В настоящее время не возникает сомнений в непосредственном участии окислительного стресса в развитии многих акушерских осложнений [1]. Активные формы кислорода постоянно образуются внутри клеток и являются необходимым компонентом редокс-гомеостатической системы, играющей ключевую роль в поддержании постоянства внутриклеточной среды и обеспечивающей протекание химических реакций, необходимых для нормального функционирования клеток [1, 2]. В физиологических условиях антиоксидантная система организма ограничивает образование свободных радикалов. Однако при их избыточном накоплении или при уменьшении способности клеток к их нейтрализации супероксид-анионы превращаются в высоко реактивные радикалы кислорода, и создаются условия для возникновения окислительного стресса – ключевого звена многих типовых патологических процессов, приводящих к развитию заболеваний, а также акушерских осложнений [1]. Важным процессом, определяющим течение беременности, является цитотрофобластическая инвазия, представляющая собой процесс миграции клеток трофобласта в эндометрий и миометрий. При нарушении этого механизма происходит неполное ремоделирование спиральных артерий с дальнейшим развитием гипоксии, плацентарной недостаточности и преэклампсии [3]. Преэклампсия в настоящее время определяется как мультисистемное патологическое состояние, возникающее во второй половине беременности (после 20-й недели), характеризующееся артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией (0,3 г/л в суточной моче), нередко отеками и проявлениями полиорганной недостаточности. Несмотря на достижения современной медицины, данное осложнение беременности по-прежнему остается одной из ведущих причин материнской и перинатальной смертности [4–6]. В основе первого этапа патогенеза преэклампсии лежит недостаточность инвазии трофобласта и отсутствие диэластоза мышечного слоя спиральных артерий миометрия, что приводит к сужению их просвета и последующему развитию плацентарной ишемии. На субклеточном уровне гипоксия активирует экспрессию основных источников супероксидного аниона (O2-)-ксантиноксидазы и NADРH-оксидазы, запуская механизм развития окислительного стресса. На втором этапе присоединяется реакция материнского организма, которая характеризуется нарушением функционирования эндотелия и, как следствие, мультисистемным воспалительным ответом. В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов формирования окислительного стресса и поиску ранних прогностических критериев развития преэклампсии. Изучено изменение уровня экспрессии генов антиоксидантной защиты (глутатионпероксидазы – GPX1 и глутатионредуктазы – GSR) в плаценте при развитии данного осложнения беременности [7].
Ферменты семейства параоксоназ (PON1, PON2 и PON3) нейтрализуют свободные радикалы кислорода, защищают липиды клеточных мембран от перекисного окисления, обладают противовоспалительными свойствами, а также регулируют процессы апоптоза. Гены PON1 и PON3 обнаружены практически во всех клетках организма, однако ферменты синтезируются преимущественно в гепатоцитах, а затем в плазме крови связываются с липопротеидами высокой плотности с помощью N-концевого гидрофобного сигнального пептида. Фермент PON2 находится исключительно внутри клеток и не обнаруживается в плазме. По химическим свойствам параоксоназы относятся к классу гидролаз [8]. Они способны гидролизовать окисленные фосфолипиды клеточных мембран, эфиры эстрогена, фосфоорганические соединения, ненасыщенные алифатические сложные эфиры, ароматические сложные эфиры карбоновых кислот, а также ацилгомосеринлактоны – сигнальные молекулы кворум-зависимых систем грамотрицательных бактерий. Таким образом, они могут играть потенциальную защитную роль в развитии акушерских осложнений. В настоящее время недостаточно изучен уровень экспрессии параоксоназ в плацентах при различных патологических состояниях. Наше исследование посвящено изучению уровня экспрессии генов PON1, PON2, PON3 в плацентах женщин с физиологически протекающей беременностью и при развитии преэклампсии.
Цель исследования: сравнить уровень экспрессии генов PON1, PON2 и PON3 в плацентах у женщин с нормальным течением беременности и при развитии преэклампсии.
Материал и методы исследования
Проведено ретроспективное исследование с участием 26 беременных женщин в сроке беременности 34–40 недель: I (основная группа) – пациентки, беременность которых осложнилась преэклампсией (n=12), II (группа сравнения) – пациентки с нормальным течением беременности (n=14). Средний возраст беременных женщин составил 28±4 года. Все пациентки, включенные в исследование, были сопоставимы по паритету беременности, соматическому и гинекологическому статусу.
Критерии включения в исследование: репродуктивный возраст, родоразрешение путем операции кесарева сечения, отсутствие выраженной нейроэндокринной соматической патологии, наличие одноплодной беременности, наступившей самостоятельно.
Критерии исключения: острые воспалительные процессы, наличие онкологических заболеваний в анамнезе.
