Бесплодие является важнейшей медико-социальной проблемой, оказывающей негативное влияние не только на конкретные супружеские пары, но и на демографическую обстановку в стране в целом. Под бесплодием понимают ситуацию, когда паре не удается достичь беременности через 12 месяцев в возрасте до 35 лет (или 6 месяцев в позднем репродуктивном возрасте) при регулярной половой жизни без контрацепции. Однако само по себе наступление беременности еще не гарантирует рождения ребенка. Европейское общество репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) выделяет такое понятие, как «ранние репродуктивные потери», под которыми понимают потерю беременности до 12 недель гестационного возраста [1].
Оптимальной тактикой при привычном невынашивании беременности (потеря 2 и более беременностей до 22 недель гестации) является максимально полное обследование женщины и мужчины с целью выявления патологических состояний, способных повышать риск потери беременности, с последующим лечением у гинеколога и уролога-
андролога соответственно. Тем не менее в ряде ситуаций требуется более быстрое решение проблемы, в том числе у пар позднего репродуктивного возраста, при напряженной психологической обстановке, при низкой комплаентности одного или обоих партнеров. В связи с этим у таких пациентов оправдано применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с персонифицированным подходом к эмбриологическому этапу лечения.
Следует понимать, что сами по себе ВРТ не устраняют полностью риск невынашивания беременности. Напротив, применение ВРТ обходит несколько механизмов селекции гамет и эмбрионов, предусмотренных природой. Ярким примером является технология интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ), которая позволяет использовать даже единичные и неподвижные сперматозоиды для оплодотворения.
При применении ВРТ у пар с привычным невынашиванием беременности необходимо использовать методики, направленные на устранение или компенсацию фактора, приводившего к репродуктивным потерям при естественном зачатии. Как правило, это манипуляции с гаметами и эмбрионами in vitro, возможные исключительно при ВРТ. Одним из подходов при низком качестве сперматозоидов является отбор субпопуляции наиболее качественных мужских половых клеток для последующей ИКСИ.
Один из передовых методов для отбора качественных сперматозоидов основан на том, что зрелые мужские половые клетки имеют на своей поверхности сиаловые кислоты, обеспечивающие им отрицательный электрический заряд (дзета-потенциал) до -20 мВ [2]. Считается, что такие сперматозоиды обладают более высокой целостностью хроматина и являются более пригодными для оплодотворения [3, 4]. Таким образом, использование именно этих сперматозоидов для введения в ооцит в рамках ВРТ может оказаться эффективным методом преодоления репродуктивных потерь.
Цель настоящего исследования: оценка эффективности отбора сперматозоидов по дзета-потенциалу при лечении бесплодия методами ВРТ у супружеских пар с привычным невынашиванием беременности.
Материалы и методы
Было проведено проспективное когортное исследование, в которое вошли супружеские пары, обратившиеся в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия им. профессора Б.В. Леонова ФБГУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России для проведения лечения бесплодия методами ВРТ. Все участники не имели противопоказаний и ограничений к лечению бесплодия методами ВРТ и подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Критерии включения: возраст женщины от 18 до 40 лет, 2 и более эпизода ранних репродуктивных потерь беременности в анамнезе (до 12 недель гестации), наличие изменений в базовых показателях спермограммы (количество, подвижность, доля морфологически нормальных сперматозоидов), нормальный овариальный резерв по данным ультразвуковго исследования и гормонального скрининга, регулярный менструальный цикл, нормальный кариотип супругов, перенос эмбриона в полость матки без преимплантационного генетического тестирования, отсутствие маточного фактора бесплодия. Критерии исключения: использование донорских гамет и суррогатного материнства, аномалии строения внутренних органов, эндокринопатии, проведение программы ВРТ в естественном менструальном цикле, оплодотворение сперматозоидами, выделенными из придатка или ткани яичка, наружный генитальный эндометриоз III–IV стадии распространения, отсутствие оплодотворения методом ИКСИ.
