Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29.09.2011.
В настоящее время специалистами, занимающимися пренатальной диагностикой, определена задача
в предельно ранние сроки беременности диагностировать и прогнозировать не только патологию плода, но и гестационные осложнения. Инвазивные методы пренатальной диагностики, обладающие высокой информативностью, повышают риск прерывания беременности, особенно у женщин с осложненным течением гестационного процесса. Особое значение данная проблема приобретает у пациенток с угрожающим и привычным выкидышами, когда возможности инвазивной диагностики на ранних сроках крайне ограничены.
Несмотря на то, что этиология привычного выкидыша чрезвычайно разнообразна, глобально можно выделить два ключевых момента реализации причинных факторов невынашивания беременности: состояние эндометрия и формирующегося эмбриона.
Открытие свободной (внеклеточной) сэ-ДНК, циркулирующей в плазме крови матери, открыло новые возможности неинвазивной пренатальной диагностики плода [6]. Известно, что внеклеточная эмбриональная ДНК может быть обнаружена уже на 4-й нед беременности и ее количество практически линейно нарастает до родов [4]. В отличие от эмбриональных клеток сэ-ДНК быстро исчезает из материнской плазмы, период ее полужизни составляет 16 мин и не определяется уже через 2 ч после родоразрешения.
В последние годы в литературе появляются работы, посвященные прогнозированию осложнений II
и III триместров беременности по уровням сэ-ДНК, определяемой на ранних сроках. Считается, что
сэ-ДНК имеет плацентарное происхождение и поступает в кровь беременной вследствие плацентарного апоптоза [5]. В связи с этим логично предположить, что различные нарушения состояния плаценты будут сопровождаться повышенным выбросом сэ-ДНК в кровоток матери. В ряде работ было показано повышение концентрации сэ-ДНК в крови у беременных с такими осложнениями беременности, как задержка роста плода, плацентарная недостаточность, преэклампсия [2]. Аналогичные работы при привычном выкидыше практически отсутствуют. Высвобождение сэ-ДНК в плазму крови беременной до концентраций, значительно превышающих таковую при физиологической беременности задолго до появления клинических симптомов, может служить предиктором гестационных осложнений, вплоть до самопроизвольного прерывания беременности.
В большинстве случаев патогенетической основой самопроизвольного прерывания беременности является неполноценная имплантация и плацентация. В работах отечественных и зарубежных авторов показано, что с первых дней беременности происходит ограничение роста и инвазии трофобласта, сопровождающееся явлениями угрожающего выкидыша. В этой связи логично было бы предположить, что апоптоз клеток трофобласта приводит к резкому возрастанию сэ-ДНК в кровотоке женщины, в связи с чем становится возможным прогнозирование прерывания беременности.
Целью настоящего исследования явилось выявление связи между уровнями свободной эмбриональной ДНК в плазме крови в I триместре беременнос ти и самопроизвольным прерыванием беременности
в сроках до 22-й нед.
Материал и методы исследования
Проведено проспективное когортное исследование. Основную группу составили 122 женщины с привычным выкидышем, контрольную – 103 беременные с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом.
Критерии включения в основную группу:
· срок беременности от 6-й до 8-й нед от первого дня последней менструации;
· нормальный кариотип партнеров;
· привычное невынашивание беременности (наличие в анамнезе 2 и более ранних и/или
поздних потерь беременности от одного и того же партнера);
· информированное согласие женщины на проведение исследования.
Критерии исключения:
· наличие генетических факторов привычных потерь беременности;
· аномалии развития матки у женщины;
· наличие хронических инфекционных и системных аутоиммунных заболеваний.
Данные пациентки представляли группу риска по прерыванию беременности на ранних и поздних сроках, с учетом того факта, что наличие неудач беременности в анамнезе увеличивает их риск при последующей беременности. Так, наличие в анамнезе двух выкидышей повышает риск прерывания последующей беременности до 38%, трех выкидышей – до 45%.
Критерии включения в контрольную группу:
· срок беременности от 6-й до 8-й нед от первого дня последней менструации;
· физиологическое течение беременности на момент обследования;
· неосложненный акушерский и гинекологический анамнезы;
· информированное согласие женщины на проведение исследования.
Критерии исключения:
· наличие хронических инфекционно-воспалительных и системных аутоиммунных заболеваний;
· тяжелые экстрагенитальные заболевания.
