); II группа – пациентки с отрицательным результатом лечения (n=72).
Всем пациенткам стимуляция функции яичников проводилась в стандартном протоколе с антагонистом гонадотропин-рилизинг гормона препаратами рекомбинантного ФСГ и/или человеческого менопаузального гонадотропина. В качестве триггера овуляции был использован человеческий хорионический гонадотропин в дозе 10 000 МЕ. Пункция яичников производилась через 36 часов после введения триггера овуляции. Поддержка лютеиновой фазы цикла у всех пациенток была проведена препаратами прогестерона, начиная со дня пункции фолликулов.
Фолликулярная жидкость отбиралась из первого фолликула из каждого яичника, с промывкой иглы после каждого фолликула, в индивидуальные маркированные пробирки без гепарина. Каждая порция фолликулярной жидкости была центрифугирована в течение 20 минут. В исследование были включены те образцы фолликулярной жидкости, в которых был найден ооцит (n=87). Поскольку уровень периостина в фолликулярной жидкости, полученной из разных яичников у одной пациентки, был сопоставим, анализировали средний уровень периостина в фолликулярной жидкости. Оплодотворение ооцитов проводилось методом ЭКО или ИКСИ. Культивирование эмбрионов было произведено в отдельных каплях. Морфологическая оценка эмбрионов проводилась на 5-е сутки.
Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала был взят на 5-е сутки после трансвагинальной пункции яичников, непосредственно перед проведением переноса эмбрионов в полость матки. Клетки помещали в пробирки со средой для стабилизации РНК («Стор-экс», ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Морфологическая оценка качества эмбрионов была произведена согласно классификации, принятой Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE, 2011) («модифицированная» классификация D. Gardner). Всем пациенткам переносили эмбрионы только хорошего качества. Количество переносимых эмбрионов не превышало двух.
Концентрацию периостина (POSTN) в фолликулярной жидкости оценивали иммуноферментным методом на иммунохемилюминесцентном анализаторе c использованием набора Human periostin/OSF-2 elisakitв клинико-диагностической лаборатории ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова МЗ РФ.
Оценка экспрессии мРНК периостина в соскобах эпителиальных клеток из цервикального канала была проведена методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Реакция амплификации проводилась с помощью детектирующего амплификата ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия).
Нормировка уровня экпрессии генов выполнена с использованием метода сравнения индикаторных циклов (метод Δ∆Cp) по четырем референсным генам TGFB1, VEGFA, TAGLN, IL1B.
Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова МЗ РФ. Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics 21.0, для оценки значимости межгрупповых различий применяли тест Стьюдента для 2 независимых выборок, также с использованием программного обеспечения Statistica 10.0. Соответствие анализируемых параметров закону нормального распределения оценивали по значениям тестов Колмогорова–Смирнова, Лиллиефорса и W-критерия Шапиро–Уилка. Так как в большинстве случаев распределение не соответствовало закону нормального распределения, а также анализируются количественный и качественный признаки, для выявления взаимосвязи признаков вычисляли коэффициент корреляции Спирмена. Величину уровня значимости p принимали равной 0,05, что соответствует критериям, принятым в медико-биологических исследованиях. Если значение p было меньше 0,001, то p указывали в формате p<0,001.
Результаты исследования
При оценке клинико-анамнестических данных, параметров фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп статистически значимых отличий не было выявлено, группы были однородны и сопоставимы по анализируемым параметрам (таблица).
В результате исследования было выявлено, что средний уровень периостина в фолликулярной жидкости не имеет статистически достоверных различий с наступлением беременности у женщин, проходящих лечение бесплодия в программе ЭКО/ИКСИ со стимуляцией суперовуляции. Но стоит отметить, что средний уровень периостина в фолликулярной жидкости значительно ниже при неудачном исходе ЭКО/ИКСИ. В ходе исследования, выявлена статистически значимая связь между средним уровнем периостина в фолликулярной жидкости с долей незрелых ооцитов (R2=0,35; p=0,01) – обратная умеренная. Также можно отметить корреляцию между средним уровень периостина и количеством бластоцист тип А (R2=0,27; p=0,06).
В результате исследования были получены данные, которые показали корреляцию доли незрелых ооцитов со средним уровнем периостина в фолликулярной жидкости (рис. 1). У 66 женщин после трансвагинальной пункции яичников, среди общего количества ооцитов были получены и незрелые ооциты (66%). Среди данной группы у 22 женщин наступила клиническая беременность, что составляет 33,3%, тогда как среди 34 женщин, у которых все полученные ооциты были зрелые (34 пациентки, 34%), частота наступления беременности составила 21,4% (беременность наступила у 6 женщин).
В исследовании также оценили экспрессию мРНК белка периостина в соскобах эпителиальных клеток из цервикального канала в предполагаемое «окно имплантации» для анализа исходов программы ЭКО/ИКСИ. У пациенток, имеющих среди общего числа ооцитов незрелые ооциты, наблюдались статистически значимые различия в уровне экспрессии мРНК в зависимости от исхода программы (рис. 2). Также была выявлена погранично значимая положительная корреляция между экспрессией мРНК периостина эпителиальных клеток цервикального канала и количеством бластоцист типа А (R2=0,27; p=0,06).
Обсуждение
В литературе в основном оценивали возможную роль витамин К-зависимого белка периостина как маркера наступления беременности. Было отмечено, что уровень периостина в фолликулярной жидкости у пациенток с удачным исходом программы ВРТ был значительно выше, что согласуется с нашими данными. В нашем исследовании продемонстрирована связь между уровнем белка и мРНК периостина с качеством ооцитов, что может объяснять молекулярный механизм предиктивной способности данного маркера. Это согласуется с результатами Morelli и соавт. [6], которые связывали высокий уровень периостина с качеством эмбриона. Примечательно, что предиктивные свойства уровня периостина наблюдались именно в группе пациенток, у которых среди общего числа полученных ооцитов имелись и незрелые ооциты. При этом таких женщин при проведении программы большинство.
В данном исследовании впервые была проанализирована экспрессия мРНК периостина эпителиальных клеток цервикального канала, используя метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Данные исследования показали положительную корреляцию между экспрессией мРНК периостина эпителиальными клетками цервикального канала и количеством бластоцист класса А. Также было отмечено увеличение экспрессии мРНК периостина эпителиальными клетками цервикального канала у пациенток, имеющих незрелые ооциты, что согласуется с увеличением уровня периостина в фолликулярной жидкости. Полученные данные могут быть использованы для разработки неинвазивного теста для прогнозирования исхода программ ВРТ у пациенток в группе с незрелыми ооцитами.
Заключение
Для пациенток, у которых в программе ЭКО/ИКСИ среди полученных ооцитов имелись незрелые ооциты, высокий уровень периостина в фолликулярной жидкости является прогностическим критерием успеха программы, что может отражать связь между уровнем периостина и степенью зрелости ооцитов. Исходя из этого, витамин К-зависимый белок периостин (POSTN) может быть использован, как предиктор эффективности программ ВРТ.
