Внутриутробное неблагополучие эмбриона закладывается на этапах имплантации и плацентации и лежит в основе формирования многих гестационных осложнений [4]. Поэтому профилактические мероприятия, направленные на предупреждение возможных осложнений беременности и проводимые на поздних сроках гестации, зачастую оказываются неэффективными. В связи с этим важно понимать особенности ключевых событий ранних сроков беременности для своевременного проведения патогенетически обоснованной профилактики гестационных осложнений.
Имплантация, плацентация и ремоделирование спиральных артерий требуют участия большого количества генов, задействованных в процессах адгезии, коагуляции, фибринолиза и ангиогенеза [3]. Изучение полиморфизма этих генов представляется крайне важным. Если до беременности носительство мутантной аллели по одному или нескольким генам, возможно, не оказывает влияния на работу материнского организма, то во время беременности это обстоятельство может вносить существенный вклад в развитие и выраженность патологических изменений [2]. В рамках генетической предрасположенности к развитию осложнений беременности активно изучаются полиморфизмы генов свертывающей системы крови, поскольку тромбофилические состояния являются самым распространенным этиологическим фактором, оказывающим свое действие локально на уровне системы мать-плацента-плод и непосредственно приводящим к нарушениям имплантации и плацентации. Однако в данной статье мы бы хотели остановиться на полиморфизмах генов, негативное влияние которых проявляется системно на уровне материнского организма и косвенным образом приводит к развитию гестационных осложнений.
Для этого нами были выбраны две патологии – привычное невынашивание беременности (ПНБ) и преэклампсия – реализующиеся в разные сроки беременности, но обусловленные нарушением инвазии трофобласта на фоне оксидантного стресса (ОС) в тканях плаценты [19]. Системные нарушения в организме матери, связанные с регуляцией артериального давления (АД), сосудистого тонуса и функционального состояния эндотелия, способствуют усиленной продукции активных форм кислорода (АФК). Генерализованный ОС в тканях синцитиотрофобласта является основной причиной, приводящей к выкидышу. Если же активность антиоксидантных систем плаценты способна противостоять воздействию АФК, но недостаточна для того, чтобы в полном объеме нейтрализовать его, развивается фетоплацентарная недостаточность и/или преэклампсия [7].
Целью работы стало изучение полиморфизма генов, участвующих в регуляции АД (ангиотензинпревращающий фермент – ACE, ангиотензиноген – AGT), сосудистого тонуса и функционального состояния эндотелия (эндотелиальная NO-синтаза – eNOS, и CYBA, кодирующий p22phox субъединицу NADH-оксидазы) и их вклада в развитие ПНБ и преэклампсии.
Материал и методы исследования
В исследовании приняли участие 282 женщины. Критериями включения в группу с ПНБ стали:
отсутствие родов и абортов в анамнезе, наличие двух и более эпизодов прерывания беременности подряд. Критериями включения в группу преэклампсии стали: одноплодная беременность, «чистая» форма преэклампсии (по шкале Goecke в модификации Г.М. Савельевой). Основанием для включения в группу контроля было физиологическое течение беременности, родов и послеродового периода. Критериями исключения для всех групп явились: хромосомная патология плода, антифосфолипидный синдром, резус-конфликт, анатомические аномалии репродуктивных органов; нейроинфекции, черепно-мозговые травмы, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга.
В исследование последовательно включались пациентки славянской национальности, обратившиеся в Клинику акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева в период с 2007 по 2011 г. и в роддом при ГКБ № 29 в период c 2010 по 2011 г., удовлетворяющие критериям включения/исключения и давшие письменное информированное согласие на участие. Каждая из пациенток попадала в одну из следующих групп: пациентки с ПНБ (n=93), пациентки с преэклампсией (n=98) и контрольная группа (93 родильницы).
