Прогностическая значимость определения внеклеточной фетальной ДНК в плазме крови при задержке роста плода

Кан Н.Е., Тютюнник В.Л., Хачатрян З.В., Садекова А.А., Красный А.М.

1) ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; 2) Перинатальный центр Европейского Медицинского Центра, Москва, Россия
Цель. Изучить взаимосвязь изменения уровня внеклеточной фетальной ДНК (вфДНК) с морфологическими особенностями плаценты при задержке роста плода (ЗРП) с определением ее прогностической значимости. Материалы и методы. Обследованы 93 беременные. Основную группу (I) составили 48 беременных с ЗРП (23 – с ранней и 25 – поздней формой), а группу II (сравнения) – 45 пациенток, у которых беременность протекала без осложнений. Изучены клинико-анамнестические данные, особенности течения беременностей и родоразрешения, а также состояние плодов и новорожденных. Специальные методы исследования включали полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с целью определения вфДНК в плазме материнской крови, гистохимическое исследование c применением метода терминального дезоксиуридинового мечения концов (TUNEL) и иммунофлуоресцентный анализ для исследования плацент. Результаты. Уровень вфДНК при ранней форме ЗРП составил 89,03 (44,52;178,32) ГЕ/мл и был статистически значимо ниже показателей при поздней форме ЗРП – 244,14 (145,23;422,47) ГЕ/мл и группы сравнения – 211,05 (133,64;567,81) ГЕ/мл (p<0,001). При проведении ROC-анализа установлено, что измерение концентрации вфДНК в плазме материнской крови при ее пороговом значении 119,11 ГЕ/мл позволяет с высокой чувствительностью (73,1%) и специфичностью (79,3%) (AUC=0,81; 95% ДИ 0,63–0,98) диагностировать раннюю форму ЗРП и предсказывать вероятность развития осложнений у новорожденных. Обнаруженные особенности архитектоники плаценты в виде преобладания процессов фиброза и формирования обширных зон фибриноида, с одной стороны, объясняют снижение уровня вфДНК, с другой – обосновывают развитие плацентарной перфузии и, как следствие, – формирование ЗРП. Подтверждена взаимосвязь между низким уровнем вфДНК и риском рождения детей с задержкой роста. Также установлено наличие сильной прямой корреляционной связи между уровнем вфДНК, массой (r=0,72; p<0,001) и длиной (r=0,71; p<0,001) новорожденных в случаях ранней формы ЗРП. Заключение. Установлены диагностически значимые уровни вфДНК, позволяющие верифицировать формы ЗРП и свидетельствующие о различных механизмах их формирования. Определение вфДНК позволяет прогнозировать риск рождения детей с низкими массо-ростовыми показателями. Полученные данные о высокой диагностической значимости вфДНК в отношении ранней формы ЗРП обосновывают перспективность применения вфДНК в качестве прогностического маркера.

Ключевые слова

задержка роста плода
внеклеточная фетальная ДНК
плазма крови
плацента
TUNEL

В настоящее время задержка роста плода (ЗРП) остается одной из актуальных проблем современного акушерства, а ее частота не имеет тенденции к снижению, составляя 5–18% [1–3]. Несмотря на вариацию частоты ЗРП среди различных популяций, согласно эпидемиологическим исследованиям, она ассоциирована с неизменно высокой перинатальной заболеваемостью и смертностью. Вместе с тем отсутствие единой системы прогностических и диагностических критериев ЗРП приводит к недостаточной эффективности ее антенатального выявления [4–6].

В последние годы перспективным неинвазивным маркером для прогнозирования и своевременной диагностики различных осложнений беременности является изучение внеклеточной фетальной ДНК (вфДНК), выделение которой в материнский кровоток происходит преимущественно за счет процессов дифференцировки трофобласта [7–9]. Особое значение отводится определению данного маркера при ЗРП, так как последняя относится к плацента-ассоциированным осложнениям беременности [10, 11]. Концепция о плацентарном происхождении вфДНК является общепринятой и находит подтверждение во многих исследованиях [12–15]. К основным механизмам ее происхождения в настоящее время относят, помимо апоптоза, сопровождающего нормальное развитие плаценты, высвобождение вфДНК в материнский кровоток за счет процессов некроза и апонекроза клеток, прямого переноса ДНК через плаценту или амниотические оболочки [16, 17]. Среди причин изменения ее содержания указывают как усиление процессов высвобождения нуклеиновых кислот в материнский кровоток, так и снижение их клиренса. Проведенные исследования по изучению вфДНК при ЗРП неоднозначны и часто противоречивы.

