Анеуплоидии у эмбрионов человека вносят существенный вклад в этиологию неудач имплантации и ранних репродуктивных потерь в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Для снижения риска переноса в полость матки эмбриона с хромосомной патологией проводят преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). Внедрение ПГТ-А в клиническую практику позволило повысить эффективность программ ВРТ; однако используемые в настоящее время методы ПГТ-А имеют ряд ограничений [1]. Причинами ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПГТ-А и, как следствие, неправильной оценки кариотипа эмбриона могут стать как погрешности на этапе предварительных манипуляций с эмбрионом, способы забора материала, так и непосредственно молекулярно-
генетические исследования биоптата. Основными и наиболее частыми проблемами являются загрязнение материала при биопсии и неравномерная полногеномная амплификация ДНК (Whole Genome Amplification, WGA) [2].
Было показано, что в среднем загрязнение случается в 0,4% образцов биопсии, но в некоторых клиниках оно может быть значительно более распространенным [2]. Поэтому важен постоянный контроль возможного загрязнения для исключения неправильного диагноза.
До недавнего времени большинство коммерчески доступных платформ для ПГТ-А использовали амплификацию всего генома с последующим секвенированием случайной выборки фрагментов ДНК, разбросанных по всему геному, с использованием технологии секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). Однако простые количественные измерения фрагментов ДНК, полученных из каждой хромосомы, обеспечиваемые такими методами, не могут выявить, загрязнен ли образец биопсии неэмбриональной ДНК. Отрицательный контроль редко используется во время ПГТ-А и является неадекватным, поскольку не позволяет оценить загрязнение в самой пробирке, содержащей биопсийный образец.
С целью выяснения частоты случаев контаминации было проведено ретроспективное исследование, включавшее анализ 49 287 образцов биопсии трофэктодермы, по которым проводилась ПГТ-А [2]. Эмбрионы, у которых был обнаружен контаминированный биоптат, обычно подвергались повторной биопсии. В таких случаях результаты двух образцов сравнивались, чтобы установить, имела ли место ошибка при установке исходного результата загрязненного образца, если бы анализ ограничивался изучением только относительного числа копий хромосом, как это имеет место в большинстве методов ПГТ-А, основанных на NGS. Для идентификации реального происхождения данных из образцов использовался анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в продуктах полногеномной амплификации. Генотип каждого SNP и относительное количество фрагментов ДНК, содержащих каждый из различных аллелей, позволяют обнаруживать триплоидию, гаплоидию и контаминацию. Из 49 287 проанализированных биоптатов загрязнение неэмбриональной ДНК было обнаружено в 218 (0,44%). В 25 клиниках, предоставивших образцы, наблюдались различия в показателях контаминации, которые варьировали от 0 до 1,5%, хотя в одной из клиник уровень контаминации составил 7,7% (при количестве биопсий 26) [2].
Результаты были разделены на 3 категории: 1) отсутствие изменений в интерпретации между первым (загрязненным) и вторым образцами биопсии; 2) ложноположительный результат – загрязненный образец был эуплоидным, но был бы ошибочно интерпретирован как триплоидный и ошибочно отброшен, что потенциально повлияло бы на эффективность ВРТ; 3) ложноотрицательный – загрязненный образец был полностью анеуплоидным, но был бы неправильно классифицирован как мозаичный или эуплоидный и мог бы быть пригоден для переноса, что потенциально привело бы к неудаче имплантации или аномальной беременности. Ложноотрицательный результат был получен в 19% загрязненных образцов, в то время как в 24% – получен ложноположительный результат, «имитировавший триплоидию» [2].
Авторы исследования подчеркивают ограничения и сложности своего исследования. А именно то, что невозможно с уверенностью определить происхождение загрязняющих веществ, не имея ДНК из источника загрязнения для сравнения. Кроме того, невозможно сделать вывод о том, является ли загрязнение более вероятным при проведении циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), поскольку только 3% образцов были оплодотворены с помощью ЭКО [2].