Выделение ДНК каждой пациентки проводилось сорбентным методом из 5 мл венозной крови. Полиморфные аллели генов еNOS и CYBA определялись методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по стандартным протоколам [10, 21]. Для анализа аллелей T803С гена AGT и i/D гена ACE применялась ПЦР в режиме реального времени с использованием амплификатора ДТ-96 (ООО «ДНК-технология»).
Статистическая обработка данных проводилась при помощи программ Statistica 8.0 и SPSS 14. Для описания возраста в каждой из групп приведены среднее и стандартное отклонение. Гипотеза о равенстве средних в группах проверялась с помощью дисперсионного анализа. Множественные сравнения средних проводились с помощью критерия множественных сравнений Тьюки для неравных групп. Для исследования зависимости признаков в таблицах сопряженности 2×2 применялся двусторонний точный критерий Фишера, в таблицах сопряженности 2×3 – критерий χ2 Пирсона.
Шансом в каждой группе пациенток называлась вероятность наличия исследуемого признака к
вероятности его отсутствия. В работе представлены отношения шансов (ОШ) для группы пациенток с ПНБ и контрольной группы, а также для группы пациенток с преэклампсией и контрольной группы. Для построения 95% доверительных интервалов (ДИ) и точечной оценки ОШ применялась модель бинарной логистической регрессии. Достоверность моделей оценивалась с помощью метода максимального правдоподобия. ОШ является статистически значимым, если 95% ДИ для отношения шансов не включает единицу, поэтому в табл. 1 для выявления статистически значимых различий достаточно было представить только ОШ и его 95% ДИ.
Результаты исследования и обсуждение
Во всех группах пациенток отмечались сходные значения среднего возраста менархе, длительности менструального цикла и продолжительности менструаций. Частота гинекологических заболеваний не различалась.
Женщины с преэклампсией и женщины контрольной группы были сопоставимы по возрасту, в то время как средний возраст женщин с ПНБ был статистически значимо выше, чем в группе с преэклампсией или в контрольной группе (31,18±4,34 года в отличие от 28,28±4,43 года, р=0,00005; и 28,98±4,68 года, р=0,0025 соответственно). Поскольку возраст является фактором риска развития гестационных осложнений, нами были выделены подгруппы всех молодых женщин в возрасте до 29 лет среди пациенток с ПНБ (n=26) и группы контроля (n=50), в которых статистически значимое различие по возрасту отсутствовало.
Частота встречаемости аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов среди женщин с ПНБ, преэклампсией и контрольной группы представлена в табл. 1. Статистически значимые отличия были получены для аллельных вариантов генов AGT, eNOS (полиморфизм 4a/b) и CYBA.
Таблица 1. Распределение частоты аллелей и генотипов полиморфизмов Т803С гена AGT, С242Т гена CYBA, i/D гена АСЕ, 4a/b и Glu298Asp гена eNOS у обследуемых женщин.
Раннее развитие плаценты характеризуется процессами активной клеточной дифференцировки, ангиогенеза и ремоделирования внеклеточного матрикса, значимую роль в которых играет NADH-оксидаза – важный модулятор антиоксидантной защиты плацентарных тканей на ранних сроках беременности [18]. Носительство мутантного аллеля 242Т гена CYBA, кодирующего p22phox субъединицу NADH-оксидазы (полиморфизм С242Т), способствует повышению продукции АФК и развитию ОС [24] и может принимать участие в формировании осложнений беременности.
Немаловажным участником процессов имплантации и плацентации является также оксид азота (NO), который благодаря своим вазодилатирующим свойствам контролирует перфузию тканей трофобласта материнской кровью. NO образуется из L-аргинина под действием трех изоформ фермента NO-синтазы, однако способность сосудов к дилатации зависит в основном от активности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [14], которая частично опосредована полиморфизмом соответствующего гена.