У 8 пациенток из I группы беременность осложнилась умеренной преэклампсией, у 4 пациенток – тяжелой преэклампсией. Диагноз «Умеренная преэклампсия» был установлен на основании следующих критериев: артериальная гипертензия: систолическое АД 140–159 мм рт. ст. или диастолическое АД 90–109 мм рт. ст., возникшие при сроке беременности >20 недель у женщин с нормальным АД в анамнезе; протеинурии ≥0,3 г/л белка в суточной пробе мочи. Диагноз «Тяжелая преэклампсия» ставился при наличии диастолического АД ≥110 мм рт.ст., систолического АД ≥160 мм рт.ст.; уровня суточной протеинурии >5 г/л, а также симптомов полиорганной недостаточности. Показанием для их родоразрешения путем операции кесарева сечения в экстренном порядке была острая гипоксия плода. У пациенток II группы показанием для родоразрешения путем операции кесарева сечения в плановом порядке являлось наличие крупного плода в сочетании с тазовым предлежанием. Кесарево сечение во всех случаях проведено типичным образом, послеоперационный период протекал без осложнений. По шкале Апгар среднее значение для I группы – 7/8 баллов, для II группы – 8/9 баллов. Все пациентки, включенные в исследование, выписаны в удовлетворительном состоянии на 4-е сутки после операции.
Выделение и анализ м-РНК
В качестве материала для молекулярно-генетического исследования использовали центральные части плацент размером 1х1 см. Все плаценты были получены в ходе операции кесарева сечения, так как при родах per vias naturalis экспрессия параоксоназ может снижаться. При заборе в образцы добавляли 1 мл раствора тризола с целью ингибирования работы РНКаз, затем гомогенизировали и подвергали быстрой заморозке при температуре -80С. Из образцов выделяли тотальную мРНК по протоколу Matz, 2002 г., синтезировали первую цепь кДНК по протоколу фирмы «Евроген» для последующей амплификации. Уровень экспрессии PON1, PON2 и PON3 определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с помощью амплификатора LightCycler 96 Real-Time PCR System (Roche) с использованием праймеров, специфичных для PON1, PON2 и PON3 (таблица).
Нормирование образцов кДНК проводили по контрольному гену АСТВ, кодирующему актин. Затем проводили анализ экспрессии генов PON1, PON2 и PON3 в образцах.
Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка полученных данных проведена при помощи программы IBM SPSS Statistics 20. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое и ошибку среднего. Значимость различий между выборками оценивали при помощи непараметрического статистического U-критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при пороговом уровне достоверности p<0,05. Все результаты представлены в виде M±SEM, где М – среднее значение, SEM – стандартная ошибка среднего.
Результаты исследования и обсуждение
По результатам нашего исследования в образцах плацент обеих групп экспрессия PON1 не выявлена. Предположительно, это связано с тем, что экспрессия гена PON1 и синтез фермента PON1 в основном происходит в гепатоцитах. В ходе исследования обнаружено значимое снижение уровня экспрессии PON2 в плацентах женщин, беременность которых осложнялась преэклампсией (рис. 1), относительно контрольной группы (p<0,05, непараметрический критерий Манна–Уитни). Образцы плацент, полученные от женщин с тяжелой и умеренной преэклампсией, были объединены в одну группу в связи с крайне редкой встречаемостью тяжелой преэклампсии и малым количеством образцов плацент с данной патологией. Однако внутри I группы наименьший уровень экспрессии гена PON2 выявлен в плацентах пациенток с тяжелой преэклампсией (норма 40,53±17,45, преэклампсия 4,82±3,29, преэклампсия тяжелая 1,02±0,25), что требует дальнейшего изучения. Таким образом, уровень экспрессии гена PON2 является показателем, указывающим на наличие окислительного стресса и отражающим степень тяжести преэклампсии, следовательно, может быть рассмотрен в качестве кандидата на роль молекулярно-генетического маркера при данном патологическом процессе. Нашу гипотезу подтверждают результаты зарубежных исследований, продемонстрировавших значительное снижение количества и активности ферментов PON2 и PON3 в плацентах женщин с преэклампсией по сравнению со здоровыми пациентками [9].
При сравнении уровня экспрессии гена PON3 в тех же образцах статистически значимых отличий не было выявлено (p>0,05, непараметрический критерий Манна–Уитни). Однако отмечается некая тенденция к снижению экспрессии гена PON3 в плацентах пациенток, беременность которых осложнилась преэклампсией (рис. 2).
Заключение
По результатам проведенного молекулярно-генетического исследования выявлено достоверное снижение уровня плацентарной экспрессии гена PON2 у пациенток с преэклампсией, при этом у женщин с тяжелой преэклампсией данный показатель оказался ниже, чем у женщин с умеренной преэклампсией. Полученные данные свидетельствуют о том, что низкий уровень экспрессии гена PON2 является возможным предиктором развития преэклампсии и может использоваться в целях прогнозирования исходов беременности. В ходе исследования показано, что уровень экспрессии PON3 значимо не отличается при физиологически протекающей беременности и при развитии преэклампсии. В обеих группах не было выявлено плацентарной экспрессии гена PON1, однако по данным зарубежных исследований доказано снижение сывороточной активности данного фермента у беременных женщин с преэклампсией по сравнению со здоровыми пациентками [10]. Таким образом, требуется проведение дальнейших научных исследований в данном направлении для улучшения ранней диагностики преэклампсии, а также прогнозирования течения и исходов беременности.