Таким образом, обнаружение контаминации во время ПГТ-А важно для предотвращения ошибок при кариотипировании эмбриона. Пропущенная контаминация и, как следствие, неправильная оценка кариотипа могут привести к выбраковке потенциально жизнеспособных эмбрионов, что может способствовать переносу анеуплоидных эмбрионов, ошибочно классифицированных как мозаичные, и увеличить частоту неудач имплантации, выкидышей и анеуплоидных беременностей.
Второй не менее важной проблемой, которая может привести к неправильной интерпретации результатов ПГТ-А на анеуплоидию, является WGA. Проблемы, приводящие к неточной воспроизводимости WGA: предпочтительная амплификация и выпадение аллелей.
Методы полногеномной амплификации ДНК начали разрабатываться для использования в проектах геномных исследований с конца XX в. Они были направлены в первую очередь на получение надежного метода масштабирования малых количеств ДНК без использования трудоемких и дорогостоящих методов клонирования, которые не гарантировали точность, а также могли приводить к утрате части наследственной информации. Однако ограниченные возможности генной инженерии на ранних этапах позволяли использовать только большую субъединицу ДНК-полимеразы I из Escherichia coli (фрагмент Кленова) для амплификации ДНК в присутствии случайных гексануклеотидных праймеров, что могло позволить увеличить количество исходной ДНК лишь вдвое за счет репликации второй цепи на каждой из последовательностей денатурированной двунитевой ДНК [3]. Этого было бы недостаточно для амплификации предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток. Реальные возможности масштабирования исходного образца появились после разработки метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе термостабильной ДНК-полимеразы [4]. В 1992 г. для полногеномной амплификации был разработан метод на основе ПЦР с вырожденными праймерами (Degenerate Oligonucleotide Primed, DOP) – DOP-ПЦР, основанный на использовании праймеров, внутренняя последовательность которых состоит из 6 случайных нуклеотидов: 5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ [5]. Протокол амплификации начинался с циклов с низкотемпературным отжигом и плавным повышением температуры, в результате чего образовывались фрагменты ДНК, фланкированные адаптерной последовательностью, которые можно было амплифицировать в дальнейшем с использованием стандартного протокола ПЦР. Однако незнание принципов организации геномов многоклеточных и ложное представление о доле кодирующих последовательностей не позволили авторам этого метода добиться равномерной амплификации ДНК [5]. Дальнейшее развитие DOP-ПЦР было связано с модификацией последовательностей праймеров и подбором оптимальных условий низкотемпературных циклов. Они легли в основу целого ряда коммерческих наборов для WGA, однако ни один из них так и не смог приблизиться к реальной полноте и равномерности амплификации ДНК как различных участков, так и целых хромосом отдельных клеток [5]. Прорыв наступил после открытия полимераз с геликазной активностью, которые позволили не только амплифицировать участки, обогащенные шпильками, но и разработать подходы для проведения изотермической амплификации. Большая субъединица ДНК-полимеразы I Bst из термофильной бактерии Geobacillus stearothermophilus (до 2001 г. вид назывался Bacillus stearothermophilus), в отличие от фрагмента Кленова, имеет не только более высокую оптимальную температуру для синтетической активности, не имеет 3’-5’-экзонуклеазной активности, но способна вытеснять из дуплекса вторую нить и продолжать синтез [6].
Использование ее для WGA легло в основу разработки методов на основе амплификации множественного вытеснения цепи (Multiple-Strand Displacement Amplification, MDA), которые позволили увеличить выход продукта в одном раунде синтеза за счет перекрывания фрагментов [7]. Недостатком этой амплификации было ограничение по длине фрагмента из-за процессивности фермента, а также накопление ошибок [7]. Попытки WGA на основе MDA предпринимались ранее с использованием полимеразы фага Phi29, характеризующейся существенно более высокой скоростью работы и точностью [8]. Его использование легло в основу коммерческих наборов, таких как REPLI-g (Qiagen), показано его успешное применение для амплификации малых количеств ДНК при проведении сравнительной геномной гибридизации [9]. Однако метод не получил широкого внедрения в клиническую практику, поскольку не позволяет добиться равномерной амплификации. Более того, как правило, фрагментация ДНК (следующий после WGA этап ПГТ-А) является более сложным препятствием для методов на основе MDA, и более предпочтительны методы на основе ПЦР [10].