Так, D. Morano et al. [18] установили различия в содержании вфДНК при ранней и поздней формах ЗРП и получили взаимосвязь низких концентраций вфДНК с малой массой плаценты и плацентарной недостаточностью. Вместе с тем до настоящего времени открытым остается вопрос о причинах изменения содержания вфДНК при данном осложнении беременности.

Таким образом, интерес представляет определение прогностической и диагностической значимости вфДНК при ЗРП с изучением взаимосвязи с морфологическими особенностями плаценты, что позволит не только уточнить механизмы развития данного осложнения беременности, но и выделить новый неинвазивный маркер.

Цель исследования: изучить взаимосвязь изменения уровня вфДНК с морфологическими особенностями плаценты при ЗРП с определением ее прогностической значимости.

Материалы и методы

Согласно критериям включения и невключения, в исследование вошли 93 беременные. Из них основную группу (I) составили 48 беременных с ЗРП (23 – с ранней и 25 – с поздней формой), а группу II (сравнения) – 45 пациенток, у которых беременность протекала без осложнений.

Критериями включения в исследование для обеих групп являлись возраст пациенток от 18 до 45 лет, одноплодная беременность в сроке 22–40 недель, наличие добровольного информированного согласия, одобренного этическим комитетом. Для основной группы – беременность, осложнившаяся ЗРП. Критерии исключения: тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, наступившая после донации ооцита, пороки развития плода, генетические заболевания матери и плода, острая фаза или обострение хронических инфекционных заболеваний у матери, миома матки больших размеров.

Всем пациенткам, включенным в исследование, был выполнен стандартный набор обследования согласно приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01 ноября 2012 г. № 572н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю “акушерство и гинекология” (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)». Были изучены клинико-анамнестические данные, особенности течения беременностей и родоразрешения, а также состояние плодов и новорожденных.

Специальные методы исследования включали полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с целью определения вфДНК в плазме материнской крови, гистохимическое исследование c применением метода терминального дезоксиуридинового мечения концов (TUNEL) и иммунофлуоресцентный анализ для исследования плацент.

Статистический анализ

Для статистического анализа и построения графиков использовались пакеты статистических программ Statistica 10 и OriginPro 8.5 (США). Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовался критерий Шапиро–Уилка, для проверки равенства дисперсий – критерий Левина. При несоблюдении условий нормального распределения статистический анализ проводился с помощью непараметрических критериев Манна–Уитни и коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с помощью точного критерия Фишера. Для оценки диагностической эффективности исследуемого метода использовался ROC-анализ. Данные ROC-анализа представлены в виде площади под кривой с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения p<0,05.

Результаты и обсуждение

Все беременные, вошедшие в исследование, были сопоставимы по основным клинико-анамнестическим показателям. Средний возраст составил 34 (29;35) и 32 (29;34) года соответственно по группам. Статистически значимых различий в структуре соматических и гинекологических заболеваний выявлено не было. Следует отметить более высокую частоту угрозы прерывания беременности и маловодия при ЗРП.

62-1.jpg (40 KB)Учитывая данные о том, что уровень вфДНК увеличивается со сроком беременности, пациентки были включены в исследование по методу подбора пар с учетом гестационного срока. Таким образом, медиана сроков в исследуемых группах была сопоставима, что позволило в дальнейшем оценить полученные результаты.

Концентрация вфДНК в зависимости от срока беременности при ранней и поздней формах ЗРП, а также в группе сравнения представлена на ри­сунке 1.

Уровень вфДНК при ранней форме ЗРП составил 89,03 (44,52;178,32) ГЕ/мл и был статистически значимо ниже показателей при поздней форме ЗРП – 244,14 (145,23;422,47) ГЕ/мл и группы сравнения – 211,05 (133,64;567,81) ГЕ/мл (p<0,001). При этом статически значимых различий между поздней формой ЗРП и группой сравнения получено не было (p>0,05). Результаты исследования представлены на рисунке 2.