В рамках проблемы ПНБ наиболее активно изучаются полиморфизмы 4a/b и Glu298Asp гена eNOS. Носительство мутантных аллелей 4а и 298Asp ассоциировано со снижением активности фермента и уменьшением концентрации NO в плазме [22, 23]. Пониженное содержание NO приводит к снижению перфузии тканей плаценты и способствует развитию дисфункции эндотелия и ОС. Результаты работ в данной области противоречивы. Одни авторы описывают отсутствие взаимосвязи между ПНБ и носительством полиморфизмов Glu298Asp и 4a/b [21], другие утверждают, что ПНБ ассоциировано с полиморфизмом 4а/b, но не Glu298Asp [8] или, наоборот, с полиморфизмом Glu298Asp, но не 4а/b [20].
Мы обнаружили различия по частоте распределения аллелей и генотипов только для полиморфизма 4а/b, но не Glu298Asp. У женщин с ПНБ достоверно чаще встречалось носительство аллеля 4а гена eNOS, а также гетеро- или гомозиготное носительство аллеля 242Т гена CYBA в отличие от контрольной группы (табл. 1). При оценке распределения генотипов в группах женщин до 29 лет (с ПНБ и в группе контроля) также были выявлены различия по частоте встречаемости мутантных аллелей 4а и 242Т. Кроме того, у женщин с ПНБ достоверно чаще встречалось носительство генотипа 4ab в отличие от контрольной группы (ОШ=2,06, 95% ДИ 1,04–4,09).
Далее была проведена оценка взаимосвязи количества мутантных аллелей генов eNOS (полиморфизм 4a/b) и p22phox (полиморфизм С242Т) с развитием ПНБ. Отсутствие мутантных аллелей а и 242Т (генотип bb/CC) достоверно чаще встречалось у женщин контрольной группы. В то же время гомо- или гетерозиготное носительство одновременно двух мутантных аллелей а и 242Т (генотипы ab/CT, ab/TT, aa/CT, aa/TT) достоверно чаще встречалось у пациенток с ПНБ вне зависимости от возраста (p<0,05), хотя в подгруппе молодых женщин эта взаимосвязь была более выражена (рис. 1).
Рисунок 1. Частота встречаемости мутаций по одному или двум генам (комбинации генотипов NOS 4a/b и CYBA C242T) у женщин с ПНБ и женщин группы сравнения (в скобках указано число пациенток).
При анализе комбинаций генотипов исследуемых полиморфизмов мы обнаружили достоверное отличие в распределении сочетаний у женщин в возрасте до 29 лет с ПНБ и женщин контрольной группы (р=0,029), которое не выявлялось при исследовании без поправки на возраст (рис. 2). Среди женщин в возрасте до 29 лет комбинации с отсутствием аллели 4а гена eNOS вне зависимости от наличия или отсутствия аллели 242Т гена CYBA (генотипы 4bb/CC, 4bb/CТ, 4bb/ТТ) были более благоприятными и встречались в 35 (70%) случаях из 50 в контрольной группе и только в 11 (42,3%) случаях из 26 у женщин с ПНБ (рис. 2А). В случае гетерозиготного носительства аллеля 4а (генотипы 4ab/CC, 4ab/CТ, 4ab/TT) исход беременности зависел от наличия или отсутствия мутантного 242Т аллеля: ПНБ чаще отмечалось у женщин с гомозиготным носительством 242Т аллеля (генотип 4ab/TT) – у 11,54% (3 из 26) в отличие от 2,0% (1 из 50) в контрольной группе (рис. 2Б).
Рисунок 2. Распределение сочетания диплотипов NOS 4a/b и CYBA C242T среди женщин с ПНБ (n=26) и в группе контроля (n=50) в возрасте 29 лет.
Гомозиготное носительство аллеля 4а (генотипы 4aa/CC, 4aa/CT, 4aa/TT) являлось неблагоприятным прогностическим фактором развития ПНБ и встречалось у 19,2% (5 из 26) женщин с ПНБ, в отличие от 6% (3 из 50) контрольной группы. Оценить вклад мутантного аллеля 242Т в развитие ПНБ было затруднительно ввиду небольшого числа таких комбинаций, однако сочетания генотипов аа/СТ или аа/ТТ встречались у 11,54% женщин с ПНБ (3 из 26) и только у 5% контрольной группы (2 из 50) (рис. 2В).