Использование гексануклеотидных случайных праймеров, обусловленное низким температурным оптимумом работы фермента (30°C), выделенного из фага бактерии Bacillus subtilis, а также получение неконтролируемого ветвления продукта усложняют процедуру линеаризации ДНК и стандартизации последующего приготовления библиотек для NGS. Существенным прорывом в развитии методов WGA стали объединение протоколов MDA и DOP-ПЦР и разработка протокола MALBAC [11], его модификация была стандартизирована компанией Rubicon Genomics (в последующем Takara) и по лицензии используется в составе наборов SurePlex DNA Amplification System (Illumina). Особенностью коммерческих наборов для WGA предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток стало использование инвариантной части праймеров на основе сочетания двух нуклеотидов G и T и включения 6 вариативных (случайных) нуклеотидов в последовательность. Первый этап выполняется с использованием полимеразы с геликазной активностью, а на втором этапе используется ПЦР.
В исследовании Ignatov K.B. et al. сообщается об улучшениях в амплификации ДНК из единичных клеток при использовании SD ДНК-полимеразы, которая является мутантом ДНК-полимеразы Taq с сильной активностью по смещению цепей (в отличие от Taq-полимеразы) и высокой термостабильностью. Оба эти свойства SD ДНК-полимеразы в сочетании с высокой активностью полимеразы обеспечивают заметное улучшение чувствительности и эффективности ПЦР (включая амплификацию матриц, богатых GC, и сложных вторичных структур), ПЦР на большие расстояния (LR-ПЦР), петлевую амплификацию (LAMP) и полимеразную реакцию смещения цепи (PCDR) [12]. В более позднем исследовании эти же авторы описывают новый вариант DOP-PCR с улучшенной производительностью WGA, которая достигается с применением SD-полимеразы. Они также сравнивали улучшенную DOP-ПЦР (iDOP-PCR) с «классической» DOP-ПЦР [5] и с использованием коммерчески доступной методики PicoPlex от Rubicon Genomics Inc. (Мичиган, США), которая в настоящее время является преобладающим методом, используемым для преимплантационной генетической диагностики и других медицинских применений [13].
В нашем предыдущем исследовании было предложено использование двухступенчатой полногеномной амплификации для увеличения надежности данных молекулярного исследования кариотипа исходного образца на основе анализа 20 пг ДНК. На первом этапе фланкирования фрагментов ДНК и амплификации с вытеснением второй цепи была использована пара частично вырожденных праймеров: 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNGG и 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNTTT, а на втором этапе ПЦР ограничились использованием праймера на основе конститутивной части 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGG. В работе приведены условия реакции и сравнение использования различных полимераз, а также их сочетаний. Показана возможность применения для первого этапа комбинации полимераз Bst и Pfu в присутствии 10 мМ ионов магния, а также выявлен потенциал для использования полимеразы Klentaq1, несущей замену D732N, для развития методов полногеномной амплификации. Продемонстрировано, что предложенный метод позволяет масштабировать исходное предельно малое количество ДНК для получения образца, пригодного для анализа методом массового параллельного секвенирования (секвенирование нового поколения, NGS) с применением стандартных коммерческих протоколов интерпретации данных [14].
Еще один подход демонстрирует российский производитель наборов для ПГТ-А – компания ООО «Биолинк» в своем наборе SC WGA Display («Биолинк», Новосибирск) предлагает использование полимеразы SD, способной выдерживать нагревание до 92°C, что дает возможность проведения обоих этапов амплификации одним ферментом в одной пробирке, что дополнительно снижает риск контаминации образца.