Принимая во внимание данные литературы о взаимосвязи между уровнем вфДНК и массой плаценты, а также полученные результаты, указывающие на статистически значимое снижение уровня вфДНК только при ранней форме ЗРП, следующим этапом исследования было определение взаимосвязи между уровнем вфДНК и клиническими критериями с использованием непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену. В качестве порога значимости использовали значение p-value <0,05 (таблица).

63-1.jpg (168 KB)

Масса плацент в группе ранней формы ЗРП составила 248 (228;307) г, что было статистически значимо ниже данного показателя в группе поздней формы ЗРП – 335 г (305;380; p<0,05) и в группе сравнения – 432 г (340;471; p<0,001). Анализ установил прямую сильную корреляционную связь между уровнем вфДНК, массой плаценты (r=0,79; p<0,001), массой (r=0,72; p<0,001) и длиной (r=0,71; p<0,001) новорожденного в группе ранней формы ЗРП.

Особый интерес представлял анализ взаимосвязи с перинатальными исходами. Сильная обратная корреляционная связь была получена с врожденной пневмонией (r=-0,73; p=0,03), внутрижелудочковыми кровоизлияниями (r=-0,74; p=0,03), некротизирующим энтероколитом (r=-0,72; p=0,03) и асфиксией тяжелой степени (r=-0,75; p=0,03).

С целью оценки диагностической эффективности количественного определения вфДНК для ранней формы ЗРП был проведен ROC-анализ, который продемонстрировал, что измерение концентрации вфДНК в плазме материнской крови при пороговом значении вфДНК 119,11 ГЕ/мл позволяет с высокой чувствительностью (73,1%) и специфичностью (79,3%) (AUC=0,81; 95% ДИ 0,63–0,98) диагностировать раннюю форму ЗРП и предсказывать вероятность развития таких осложнений раннего неонатального периода, как врожденная пневмония, внутрижелудочковые кровоизлияния, некротизирующий энтероколит и асфиксия тяжелой степени у новорожденных с ранней формой ЗРП (рис. 3).

64-1.jpg (278 KB)

Для расширения представления о механизмах, лежащих в основе полученных изменений, следующим этапом исследования явился иммунофлуоресцентный анализ плацент при ранней и поздней формах ЗРП (рис. 4). При ранней форме ЗРП было выявлено отсутствие нормальной архитектоники. Отмечались тесно расположенные по отношению друг к другу промежуточные незрелые ворсины и промежуточные зрелые ворсины с доминированием стромального компонента и гипоплазией капилляров. Избыточное отложение перивиллезного фибриноида, по-видимому, приводило к формированию афункциональных зон и уменьшению объема межворсинчатого пространства. Также обнаружены хаотичные склерозированные ворсины с увеличенным количеством стромальных клеток и единичными микрососудами. Описанные изменения гипоплазии дистальных отделов ворсин ассоциированы с неполной гестационной трансформацией спиральных артерий и являются проявлением материнской мальперфузии (рис. 4А). Исследование плацент при поздней форме ЗРП показало сохранение дифференцировки ворсин. В зрелых ворсинах были выражены компенсаторно-приспособительные реакции. Повышение активности синцитиотрофобласта приводило к образованию крупных синцитиальных узлов, которые располагались на ножке и состояли из плотно расположенных ядер синцитиотрофобласта, а также к увеличению объема капилляров. При этом были зафиксированы небольшие фокусы фибриноида, которые не приводили к снижению интервиллезного объема. Было отмечено небольшое количество промежуточных незрелых, промежуточных зрелых и хаотичных склерозированных ворсин (рис. 4Б). Плаценты в группе контроля характеризовались преобладанием терминальных и зрелых промежуточных ворсин, а также свободных от инкрустирующих депозитов фибриноида. Было отмечено, что доля терминального ворсинчатого эндотелия превосходила стромальный компонент (рис. 4В).

Полученные результаты указывают на наличие прямой корреляционной связи между уровнем вфДНК с массой плацент и послужили одним из косвенных подтверждений плацентарного происхождения вфДНК, что перекликается с рядом исследователей. Кроме того, обнаруженные при проведении иммунофлюоресцентного анализа особенности архитектоники плаценты в виде преобладания процессов фиброза и формирования обширных зон фибриноида, с одной стороны, объясняют снижение вфДНК, с другой – обосновывают развитие плацентарной перфузии и, как следствие, – формирование ЗРП.