У всех пациенток основной и контрольной групп проведено исследование сэ-ДНК в I триместре беременности. Динамическое определение свободной эмбриональной ДНК проводилось, начиная с I триместра беременности, с интервалом в 2 нед до 20-й нед беременности у 24 женщин основной и 20 пациенток группы контроля. В связи с возможностью определять сэ-ДНК только у плодов мужского пола, в случае отсутствия генов Y-хромосомы в нескольких образцах на разных сроках беременности, у части беременных исследование было прекращено. Материалом для исследования служила плазма
периферической крови беременных. Первый забор крови осуществлялся при установлении факта беременности в сроке 6 нед от первого дня последней менструации. В случае отсутствия генов SRY или
DYS-14 в двух образцах с 2-недельным интервалом, результат признавался отрицательным, забор крови больше не производился. После рождения детей во всех случаях была оценена точность теста определения пола плода, при этом учитывался фенотипический пол, пол по данным полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в единичных неясных случаях проводилось кариотипирование новорожденного.
Для молекулярно-генетических исследований использовали периферическую кровь, собранную в
пробирки с ЭДТА. Кровь центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин, плазму отбирали
и повторно центрифугировали при 13 000 об/мин в течении 5 мин. ДНК выделяли из 500 мкл крови с
использованием комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-ГС» (ДНК-технология, Россия).
Наличие в крови беременной эмбриональной ДНК оценивалось путем выявления ДНК генов SRY (sex-
determining region Y) и TSPY-1 (Testis-specific protein, Y-linked-1) или DYS-14, сцепленных с Y-хромосомой.
Измерение содержания генов Y-хромосомы (SRY и DYS-14) проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно меченного TakMan-зонда.
Все полученные анамнестические данные, анализы и исследования были обработаны с помощью компьютерной программы Statistica for Windows v 8.0. Для всех количественных показателей были определены: среднее значение (M), стандартное отклонение (δ), ошибка среднего (m), 95% доверительный интервал, медиана (Ме), интерквартильный размах, а для номинальных значений рассчитаны частоты (%).
Полученные данные были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. При сравнении средних значений между группами применяли параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Анализ показателей, изменяющихся в течение беременности, производили с помощью парного t-критерия Стьюдента (при нормально распределенных значениях) или с помощью непараметрического аналога – критерия Вилкоксона.
Сравнение распределения показателей (частот) между группами осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат с построением соответствующих таблиц (2×2 или 2×3) или с помощью t-критерия Стьюдента для долей с поправкой Бонферони.
Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Определение зависимости между показателями осуществлялось с помощью корреляционного анализа Пирсона (r) или непараметрического критерия Спирмена (R). Для выявления значимости показателей применялся ROC-анализ, логистическая бинарная регрессия.
Результаты исследования и их обсуждение
Для решения поставленных задач был проведен тщательный анализ анамнеза пациенток исследуемых
групп, включавший сопоставление основных факторов, оказывающих воздействие на течение беременности: возраста, социально-экономического положения, наследственности, экстрагенитальной и гинекологической заболеваемости, характера менструальной функции, репродуктивного анамнеза.
Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту: средний возраст женщин основной группы составил 29,2±3,9 года, контрольной группы – 28,6±4,2 года (p>0,05). При анализе соматической заболеваемости значимых отличий в частоте встречаемости заболеваний между пациентками основной и контрольной групп не отмечено.
При изучении гинекологической заболеваемости, обращает на себя внимание высокий процент хронических воспалительных заболеваний у пациенток с привычным выкидышем: в анамнезе у каждой третьей женщины эндометрит и/или сальпингит, оофорит, что достоверно превышает частоту воспалительных заболеваний в контрольной группе − 31,1 и 11,7% соответственно (p<0,05). Средний возраст менархе в группах не различался (13,2±1,3 и 13,0±1,3 года; p>0,05). У подавляющего большинства пациенток с привычным выкидышем – 82,8% (101) менструальный цикл был регулярным,
длительностью 28,6±1,5 дня, у женщин контрольной группы 28,2±1,1 дня, что свидетельствует об отсутствии грубых нарушений овуляторных процессов.