Перед включением в программу лечения все супружеские пары были обследованы согласно Приказу Минздрава России от 31 июля 2020 г. № 803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Стимуляцию функции яичников у всех пациенток выполняли по стандартному протоколу с применением препаратов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). С целью финального созревания фолликулов использовали препарат хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в дозе 10 000 МЕ или агониста ГнРГ 0,2 мг. Пункцию фолликулов выполняли через 36 ч после введения триггера под кратковременным внутривенным обезболиванием в условиях малой операционной аспирационными атравматичными иглами (VitroLife, Швеция). В соответствии с критериями включения и исключения в исследование вошли 120 супружеских пар. Для оценки влияния метода селекции сперматозоидов по мембранному дзета-потенциалу пациенты были разделены на 2 группы: исследуемая группа (n=62) – ИКСИ с использованием сперматозоидов, отобранных по мембранному дзета-потенциалу; группа сравнения (n=58) – ИКСИ с использованием сперматозоидов, выделенных стандартным методом с помощью градиента плотности.
Эякулят собирали в стерильные контейнеры после 2–3 дней полового воздержания. Сперматозоиды исследуемой группы были на первом этапе обработаны с помощью центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) в соответствии с протоколом производителя (Sage, ORIGIO, Дания). Далее выделенная фракция мужских половых клеток отбиралась по дзета-потенциалу согласно описанной ранее методике [5]. Кратко: после полного разжижения эякулята проводилась оценка подвижности и морфологии мужских половых клеток по строгим критериям Крюгера. К 1 мл нативного эякулята добавляли 3 мл культуральной бессывороточной среды Multipurpose Handling Medium – MHM (Irvine Scientific, США) и центрифугировали в течение 10 минут на 300G (Centrifuge CM-6M, ELMI, Латвия). Образовавшийся осадок ресуспендировали с 5 мл культуральной бессывороточной среды MHM. Далее пробирке придавали положительный поверхностный заряд и инкубировали в течение 1 минуты при температуре 37°C. Надосадочную жидкость удаляли, а мужские гаметы с отрицательным зарядом мембраны на поверхности пробирки разбавляли 0,2 мл среды Sperm Washing Medium (Irvine Scientific, США) и использовали для ИКСИ.
В контрольной группе эякулят обрабатывали по стандартной технологии на градиенте плотностей согласно инструкции производителя (Sage, ORIGIO, Дания). Первичными конечными точками в исследовании считали частоту оплодотворения и частоту формирования бластоцист. Вторичными конечными точками служили такие параметры, как частота наступления клинической беременности и частота развития беременности до 12 недель. Качество бластоцист оценивалось по классификации Gardner [6]. Для возможности проведения статистического анализа эмбрионы были разделены на несколько категорий по качеству: отличное качество (АА); хорошее качество (АВ, ВА); среднее качество (ВВ); плохое качество (оценка С эмбриобласта и/или трофобласта).
Статистический анализ
Для статистического анализа данных был использован программный пакет SPSS. Для оценки характера распределения данных применен тест Шапиро–Уилка. Значения всех переменных, за исключением уровня ФСГ, не были распределены нормально. Для проверки статистической значимости различий по категориальным переменным использовался тест хи-квадрат (точный тест Фишера для бинарных показателей), по количественным переменным – U-тест Манна–Уитни, по количественным переменным с нормальным распределением – t-тест Стьюдента. Данные с характером распределения, не соответствующим нормальному, представлены в виде медиан (Me) и межквартильных интервалов (Q1; Q3). Данные с нормальным распределением представлены в виде средних значений (M) и стандартных отклонений (SD).
Исследование было одобрено комиссией по этике ФГБУ «НМИЦ АГП им. Кулакова» Минздрава России.