В настоящее время оценка прогностической и диагностической ценности вфДНК как одной из наиболее изученных неинвазивных биомолекул остается важной задачей современного акушерства, что во многом связано с изменением уровня данного маркера до клинической манифестации различных осложнений беременности.

Заключение

Таким образом, результаты проведенного исследования установили диагностически значимые уровни вфДНК, позволяющие верифицировать формы ЗРП и свидетельствующие о различных механизмах их формирования. Определение вфДНК позволяет прогнозировать риск рождения детей с низкими массо-ростовыми показателями. Полученные данные о высокой диагностической значимости вфДНК в отношении ранней формы ЗРП обосновывают перспективность применения вфДНК в качестве важного прогностического маркера.

Список литературы

  1. Железова М.Е., Зефирова Т.А., Канюков С.С. Задержка роста плода: современные подходы к диагностике и ведению беременности. Практическая медицина. 2019; 17(4): 8-14.
  2. Ярыгина Т.А., Батаева Р.С. Задержка (замедление) роста плода: современные принципы диагностики, классификации и динамического наблюдения. Ультразвуковая и функциональная диагностика. 2019; 2: 33-44.
  3. Gordijn S.J., Beune I.M., Thilaganathan B., Papageorghiou A., Bas-chat A.A., Baker P.N. et al. Consensus definition of fetal growth restriction: a Del-phi procedure. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2016; 48(3): 333-9. https://dx.doi.org/10.1002/uog.15884.
  4. Стрижаков А.Н., Мирющенко М.И., Игнатко И.В., Попова Н.Г., Флорова В.С., Кузнецов А.С. Прогнозирование синдрома задержки роста плода у беременных высокого риска. Акушерство и гинекология. 2017; 7: 34-44.
  5. Figueras F., Gratacos E. Update on the diagnosis and classification of fetal growth restriction and proposal of a stage-based management protocol. Fetal Diagn. Ther. 2014; 36(2): 86-98. https://dx.doi.org/10.1159/000357592.
  6. Rizzo G., Mappa I., Rizzo G., D'Antonio F. International gestational age-specific centiles for umbilical artery Doppler indices: a longitudinal prospec-tive cohort study of the INTERGROWTH-21st Project. Am. J. Obstet. Gynecol. 2020; 224(2): 248-9. https://dx.doi.org/10.1016/j.ajog.2020.08.110.
  7. Barker D.J. Adult consequences of fetal growth restriction. Clin. Ob-stet. Gynecol. 2006; 49(2): 270-83. https://dx.doi.org/10.1097/00003081-200606000-00009.
  8. Savchev S., Figueras F., Sanz-Cortes M., Cruz-Lemini M., Triunfo S., Botet F., Gratacos E. Evaluation of an optimal gestational age cut-off for the defi-nition of early-and late-onset fetal growth restriction. Fetal Diagn. Ther. 2014; 36(2): 99-105. https://dx.doi.org/10.1159/000355525.
  9. Красный А.М., Кан Н.Е., Тютюнник В.Л., Садекова А.А., Сарибекова А.Г., Кокоева Д.Н., Салпагарова З.Х., Меджидова М.К., Вторушина В.В., Кречетова Л.В. Прогнозирование преждевременных родов путем комбинированного определения цитокинов и внеклеточной ДНК. Акушерство и гинекология. 2019; 1: 86-91.
  10. Breveglieri G., D'Aversa E., Finotti A., Borgatti M. Non-invasive prenatal testing using fetal DNA. Mol. Diagn. Ther. 2019; 23(2): 291-9. https://dx.doi.org/10.1007/s40291-019-00385-2.
  11. Kwak D.W., Kim S.Y., Kim H.J., Lim J.H., Kim Y.H., Ryu H.M. Maternal total cell-free DNA in preeclampsia with and without intrauterine growth restriction. Sci. Rep. 2020; 10(1): 11848. https://dx.doi.org/10.1038/s41598-020-68842-1.
  12. Wertaschnigg D., Lucovnik M., Klieser E., Huber-Katamay J., Moertl M.G. Increased cell-free fetal DNA fraction in the first trimester: A sign of abnormally invasive placenta? Ultraschall Med. 2020; 41(5): 560-1. https://dx.doi.org/10.1055/a-0770-5209.
  13. Alberry M.S., Maddocks D.G., Hadi M.A., Metawi H., Hunt L.P., Ab-del-Fattah S.A. et al. Quantification of cell free fetal DNA in maternal plasma in normal pregnancies and in pregnancies with placental dysfunction. Am. J. Obstet. Gynecol. 2009; 200(1): 98.e1-6. https://dx.doi.org/10.1016/j.ajog.2008.07.063.
  14. Illanes S., Parra M., Serra R., Pino K., Figueroa-Diesel H., Romero C. et al. Increased free fetal DNA levels in early pregnancy plasma of women who subsequently develop preeclampsia and intrauterine growth restriction. Prenat. Di-agn. 2009; 29(12): 1118-22. https://dx.doi.org/10.1002/pd.2372.
  15. Cebe F.S., Nur Tola E.N., Koşar P.A., Oral B. DNA methylation profiles of genes associated with angiogenesis in the samples of placenta in pregnancies complicated by intrauterine growth restriction. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2019 Oct 3: 1-9. https://dx.doi.org/10.1080/14767058.2019.1671344.
  16. Al Nakib M., Desbrière R., Bonello N., Bretelle F., Boubli L., Gabert J., Levy-Mozziconacci A. Total and fetal cell-free DNA analysis in maternal blood as markers of placental insufficiency in intrauterine growth restriction. Fetal Diagn. Ther. 2009; 26(1): 24-8. https://dx.doi.org/10.1159/000236355.
  17. Rafaeli-Yehudai T., Imterat M., Douvdevani A., Tirosh D., Benshalom-Tirosh N., Mastrolia S.A. et al. Maternal total cell-free DNA in preeclampsia and fetal growth restriction: Evidence of differences in maternal response to abnormal implantation. PLoS One. 2018; 13(7): e0200360. https://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0200360.
  18. Morano D., Rossi S., Lapucci C., Pittalis M.C., Farina A. Cell-free DNA (cfDNA) fetal fraction in early- and late-onset fetal growth restriction. Mol. Diagn. Ther. 2018; 22(5): 613-9. https://dx.doi.org/10.1007/s40291-018-0353-9.