На основании полученных данных можно предположить, что ОС и эндотелиальная дисфункция являются одними из факторов, способствующих нарушению имплантации и плацентации и, как следствие, развитию ПНБ. На это указывает то, что ПНБ чаще обнаруживалось
нами среди носительниц полиморфных аллелей одновременно по двум генам – eNOS (отвечающим за развитие дисфункции эндотелия) и CYBA (опосредующим синтез АФК), в отличие от носительниц полиморфного аллеля только по одному из указанных генов. При этом наибольший вклад в развитие ПНБ принадлежит именно ОС, ассоциированному с эндотелиальной дисфункцией. Это подтверждается тем, что в отсутствие аллеля 4а носительство аллеля 242Т не оказывает существенного влияния на исход беременности. В то же время на фоне гетеро- или гомозиготного носительства аллеля 4а наличие 242Т-аллеля является дополнительным фактором развития ПНБ. Данная ассоциация выявлялась только у женщин до 29 лет, тем самым подчеркивая, что с возрастом значение этих патогенетических механизмов утрачивается.
Важную роль в процессах имплантации и инвазии трофобласта играют белки ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [1]. Во время беременности отмечается локальный синтез компонентов РААС, в том числе Ang II, в тканях децидуа и ворсинах хориона [6]. Низкая концентрация Ang II в маточно-плацентарной области способствует расширению спиральных артерий и является необходимым условием для децидуализации, перестройки спиральных артерий и становления маточно-плацентарного кровотока [6, 16].
Носительство аллеля 325Т гена AGT (соответствует варианту 803С) приводит к повышению экспрессии AGT (а значит и концентрации Ang II) в гладкомышечных клетках спиральных артерий [15] и ассоциировано с развитием преэклампсии [13]. Хотя в более поздних работах взаимосвязь гестоза и носительства аллеля 803С не подтверждается [5, 11].
Нами была выявлена достоверно меньшая частота встречаемости мутантного генотипа 803СС гена AGT у женщин с преэклампсией в отличие от группы контроля, что свидетельствует о его протективном действии. Среди женщин с преэклампсией чаще, чем в группе контроля встречался и мутантный генотип DD гена АСЕ (табл. 1). Учитывая однонаправленность действия AGT и АСЕ (повышение АД) мы попытались оценить сочетанное влияние этих полиморфизмов. Анализ количества мутантных аллелей генов AGT и АСЕ не выявил ассоциации между их числом и развитием преэклампсии (р=0,598). Различия по частоте распределения аллельных комбинаций этих генов среди женщин с преэклампсией и в контрольной группе также отсутствовали (р=0,359).
Мы выделили «благоприятные» и «неблагоприятные» комбинации полиморфизмов генов АСЕ и AGT. К благоприятным были отнесены сочетания генотипов с гомозиготным носительством протективного аллеля 803С или наличием аллели 803Т при отсутствии негативной D-аллеля: ii/ТT, ii/ТС, ii/СС, iD/СС, DD/СС. Неблагоприятные комбинации включали в себя наличие D-аллеля и гетерозиготное носительство 803С аллеля: iD/ТT, iD/ТС, DD/ТТ, DD/ТС. Носительство «благоприятных» комбинаций отмечалось значительно реже, а «неблагоприятных» – значительно чаще среди женщин с гестозом, чем в контрольной группе (р=0,019) (табл. 2), тем самым подчеркивая протективную роль аллеля 803С гена AGT и негативную роль аллеля D гена АСЕ в отношении развития преэклампсии.
Таблица 2. Распределение «благоприятных» и «неблагоприятных» комбинаций генотипов i/D гена ACE
и Т803С гена AGT Комбинации генотипов ACE i/D и AGT Т803С.