При анализе репродуктивной функции установлено, что подавляющее большинство женщин основной
группы 80,4% (98) имели в анамнезе по 3–4 самопроизвольных выкидыша, 14,8% (18) – 5–7 самопроизвольных прерываний беременностей, лишь 4,9% (6) женщин – 2 самопроизвольных выкидыша. Необходимо отметить, что 3 женщины (1 в основной и 2 в контрольной группе) являлись носительницами генов, ответственных за реализацию сцепленных с полом заболеваний – миодистрофии Дюшенна, гемофилии, Х-сцепленного иммунодефицита. В 2 случаях это привело к рождению детей с миодистрофией Дюшенна и Х-сцепленным иммунодефицитом в исходах предыдущих беременностей, дети умерли в возрасте 5 и 11 лет. Выкидыши в анамнезе у женщин исследуемой группы в основном приходились на I триместр и составили 96,7% от числа всех самопроизвольных потерь. Поздние выкидыши регистрировались относительно редко – в 3,3% случаев. В анамнезе у женщин основной группы не было своевременных родов, то есть речь идет о первичном
привычном выкидыше. Пациентки с первичными нарушениями состояния репродуктивной системы –
наиболее сложный контингент беременных женщин, представляющих группу риска по реализации как
ранних, так и поздних гестационных осложнений ввиду реализации плацентарной недостаточности.
В вышеописанной группе беременных женщин с привычным выкидышем и в контрольной группе
было произведено определение сэ-ДНК методом ПЦР, динамическое наблюдение, анализ осложнений
и исходов беременностей.
Из 122 образцов периферической крови беременных женщин в I триместре сэ-ДНК была выявлена
в 72 случаях, при этом пол плода интерпретировался как мужской.
В основной группе был один случай несовпадения результатов, когда в периферической крови матери были выявлены гены Y-хромосомы, тогда как пол ребенка, родившегося в гестационном сроке
30 нед, был фенотипически определен как женский. Кариотипирование цитогенетическим методом дало результат 46ХХ. Однако тестирование крови новорожденной повторно выявило гены Y-хромосомы
SRY и DYS-14. Вероятно, речь идет о присутствии генов Y-хромосомы в хромосомном наборе девочки,
по-видимому, в неактивном состоянии. Информация передана наблюдающим ребенка педиатрам. На данный момент продолжается наблюдение за развитием ребенка.
В двух других случаях, по данным сэ-ДНК, пол плода был определен как женский, тогда как пренатально, по данным УЗИ, и после рождения фенотипически и кариотипически пол был определен как мужской. По-видимому, имела место недостаточная чувствительность метода в данных наблюдениях, вызванная чрезвычайно низким уровнем сэ-ДНК. В последнем перечне, обобщившем данные 23 подобных исследований, было показано, что ложноположительных результатов можно избежать, тогда как предотвращение ложно-отрицательных результатов, до сих пор представляет собой довольно сложную проблему [1].
Анализ качества диагностических методов неинвазивного определения пола плода в I триместре беременности показал, что чувствительность методики составила 99,2%, специфичность − 98,9%, точность − 99,1%.
Проведенный ROC-анализ показал, что площадь под ROC-кривой в случае определения DYS-14
составила 0,989±0,007, в случае определения SRY – 0,988±0,008, что соответствует отличным моделям
(рис. 1).
Рисунок 1. Чувствительность и специфичность методов неинвазивного определения плода (ROC-анализ).
Рисунок 2. Уровни генов DYS-14 и SRY у женщин основной и контрольной групп в I триместре беременности 6-8 недель.
Полученные данные согласуются с мировым опытом подобных исследований. В Великобритании точность определения пола плода составила 97,6%, по данным итальянских авторов – 99,4% [3].
При определении уровней генов Y-хромосомы в сроках 6–8 нед беременности было выявлено, что
показатели достоверно отличаются в основной и контрольной группах. В основной группе показатель DYS-14 составил 1021,0±660,6 копий/мл, в контрольной группе –172,4±56,8 копий/мл. Следовательно, средний показатель DYS-14 в основной группе в 5,9 раз превышал аналогичный показатель в группе контроля (p<0,01). Аналогичные показатели получены и по данным гена SRY: в основной группе средний показатель в 2,7 раз превосходил уровень SRY в группе контроля и составил 124,4±48,3 по сравнению с 45,3±21,6 копий/мл (p<0,01) (рис. 2). Полученные результаты, вероятно, указывают на
апоптотические процессы, происходящие в трофобласте у женщин с привычным выкидышем в I триместре. Гены сэ-ДНК, выявляемые в периферической крови матери, возможно, имеют апоптотическое происхождение, следовательно, в случаях осложненной беременности их уровни повышаются.