Поступила 17.02.2021

Принята в печать 10.06.2021

Об авторах / Для корреспонденции

Кан Наталья Енкыновна, профессор, д.м.н., заместитель директора по научной работе, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(926)220-86-55. E-mail: kan-med@mail.ru. Researcher ID: B-2370-2015,
SPIN-код: 5378-8437, Authors ID: 624900, Scopus Author ID: 57008835600, ORCID ID: 0000-0001-5087-5946. 117997, Россия, Москва ул. Академика Опарина, д. 4.
Тютюнник Виктор Леонидович, профессор, д.м.н., в.н.с. центра научных и клинических исследований департамента организации научный деятельности, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России; главный врач, Перинатальный Центр Европейского Медицинского Центра. Тел.: +7(903)969-50-41. E-mail: tioutiounnik@mail.ru. Researcher ID: B-2364-2015, SPIN-код: 1963-1359, Authors ID: 213217, Scopus Author ID: 56190621500, ORCID ID: 0000-0002-5830-5099.
117997, Россия, Москва ул. Академика Опарина, д. 4; 125040, Россия, Москва ул. Правды, дом 15, стр. 1.
Хачатрян Зарине Варужановна, аспирант, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика
В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(909)656-24-56. E-mail: z.v.khachatryan@gmail.com. 117997, Россия, Москва ул. Академика Опарина, д. 4.
Садекова Алсу Амировна, к.б.н., с.н.с. лаборатории цитологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(495)438-22-72. E-mail: a_sadekova@oparina4.ru. 117997, Россия, Москва ул. Академика Опарина, д. 4.
Красный Алексей Михайлович, к.б.н., заведующий лабораторией цитологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(495)438-22-72. E-mail: alexred@list.ru. 117997, Россия, Москва ул. Академика Опарина, д. 4.

Для цитирования: Кан Н.Е., Тютюнник В.Л., Хачатрян З.В., Садекова А.А., Красный А.М. Прогностическая значимость определения внеклеточной фетальной ДНК в плазме крови при задержке роста плода.
Акушерство и гинекология. 2021; 6: 60-65
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2021.6.60-65

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.