Все подходы в полногеномной амплификации ДНК имеют свои преимущества и недостатки, поэтому выбор того или иного метода зависит от области применения. В нашем случае для проведения ПГТ-А необходим надежный, стабильно функционирующий и безотказный метод. Другими аспектами для принятия решения о том, какой метод применить в WGA, являются длина протокола, стоимость и потенциал автоматизации.
Целью настоящей работы был сравнительный анализ методов полногеномной амплификации ДНК из клеток биоптата трофэктодермы эмбрионов 5-го дня развития для получения надежных данных о молекулярном кариотипе эмбриона методом NGS с использованием коммерческих реактивов SurePlex (Illumina, США) и PGT Display («Биолинк», Новосибирск) = iDOP-PCR (Bioron, Germany).
Материалы и методы
Для исследования были использованы эмбрионы человека, полученные в результате оплодотворения ооцитов от доноров в возрасте от 20 до 32 лет. Ооциты были получены на основе индивидуального добровольного согласия, разработанного, в том числе, для реализации исследований, и оплодотворены спермой доноров из банка спермы Международного центра репродуктивной медицины (МЦРМ). Эмбрионы культивировали на средах COOK до 5–6-го дня развития по опубликованному ранее протоколу [15]. У бластоцист отличного и хорошего качества была выполнена биопсия клеток трофэктодермы с использованием лазера. Анеуплоидные эмбрионы (по результатам ПГТ-А) были разморожены, и вторично взята биопсия, как описано ранее [16]. Полученные образцы клеток трофэктодермы 7 биоптатов были использованы для дальнейшего исследования. В качестве положительного контроля использовали стандартную мужскую ДНК (Agilent Technologies, США), разведенную до получения в одной реакции 20 пг ДНК (что соответствует ожидаемому количеству ДНК из клеток биоптата трофэктодермы). Полногеномную амплификацию и приготовление библиотек проводили наборами VeriSeq PGS (Illumina, США) и PGT Display («Биолинк», Новосибирск). Концентрацию ДНК в образцах после проведения WGA измеряли на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием интеркалирующего красителя Pico488 (Lumiprobe, Москва). Для сравнения результатов амплификации использовали коммерческие наборы реактивов для амплификации ДНК из отдельных клеток SurePlex DNA Amplification System (Illumina, США) и SC WGA Display («Биолинк», Новосибирск) в разных комбинациях. Приготовление библиотек проводили при помощи наборов VeriSeq PGS (Illumina, США) и PGT Display («Биолинк», Новосибирск) с последующим секвенированием (NGS) на аппарате MiSeq System (Illumina, США). Контроль размера и качества библиотек осуществляли с помощью High Sensitivity DNA D5000 ScreenType, используя Type Station System (Agilent Technologies, США). Анализ качества определения молекулярного кариотипа исходного образца выполняли с использованием программного обеспечения BluFuse Multi v4.3 (Illumina, США) и Display («Биолинк», Новосибирск).
Результаты и обсуждение
В настоящей работе мы провели сравнительный анализ методов полногеномной амплификации ДНК из клеток биоптата трофэктодермы эмбрионов 5-го дня развития для оценки степени надежности получаемых данных о молекулярном кариотипе эмбриона методом NGS с использованием коммерческих реактивов SurePlex (Illumina, США) и PGT Display («Биолинк», Новосибирск).
В связи со сложностью использования в РФ в настоящее время многих запатентованных импортных методов и наборов основной целью исследования были сравнительный анализ доступного в нашей стране набора для полногеномной амплификации с «эталонным» набором, а также анализ возможности использования различных программ по интерпретации данных.
Для отработки оптимальных условий проведения WGA на первом этапе мы анализировали полученные WGA продукты с помощью High Sensitivity DNA D5000 ScreenType, используя Type Station System (рис. 1).
Как видно из рисунка 1, размер WGA чуть больше у SC WGA Display по сравнению с SurePlex DNA Amplification System. Дополнительный этап ПЦР несколько уменьшает размер WGA продукта, но не существенно. Таким образом, полученные результаты «схожих длин» фрагментов позволили использовать в дальнейшем различные комбинации протоколов пробоподготовки.