Результаты
Для оценки первичных различий между сравниваемыми группами, которые могли бы повлиять на частоту наступления беременности, было проведено сравнение по ряду демографических, клинико-анамнестических и лабораторных параметров (табл. 1). Как видно из данных, представленных в таблице 1, медиана возраста пациенток находилась в пределе 32–33 лет. Среди включенных в исследование пациенток не наблюдалось значимой тенденции к избыточной или недостаточной массе тела. Судя по медианам эндокринных показателей (антимюллеров гормон (АМГ), ФСГ), тенденции к снижению овариального резерва среди этих пациенток также не отмечалось. Медиана длительности бесплодия в анамнезе составила 4 года в обеих группах. Стимуляцию функции яичников проводили в обеих группах по стандартным протоколам, различий выявлено не было.
Характеристика менструальной функции женщин, включенных в настоящее исследование, представлена в таблице 2. Значимых отличий между пациентами выявлено не было.
Исходя из данных, представленных в таблице 3, нет оснований предполагать, что на результаты сравнения могли повлиять различия по выраженности мужского фактора бесплодия. Возраст партнеров пациенток не имел статистически значимого различия между основной группой и группой сравнения. По базовым показателям спермограммы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов) группы также не различались.
Характеристики раннего эмбриогенеза в двух группах представлены в таблице 4. Количество ооцитов, полученное при пункции фолликулов, не отличалось между группами, следовательно, не могло исказить результаты их сравнения по эффективности ВРТ. По частоте получения зрелых ооцитов, частоте оплодотворения и формирования бластоцист обе группы были сопоставимы между собой. Наблюдалась статистически значимая тенденция к формированию эмбрионов более высокого качества в исследуемой группе (табл. 4), что указывает на больший потенциал к развитию эмбрионов при отборе сперматозоидов по дзета-потенциалу у супружеских пар в исследовании.
При оценке эффективности использования технологии селекции сперматозоидов по дзета-потенциалу были выявлены следующие результаты. Перенос эмбрионов в полость матки осуществлен всем пациенткам. Не были выявлены случаи остановки раннего эмбриогенеза. Всем женщинам переносили эмбрионы 5-х суток культивирования на стадии бластоцисты. В исследуемой группе беременность в результате применения ВРТ наступила у 22/62 пар, в 1/22 случае отмечен эпизод невынашивания беременности до 12 недель гестации. В группе сравнения беременность наступила в 18/58 случаях, однако 6/18 завершились прерыванием до 12 недель. Таким образом, частота наступления клинической беременности в исследуемой группе составила 35,4%, а в группе сравнения – 31% (p=0,69; ОР=0,87; 95% ДИ 0,52–1,45). Частота ранних репродуктивных потерь на цикл ВРТ в исследуемой группе составила 1,6%, а в группе сравнения – 10,4%. При расчете на фактически наступившие беременности этот показатель составил 4,5 и 33,3% соответственно, и эта разница была статистически значимой (p=0,03; ОР=0,13; 95% ДИ 0,01–1,00).
Обсуждение
Считается, что важными факторами риска репродуктивных потерь являются оксидативный стресс и повышение индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, в связи с чем мужчинам, как правило, назначаются антиоксидантные добавки [7]. Есть и иные мужские факторы, влияющие на результативность ВРТ, такие как наличие латентных инфекций добавочных половых желез и изменение состава семенной плазмы, которые могут проявлять себя как умеренная агглютинация сперматозоидов и вискозипатия эякулята [8]. Однако терапия может быть достаточно длительной и не гарантирует результата, из-за чего в ряде случаев требуется ранний переход к методам ВРТ.
В нашем исследовании были наглядно продемонстрированы преимущества отбора сперматозоидов по дзета-потенциалу при применении ВРТ у пар с неоднократными репродуктивными потерями в анамнезе. Исследуемая группа значимо не отличалась по частоте оплодотворения и частоте бластуляции, что согласуется с данными о том, что роль отцовской половины генома на самых ранних этапах развития эмбриона минимальна [9]. Однако количество бластоцист отличного и хорошего качества было статистически значимо выше в группе, где для оплодотворения использовали сперматозоиды, отобранные по дзета-потенциалу. Следует отметить, что это не отражалось на частоте наступления клинической беременности как таковой, хотя, вероятно, повлияло на риск невынашивания.