Полученные нами данные о протективной роли мутантной аллели 803С в отношении развития преэклампсии расходятся с данными мировой литературы. Однако известно, что при преэклампсии отмечается значительное снижение концентрации ренина, AGT и Ang II [12] на фоне увеличения числа рецепторов к Ang II, обладающих повышенной связывающей способностью [9]. Возможно, нарушению ремоделирования спиральных артерий способствует не столько увеличение локальной концентрации Ang II, сколько повышенная чувствительность его рецепторов (AT R). На это указывает выявленная нами более высокая частота встречаемости аллеля D гена АСЕ (носительство которого связывают с повышением чувствительности AT R к Ang II) у женщин с преэклампсией по сравнению с группой контроля. Кроме того, в последнее время преэклампсия рассматривает
ся с позиций аутоиммунного заболевания, при котором вырабатываются аутоантитела к AT R (АА-AT R). Связываясь с этими рецепторами, АА-AT R не только опосредуют эффекты Ang II, но и оказывают прокоагулянтное и провоспалительное действия, способствуя развитию дисфункции эндотелия [17, 25]. Возможно, повышенная локальная концентрация AGT, а значит и Ang II, отмечаемая у носительниц мутантного 803С аллеля, приводит к уменьшению связывания АА-AT R с AT R, тем самым нивелируя их негативный эффект.
Дополнительное участие в повышении АД принимают гены, отвечающие за формирование ОС, и в частности, CYBA. По нашим данным, мутантный генотип ТТ гена CYBA у женщин с преэклампсией встречался гораздо чаще, чем в контрольной группе (табл. 1). Однако различий по частоте распределения аллельных комбинаций 242Т гена CYBA и D гена АСЕ среди женщин с преэклампсией и в контрольной группе не было (р=0,708). Взаимосвязь между количеством мутантных аллелей и развитием преэклампсии также отсутствовала (p=0,104). Тем не менее одновременное носительство двух мутантных аллелей являлось неблагоприятным прогностическим признаком развития преэклампсии средней и тяжелой степеней (р=0,043) (табл. 3).
Таблица 3. Частота встречаемости мутаций по одному/двум генам (комбинации генотипов ACE i/D
и CYBA C242T) среди женщин с преэклампсией средней и тяжелой степеней и женщин контрольной
группы
На основании полученных результатов можно предположить, что ОС утрачивает ведущую роль в развитии преэклампсии, в отличие от ПНБ, однако вносит вклад в формирование степени тяжести заболевания.
Заключение
В случае выраженных нарушений процессов имплантации и плацентации, ассоциированных в первую очередь с развитием генерализованного ОС, происходит потеря беременности. Это подтверждается нашими результатами о том, что носительство вариантных аллелей генов eNOS и CYBA (которые отвечают за самые ранние этапы имплантации эмбриона, а на системном уровне регулируют тонус сосудов и функцию эндотелия) ассоциировано с развитием ПНБ. Если же повреждения оказываются не столь критичными, развивается преэклампсия. При этом ведущая патогенетическая роль ОС утрачивается, а ключевое значение приобретают факторы, участвующие в ремоделировании спиральных артерий (AGT, AT R), на системном уровне регулирующие АД.
Таким образом, существенный вклад в развитие гестационных осложнений принадлежит системным нарушениям в организме матери, связанным с регуляцией АД, сосудистого тонуса и функционального состояния эндотелия и во многом ассоциированным с полиморфизмом соответствующих генов. Поэтому в рамках предгравидарной подготовки целесообразна всесторонняя оценка генотипа пациентки, которая должна дополнительно включать в себя гены AGT, АСЕ, CYBA и eNOS.
Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14 февраля 2011 г. с Министерством образования и науки РФ по теме: «Разработка метода дифференцированного выявления генетических маркеров аллельных вариаций генов материнской и фетальной ДНК, ведущих к нарушению роста и развития плода, в крови матери».