Несмотря на то что заболевания, сцепленные с полом, встречаются редко, в группе обследованных
женщин выявлено 3 случая, когда акушерская тактика была оптимизирована с использованием методов неинвазивной пренатальной диагностики. Это касалось диагностики пола плода при гемофилии, миодистрофии Дюшенна, Х-сцепленном тяжелом иммунодефиците. В одном наблюдении удалось избежать инвазивной пренатальной диагностики, так как был установлен женский пол плода, в двух остальных ситуациях раннее определение пола плода позволило наметить план обследования и диагностики. Кроме того, неинвазивное определение пола плода позволило определить мужской пол при атипично сформированных гениталиях плода в одном клиническом наблюдении. При кариотипировании после рождения был установлен кариотип 46ХY, у новорожденного имела место мошоночная форма гипоспадии полового члена.
Проведено проспективное наблюдение за течением и исходами беременностей женщин всех исследуемых групп. Самым частым осложнением в I триместре у женщин основной группы был угрожающий и начавшийся выкидыш: при эхографическом исследовании выявлено образование ретрохориальных гематом в 37,7% (46) наблюдений, ретроамниотических гематом – в 9,8% (12), отслоек хориона без визуализации гематом – в 12,3% (15) случаев.
Установлено, что в основной группе отмечался рост значений DYS-14 и SRY с 6-й по 20-ю нед гестации,
достоверно превышающий аналогичные показатели в контрольной группе (p<0,05).
Если обобщить потери беременности в основной группе до 22-й нед, то суммарно прервалось 22 беременности, из них только в 27,3% (6) случаях плоды были женского пола, при этом в 3 наблюдениях с аномальным кариотипом. Из 16 плодов мужского пола (72,7% от числа ранних потерь) хромосомная патология отмечена лишь в 3 наблюдениях, в остальных 13 выявлен нормальный мужской кариотип.
Согласно полученным нами данным, потери беременности в бóльшей степени происходят при беременностях плодами мужского пола. В связи с этим определение половой принадлежности плода
на ранних сроках беременности может иметь прогностическое значение в связи с доказанным более
высоким риском прерывания беременности при наличии плода мужского пола. Были проанализированы уровни генов Y-хромосомы у женщин с последующими потерями беременностей до 22-й нед.
Установлено, что отмечался рост значений DYS-14 и SRY с 6-й по 20-ю нед гестации достоверно превышающий как средние показатели в группе, так и контрольные значения (p<0,01).
Проанализированы осложнения II и III триместров, а также исходы беременностей у наблюдаемых
женщин. Всего у женщин основной группы было 13 преждевременных родов в связи с декомпенсированной плацентарной недостаточностью, все путем операции кесарева сечения, и 87 своевременных родов, из них 33% оперативным путем и 54% – через естественные родовые пути. При
сопоставлении уровней сэ-ДНК DYS-14 у женщин, чья беременность завершилась самопроизвольным
прерыванием до 22-й нед, по сравнению с показателями беременных, родивших своевременно, были
получены достоверные различия (1697,5±980,7 и 841,8±394,8 копий/мл соответственно; р<0,001).
По отношению к гену SRY аналогичные показатели составили 174,077±49,616 и 108,2±37,8 копий/мл
(р<0,001).
При проведении ROC-анализа генов Y-хромосомы по отношению к потерям беременности до 22-й нед
и своевременным родам получены отличные модели. Площадь под ROC-кривой в случае DYS-14
составила 0,864±0,051. Точкой «перегиба» можно считать значение 228, выше которого риск потерь
до 22-й нед возрастает. Площадь под ROC-кривой в случае гена SRY составила 0,900±0,047. Точкой
«перегиба» можно указать значение 140,0, выше которого, риск самопроизвольных потерь больше
(рис. 3, см. на вклейке).
Рисунок 3. Прогнозирование самопроизвольного прерывания беременности до 22-й нед. по уровням са-ДНК (ROC-анализ).
Таким образом, высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови матери в I триместре беременности свидетельствуют о повышенном риске гестационных осложнений, ассоциированных с нарушениями плацентации.
Из полученных данных следует, что у женщин, вынашивающих плодов мужского пола, открывается возможность прогнозирования как ранних потерь беременности, так и преждевременных родов, обусловленных плацентарной недостаточностью.