Определение мембранного дзета-потенциала сперматозоидов является перспективным методом для интегрального определения их функциональной способности [10]. Vahidi S. et al. провели попытку оценки индекса фрагментации ДНК во фракциях сперматозоидов, выделенных с помощью отбора по дзета-потенциалу и по реакции с гиалуроновой кислотой [11]. Было установлено, что оба метода приводят к получению субпопуляции сперматозоидов с меньшим индексом фрагментации ДНК по сравнению с нативным образцом. Отбор с гиалуроновой кислотой оказался более эффективным по этому параметру (тест дисперсии хроматина: 24,15% против 28,04%). Однако в исследовании Vahidi S. et al. не оценивались клинические конечные точки. При интерпретации этих результатов важно помнить, что индекс фрагментации ДНК сперматозоидов – важный, но не абсолютный маркер их качества.
Ghorbani-Sini R. et al. провели попытку изучения альтернативного маркера качества сперматозоидов – длины их теломер [12]. Отобранные по центрифугированию в градиенте плотности и по дзета-потенциалу сперматозоиды не отличались по длине теломер от нативного образца. Измеренный методом TUNEL индекс фрагментации ДНК был ниже у сперматозоидов, отобранных по дзета-потенциалу. Клиническая эффективность ВРТ с использованием этих клеток не изучалась.
Ранее в исследовании Sefidgar Tehrani M. et al. оценивалась эффективность отбора сперматозоидов по дзета-потенциалу при индексе фрагментации ДНК более 30% у мужчин с олиго- и астенозооспермией [13]. Расхождения по критериям включения не позволяют полноценно сравнивать результаты исследования [13] с настоящим исследованием. Как и в нашей работе, у Sefidgar Tehrani M. et al. не было обнаружено разницы по частоте оплодотворения при применении отбора по дзета-потенциалу, но отмечено большее число бластоцист высокого качества. В отличие от текущих данных в статье была представлена более высокая частота имплантации при использовании отбора по дзета-потенциалу в сравнении с контрольной группой (42% против 24%), что может быть связано с исходно более плохим качеством сперматозоидов. Частота невынашивания беременности в работе Sefidgar Tehrani M. et al. не оценивалась.
Необходимо отметить, что основным недостатком настоящего исследования является отсутствие рандомизации. Это было проспективное исследование с контрольной группой, материал для которого был получен в рамках реальной клинической практики. Преимуществом работы является то, что в ней оцениваются не только эмбриологические, но и клинические конечные точки (частота ранних репродуктивных потерь до 12 недель гестации).
Заключение
Ранние репродуктивные потери после применения ВРТ являются важной проблемой, способной снижать реальную результативность экстракорпорального оплодотворения. Профилактика невынашивания беременности требует полноценного обследования обоих партнеров в супружеской паре, прегравидарной подготовки и, при наличии показаний, лечения у гинеколога и андролога. Тем не менее иногда необходимо применение специальных технологий на эмбриологическом этапе, то есть персонификации лечения бесплодия. ИКСИ с отбором сперматозоидов по мембранному дзета-потенциалу является потенциально эффективным методом предотвращения ранних репродуктивных потерь при низком качестве мужских половых клеток, в данной работе – при тератозооспермии. Отбор по дзета-потенциалу остается одним из немногих методов селекции сперматозоидов, для которого существуют, и продолжают накапливаться доказательства клинической эффективности. В нашем исследовании были продемонстрированы преимущества этой методики перед центрифугированием в градиенте плотности по качеству получаемых бластоцист. Отбор сперматозоидов по дзета-потенциалу приводил к снижению частоты ранних репродуктивных потерь после ИКСИ. Этот метод, по всей видимости, эффективен и безопасен, но требует дальнейшего изучения с целью валидации полученных результатов и определения показаний к его применению.