На втором этапе исследования мы провели изучение 7 эмбрионов, используя различные «комбинации» наборов и программ для SurePlex (Illumina, США) и PGT Display («Биолинк», Новосибирск) (рис. 2). В качестве основного протокола для подготовки библиотек мы использовали Nextera XT (Illumina, США) и проводили с ней сравнение. Библиотеки и дальнейший программный анализ были приведены согласно рисунку 2.
Все геномные библиотеки были просеквенированы в одном запуске MiSeq System (Illumina, США) для исключения влияния различных условий и реактивов для секвенирования.
Как видно из рисунка 2, для большинства проб получены схожие результаты. Так, кариотипы совпали для всех образцов, за исключением образца № 3. В данном образце выявлена перестройка – моносомия 7p22.3-p11.2 с помощью протокола Illumina. Однако при использовании комбинации WGA Display + Nextera (Display) выявляется частичная трисомия 7q31.1-q36.3, которая более отчетливо видна при обработке данных секвенирования с помощью BluFuse Multi v4.3 (Illumina, США). Возможно, данные особенности связаны с нюансами самого процесса WGA или наличием мозаицизма и митотической ошибки. Подобный механизм был описан в работе [17]. Однако в связи с отсутствием ребиопсийного материала проверить это методом FISH не предоставляется возможным.
В целом данные по всем образцам демонстрируют то, что дополнительный этап ПЦР (реамплификация), который рекомендуется в некоторых случаях (мало ДНК) компанией «Биолинк», дает больше «шума» (overall noise 0,35 против 0,47 для пробы 6) и поэтому, на наш взгляд, может быть использован только при изначально низкой концентрации WGA продукта. По остальным пробам данные были схожие (не приведены в статье).
Следует отметить, что программа BluFuse Multi v4.3 достаточно хорошо «читает» данные, полученные с помощью разных протоколов секвенирования. В то время как программа Display лучше совместима с «родными» реагентами. Отечественный протокол оказался более длительным, чем зарубежный аналог (на 2 рабочих часа), что, однако не является критичным. Результаты NGS (разными наборами) на образцах биоптата эмбрионах, для которых уже выявлены анеуплоидии, показали возможность взаимозаменяемости/совместимости протоколов, что является, безусловно, важным и положительным моментом. При этом «комбинированные» протоколы практически не уступали рекомендованным производителями.
Использование при исследовании «комбинированных» протоколов позволило подобрать условия для получения амплификата, результаты секвенирования которого могут быть проанализированы с применением распространенных коммерческих алгоритмов и программного обеспечения для выявления числовых хромосомных аномалий. Эти методы могут быть реализованы в подготовке материала для анализа молекулярного кариотипа отдельных клеток, в том числе для ПГТ эмбрионов человека и исследования опухолевых клеток, а также оказаться полезными в областях биомедицины [18, 19] и судебно-медицинских исследований, где востребована равномерная амплификация предельно малых количеств ДНК.
Заключение
Комбинированный метод амплификации ДНК, сочетающий использование частично вырожденных праймеров, изотермическую амплификацию с вытеснением второй цепи и двухступенчатый протокол ПЦР (набор реагентов WGA-display производства ООО «Биолинк», Новосибирск), показал возможность использования такого продукта для дальнейшего секвенирования методом NGS с использованием как фирменных реактивов производителя SurePlex DNA Amplification System (Illumina), так и реактивов и SC WGA Display («Биолинк»).
Сравнение результатов ПГТ-А с использованием различных наборов показало применимость разработанного нами «гибридного» протокола, где могут использоваться как зарубежные наборы для полногеномной амплификации, так и отечественные. Данный подход показал высокую надежность наборов WGA с SD-полимеразой для подготовки материала к проведению ПГТ эмбрионов человека, а также может найти применение в других областях биомедицины и судебно-медицинских исследований, где востребована высокая надежность и точность амплификации предельно малых количеств ДНК.
